彭 波,邱 靜,彭 娟,何璐璐,孔冬艷,孫曉宇,劉 巖,阿新祥,靳可心,孫艷芳,龐瑞華,周 偉,趙金會(huì),汪全秀

(1. 信陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院,河南 信陽(yáng) 464000;2. 信陽(yáng)市植保植檢站,河南 信陽(yáng) 464000;3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/農(nóng)業(yè)部云南稻種資源觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,昆明 650223)

【研究意義】水稻是世界上最重要的糧食作物之一,全球有超過(guò)一半的人口且我國(guó)有近2/3的人口以稻米為主食[1-2]。稻米蛋白質(zhì)是優(yōu)質(zhì)蛋白,是人類能量及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要來(lái)源,改良稻米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)對(duì)于改善人類自身的營(yíng)養(yǎng)與健康具有重要作用。前期,Peng等[3]采用圖位克隆策略,已分離克隆到一個(gè)正調(diào)控水稻種子蛋白質(zhì)含量的功能基因qPC1(又稱OsAAP6基因),且發(fā)現(xiàn)qPC1基因的功能性自然遺傳變異位點(diǎn)集中在其啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件,但尚不清楚其功能性變異位點(diǎn)及其分子調(diào)控機(jī)制。進(jìn)一步進(jìn)行大田試驗(yàn),其結(jié)果表明在一定范圍內(nèi),增加田間氮肥濃度,qPC1基因有利于提高水稻籽粒中的氨基酸含量與蛋白質(zhì)含量,進(jìn)而改善稻米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[4]。因此,針對(duì)水稻重要品質(zhì)性狀qPC1基因,鑒定其功能性變異位點(diǎn),開(kāi)發(fā)qPC1分子標(biāo)記,并探討其轉(zhuǎn)運(yùn)功能,為深入揭示qPC1分子調(diào)控機(jī)制,進(jìn)而利用qPC1基因開(kāi)展優(yōu)質(zhì)水稻新品種的分子設(shè)計(jì)育種具有重要的理論意義與潛在的育種價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】過(guò)去幾十年,稻米品質(zhì)方面的理論研究取得了重要進(jìn)展,主要圍繞其遺傳基礎(chǔ)與分子調(diào)控機(jī)理、稻米品質(zhì)的影響因素與分子改良、基因的分離克隆與功能解析等方面[5-10]。相對(duì)于水稻產(chǎn)量不斷提高,優(yōu)質(zhì)稻米遺傳改良的育種實(shí)踐相對(duì)進(jìn)展緩慢。這是因?yàn)榈久灼焚|(zhì)性狀是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀,同時(shí)受多個(gè)基因與環(huán)境因素的共同影響[2,11-13]。因此,培育優(yōu)質(zhì)水稻新品種是目前國(guó)內(nèi)外育種學(xué)家共同追求的重要目標(biāo)之一。水稻qPC1基因?qū)儆诎被徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族中的一員,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類能夠介導(dǎo)氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白,在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要功能[14-16]。目前,針對(duì)擬南芥中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究較多,其中研究最深入的是氨基酸透性酶(Amino acid permease, AAP)家族和類似賴氨酸和組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Lysine-histidine-like transporters, LHTs)家族,這些家族成員參與了擬南芥體內(nèi)多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[17-18]。在水稻中,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族有85個(gè)成員,分布于水稻的12條染色體上[19]。其中,氨基酸通透酶參與調(diào)控水稻的產(chǎn)量及其品質(zhì)等多種生物學(xué)性狀。如OsAAP1、OsAAP3、OsAAP4和OsAAP5與水稻產(chǎn)量性狀密切相關(guān)[21-23]。qPC1(OsAAP6)可影響水稻中多種氨基酸的分布,是水稻種子蛋白質(zhì)含量和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的正向調(diào)節(jié)因子[3-4]。OsAAP7和OsAAP10在水稻中均參與氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn),且在OsAAP10突變體中直鏈淀粉含量與食味值顯著下降[24-25]。OsAAP14和OsAAP15參與調(diào)控水稻產(chǎn)量,且OsAAP15能夠提高極端氮濃度下水稻的產(chǎn)量,可能在水稻育種中具有重要的應(yīng)用前景[26-27]。水稻OsAAP16在根、葉、花和種子中高表達(dá),并參與轉(zhuǎn)運(yùn)多種氨基酸[24]。因此,OsAAPs參與了水稻根系中氨基酸的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn),并參與調(diào)節(jié)水稻的產(chǎn)量與品質(zhì)。【本研究切入點(diǎn)】前期,Peng等[3]通過(guò)qPC1基因啟動(dòng)子一系列5’端缺失DNA片段與GUS基因融合表達(dá)分析,并對(duì)qPC1基因5’-UTRs和啟動(dòng)子區(qū)域(～1.8 kb)進(jìn)行比較測(cè)序,結(jié)合197份來(lái)自廣泛地理范圍的水稻種質(zhì)資源材料中的種子蛋白質(zhì)含量測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)qPC1基因5’-UTR的3個(gè)潛在順式元件所在的兩處變異位點(diǎn)(-7～-12 bp、-32 bp)似乎與水稻種子蛋白含量緊密相關(guān)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用基因定點(diǎn)突變、水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告法鑒定qPC1基因啟動(dòng)子功能性變異位點(diǎn),并利用缺陷型酵母互補(bǔ)試驗(yàn)與水稻根部氨基酸吸收試驗(yàn)解析qPC1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能,以期為水稻新品種的分子設(shè)計(jì)育種提供新的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

缺陷型酵母互補(bǔ)試驗(yàn)使用酵母菌株24433c和22Δ8AA(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李學(xué)賢教授課題組惠贈(zèng)),以及酵母載體pDR195。TA克隆載體pMD18-T和EscherichiacoliDH5α購(gòu)自Solarbio公司;本研究前期已獲得水稻qPC1超量表達(dá)陽(yáng)性[OX(+)]和對(duì)照[OX(-)]材料,qPC1抑制表達(dá)陽(yáng)性[RNAi(+)]和對(duì)照[RNAi(-)]試驗(yàn)材料,以及珍汕97與南洋占重組自交系群體[3, 28]。其中,珍汕97為秈稻品種(OryzasativaL. ssp.indica),南洋占為粳稻品種(OryzasativaL. ssp.japonica)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建 根據(jù)載體pGreenII 0800-LUC多克隆位點(diǎn)特征(SmaI-BamH I-SpeI-XbaI-NotI-SacII),結(jié)合qPC1基因啟動(dòng)子定點(diǎn)突變序列特征(表1),選擇BamH I和NotI兩個(gè)酶切位點(diǎn)分別加到qPC1啟動(dòng)子5’引物端和3’引物端。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)并檢測(cè)引物(表2)。分別以珍汕97和南洋占幼嫩水稻葉片為材料,采用PCR法擴(kuò)增目的序列以及定點(diǎn)突變序列,并分別連接到pGreenII 0800-LUC載體。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中,擴(kuò)繁并提取質(zhì)粒pGreenII 0800-LUC-1、pGreenII 0800-LUC-2、pGreenII 0800-LUC-3、pGreenII 0800-LUC-4,即得到最終雙熒光素酶報(bào)告載體。

表1 qPC1基因定點(diǎn)突變序列

表2 qPC1基因定點(diǎn)突變引物

1.2.2 水稻原生質(zhì)體的分離及轉(zhuǎn)化 取出20～30棵遮光條件下生長(zhǎng)9～12 d的中花11水稻幼苗,切除根部后,將水稻幼莖切成0.5 mm長(zhǎng)后迅速置于0.6 mol/L甘露醇中平衡10 min后提取其原生質(zhì)體。分別吸取10 μL質(zhì)粒(pGreenII 0800-LUC-1、pGreenII 0800-LUC-2、pGreenII 0800-LUC-3、pGreenII 0800-LUC-4)加至無(wú)菌的1.5 mL離心管中,然后緩慢輕柔加入100 μL原生質(zhì)體懸浮液,輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。緩慢沿著離心管壁加入110 μL PEG-CaCl2溶液,將4種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入中花11原生質(zhì)體內(nèi),室溫避光培養(yǎng)12～16 h。

1.2.3qPC1基因啟動(dòng)子活性檢測(cè) 根據(jù)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒E1910(Premega公司)說(shuō)明書,將原生質(zhì)體離心,然后每管加入100 μL 1×PLB后劇烈震蕩、破碎細(xì)胞。螢火蟲(chóng)熒光測(cè)定:12 000 r/min,離心5 min,取10 μL上清液置于預(yù)處理過(guò)的96孔白色酶標(biāo)板中,每孔細(xì)胞加入LAR II 50 μL,吹打混勻。將96孔白色酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中測(cè)定熒光,保存數(shù)據(jù)并導(dǎo)出。海腎熒光的測(cè)定:移出酶標(biāo)板,向每孔細(xì)胞中加入Stop &Glo?Reagent 50 μL,吹打混勻。將96孔白色酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中測(cè)定熒光,保存數(shù)據(jù)并導(dǎo)出。試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照,空載體對(duì)照,生物學(xué)重復(fù)3次,技術(shù)重復(fù)4次。數(shù)據(jù)處理:每個(gè)孔的熒光值(相對(duì)活性)=螢火蟲(chóng)熒光值/海腎熒光值。根據(jù)檢測(cè)pGreenII 0800-LUC-1、pGreenII 0800-LUC-2、pGreenII 0800-LUC-3、pGreenII 0800-LUC-4在水稻原生質(zhì)體內(nèi)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)活性,間接測(cè)定對(duì)應(yīng)qPC1啟動(dòng)子活性。

1.2.4 缺陷型酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)qPC1基因cDNA序列,在qPC15’引物端和3’引物端分別添加限制性內(nèi)切酶NotI與BamH I序列,采用Bio XM軟件設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物,其引物序列qPC1-F:5’-ATTTGCGGCCGCGAGTATGGACGTGGAGAAGGT GGAGA-3’,qPC1-R: 5’-CGCGGATC CCACCAGCAACTAGTACGAGTACAGCAACA-3’。提取珍汕97的RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司,Prime ScriptTMRTMaster Mix)反轉(zhuǎn)錄qPC1的cDNA。將其cDNA連接至pMD19-T(Takara公司)載體上得到pMD19-qPC1,然后轉(zhuǎn)化至DH5α(Solarbio,C1100)中,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒pMD19-qPC1與酵母pDR195空載體,并進(jìn)行雙酶切(NotI與BamH I),將qPC1基因的cDNA序列連接至pDR195,得到pDR195-qPC1。

1.2.5 水稻根對(duì)溶液氨基酸吸收試驗(yàn) 在光照培養(yǎng)箱中,水稻qPC1轉(zhuǎn)基因(超量表達(dá)和RNAi抑制表達(dá))種子在生根培養(yǎng)基上無(wú)菌生長(zhǎng)20 d后,每個(gè)家系3株長(zhǎng)勢(shì)一致的小苗進(jìn)行根吸收試驗(yàn)。吸收溶液是水稻生根培養(yǎng)液但不含氮元素,且用20種氨基酸取代,這些氨基酸的濃度均為50 mmol/L。在吸收試驗(yàn)前對(duì)根進(jìn)行氮饑餓處理2 d,根對(duì)氨基酸的吸收速率以6 h內(nèi)溶液中氨基酸減少的速率來(lái)計(jì)算,其中溶液中氨基酸含量采用L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定。3次重復(fù),每次溶液中氨基酸含量測(cè)定2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

以水稻品種珍汕97和南陽(yáng)占DNA為模板,利用定點(diǎn)突變的特異性引物(表1,含有酶切位點(diǎn)BamH I和NotI)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別獲得長(zhǎng)度為693、440、691、231 bp的qPC1啟動(dòng)子片段,然后分別克隆至pMD18-T載體上。經(jīng)菌液PCR鑒定得到目的條帶大小與預(yù)期一致的陽(yáng)性克隆(圖1)。送陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序,經(jīng)測(cè)序篩選得到完全無(wú)突變的正確序列后,將其分別提取質(zhì)粒(圖2),并克隆至終載體pGreenII 0800-LUC上。經(jīng)菌液PCR鑒定和測(cè)序正確后,對(duì)其終載體分別提取質(zhì)粒并進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)和雙酶切鑒定(圖3),雙熒光素酶報(bào)告載體pGreenII 0800-LUC-1、pGreenII 0800-LUC-2、pGreenII 0800-LUC-3、pGreenII 0800-LUC-4均構(gòu)建成功且結(jié)果良好。

1、3、4、5泳道同為pMD18-T-1(693 bp);7～12泳道同為pMD18-T-2(440 bp);13～14、16～18泳道同為pMD18-T-3(691 bp);19～24泳道同為pMD18-T-4(231 bp)。The 1, 3, 4 and 5 lanes are the same products of pMD18-T-1 (693 bp); The 7-12 lanes are the same products of pMD18-T-2 (440 bp); The 13-14 and 16-18 lanes are the same products of pMD18-T-3 (691 bp); The 19-24 lanes are the same products of pMD18-T-4 (231 bp).

1～2泳道同為pMD18-T-1(3385 bp)質(zhì)粒;3～4泳道同為pMD18-T-2(3132 bp)質(zhì)粒;5～6泳道同為pMD18-T-3(3383 bp)質(zhì)粒; 7～8泳道同為pMD18-T-4(2923 bp)質(zhì)粒。The 1-2 lanes are the same plasmids of pMD18-T-1 (3385 bp); The 3-4 lanes are the same plasmids of pMD18-T-2 (3132 bp); The 5-6 lanes are the same plasmids of pMD18-T-3 (3383 bp); The 7-8 lanes are the same plasmids of pMD18-T-2 (2923 bp).

2.2 水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及啟動(dòng)子活性檢測(cè)

前期研究結(jié)果表明,水稻qPC1基因啟動(dòng)子區(qū)有2個(gè)共同的自然變異位點(diǎn)(-7～-12 bp,-32 bp),3個(gè)潛在順式作用元件,是引起qPC1基因表達(dá)與籽粒蛋白質(zhì)含量存在差異的主要原因[3]。根據(jù)-7～-12 bp,-32 bp兩個(gè)位點(diǎn)存在的4種突變情況設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物(表1,圖4),構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因的載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)化水稻中花11原生質(zhì)體,通過(guò)測(cè)定熒光素酶活性進(jìn)而間接測(cè)定qPC1啟動(dòng)子活性。

將構(gòu)建好的雙熒光素酶重組載體pGreenII 0800-LUC-1、pGreenII 0800-LUC-2、pGreenII 0800-LUC-3、pGreenII 0800-LUC-4和空載體pGreenII 0800-LUC使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取高濃度質(zhì)粒,將雙熒光素酶重組質(zhì)粒和對(duì)照空載體分別轉(zhuǎn)化至水稻中花11原生質(zhì)體中,分別檢測(cè)其熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pGreenII 0800-LUC-1和pGreenII 0800-LUC-2的啟動(dòng)子活性無(wú)顯著差異(圖5),說(shuō)明當(dāng)-7 bp處的CACAGA堿基存在時(shí),-32 bp處的堿基突變對(duì)轉(zhuǎn)錄活性影響不大;pGreenII 0800-LUC-3和pGreenII 0800-LUC-4的啟動(dòng)子活性差異極顯著,說(shuō)明當(dāng)-7 bp處的CACAGA堿基缺失時(shí),-32 bp處的堿基G突變?yōu)镃使轉(zhuǎn)錄活性顯著增加;pGreenII 0800-LUC-1和pGreenII 0800-LUC-4的啟動(dòng)子活性相比,pGreenII 0800-LUC-4的轉(zhuǎn)錄活性極顯著增加(P<0.001);pGreenII 0800-LUC-2和pGreenII 0800-LUC-3的啟動(dòng)子活性相比,pGreenII 0800-LUC-3的轉(zhuǎn)錄活性顯著增加(P<0.01)。以上結(jié)果表明水稻qPC1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-7 bp位置處的6 bp(CACAGA)缺失時(shí),qPC1啟動(dòng)子活性顯著增加;且當(dāng)-7 bp處的CACAGA堿基缺失,-32 bp處的堿基G突變?yōu)镃時(shí),OsAAP6基因啟動(dòng)子活性最強(qiáng)。

M為5000 bp大小的DNA標(biāo)記;A圖中1～2、3～4、5～6泳道分別為pGreenII 0800-LUC-1、pGreenII 0800-LUC-2和pGreenII 0800-LUC-3雙酶切產(chǎn)物;B圖中1～2為pGreenII 0800-LUC-4雙酶切產(chǎn)物。M: DNA marker 5000 bp DNA ladder; A: 1-2、3-4、5-6 are double digested products of pGreenII 0800-LUC-1, pGreenII 0800-LUC-2 and pGreenII 0800-LUC-3, respectively; B: 1-2 are pGreenII 0800-LUC-4 double enzyme cleavage products.

圖4 水稻qPC1啟動(dòng)子定點(diǎn)突變位點(diǎn)Fig.4 The site directed mutations in the promoter of qPC1 gene in rice

平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差;**P<0.01;***P<0.001;NO表示無(wú)顯著差異。Mean ± sem; **P<0.01; ***P<0.001; NO means no significant difference.

2.3 qPC1功能性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用

針對(duì)qPC1基因的功能性變異位點(diǎn),設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記(命名為PB13,表3),并利用分子標(biāo)記PB13對(duì)珍汕97與南洋占的重組自交系群體部分單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析。結(jié)果顯示,供試單株中有9株來(lái)自珍汕97qPC1基因型(231 bp),14株來(lái)自南洋占qPC1基因型(237 bp),其余24株為雜合基因型單株(圖6)。前期研究結(jié)果表明,來(lái)源于珍汕97qPC1基因型單株中種子蛋白質(zhì)顯著高于來(lái)源于南洋占qPC1基因型的單株[3, 28],且珍汕97qPC1基因序列在其啟動(dòng)子-7～-12 bp位置處,相對(duì)于南洋占qPC1基因存在1個(gè)6 bp(CACAGA)的缺失。因此,上述試驗(yàn)結(jié)果為后期利用qPC1基因進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種提供了重要的功能性分子標(biāo)記。

表3 qPC1基因功能性分子標(biāo)記

2.4 缺陷型酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

以珍汕97的RNA為模版反轉(zhuǎn)錄得到其cDNA,利用含有酶切位點(diǎn)(NotI和BamH I)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到預(yù)期DNA片段(1543 bp)(圖7-A)。將此DNA片段連接至終載體pDR195,經(jīng)測(cè)序和雙酶切檢測(cè)(圖7-B),其中泳道1～5表示提取的質(zhì)粒,大小在7.8 kb左右(與理論大小吻合),泳道6為NotI和BamH I雙酶切pDR195-qPC1質(zhì)粒后的條帶,大小分別為6.3和1.5 kb左右(與理論大小吻合),即完成缺陷型酵母表達(dá)載體pDR195-qPC1構(gòu)建。

1～47為珍汕97(ZS97)與南洋占(NYZ)的重組自交系群體內(nèi)的單株,其中1、7、14、18、29、42、44、46和47號(hào)樣品是珍汕97的基因型;2、3、6、11、12、15、22、24、26、31、38、40、41和43號(hào)樣品是南洋占的基因型,其余的樣品是珍汕97與南洋占雜合基因型。1-47 are individual plants within the recombinant inbred population of Zhenshan 97 (ZS97) and Nanyangzhan (NYZ), among which samples 1, 7, 14, 18, 29, 42, 44, 46 and 47 are genotypes of Zhenshan 97, samples 2, 3, 6, 11, 12, 15, 22, 24, 26, 31, 38, 40, 41 and 43 are genotypes of Nanyangzhan, while the remaining samples are heterozygous genotypes of Zhenshan 97 and Nanyangzhan.

A:1～2泳道為qPC1 cDNA片段;B:1～4泳道為pDR195-qPC1質(zhì)粒;5泳道為pDR195-qPC1質(zhì)粒雙酶切結(jié)果。 A: The 1-2 lanes are the same products of qPC1; B: The 1-4 lanes are the same plasmids of pDR195-qPC1; The line 5 is the double-enzyme digestion of pDR195-qPC1.

2.5 缺陷型酵母生長(zhǎng)情況檢測(cè)

將上述構(gòu)建好的缺陷型酵母表達(dá)載體pDR195-qPC1轉(zhuǎn)入酵母突變體細(xì)胞22Δ8AA(qPC1-22Δ8AA),并將pDR195空載體分別轉(zhuǎn)入酵母突變體菌株22Δ8AA(pDR-22Δ8AA)和酵母野生型菌株24433c(pDR-24433c)作為陰性與陽(yáng)性對(duì)照。然后在YNB培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果顯示上述3種酵母生長(zhǎng)情況良好(圖8),即載體均已轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞,可以進(jìn)行后續(xù)的氨基酸缺陷型酵母互補(bǔ)試驗(yàn)。

2.6 qPC1在酵母體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)功能分析

氨基酸缺陷型酵母22Δ8AA對(duì)于吸收精氨酸、瓜氨酸、GABA、天冬氨酸、脯氨酸或谷氨酸6種氨基酸存在缺陷,利用酵母22Δ8AA這種特性能夠在酵母體內(nèi)檢測(cè)qPC1轉(zhuǎn)運(yùn)功能。將上述構(gòu)建好的3種酵母(pDR-22Δ8AA、pDR-24433C和qPC1-22Δ8AA)轉(zhuǎn)入酵母完全培養(yǎng)基YPAD中擴(kuò)繁并篩選。結(jié)果顯示,qPC1-22Δ8AA酵母生長(zhǎng)情況與pDR-24433c酵母陽(yáng)性對(duì)照相似,但明顯好于pDR-22Δ8AA陰性對(duì)照。在含1 mmol/L谷氨酸和天冬氨酸、以及3 mmol/L精氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和L-瓜氨酸的培養(yǎng)基上,qPC1-22Δ8AA酵母生長(zhǎng)情況更好,與pDR-22Δ8AA陰性對(duì)照存在明顯差異。在含3 mmol/L谷氨酸培養(yǎng)基上,pDR-22Δ8AA陰性對(duì)照在稀釋1000倍時(shí)基本不再生長(zhǎng),但qPC1-22Δ8AA酵母在1000和10 000倍時(shí)依然生長(zhǎng)良好。因此,qPC1-22Δ8AA酵母在供試的6種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng),即qPC1蛋白在體內(nèi)能夠轉(zhuǎn)運(yùn)多種氨基酸,轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸的能力最強(qiáng)(圖9)。

2.7 qPC1參與水稻根部氨基酸的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)

為探究qPC1是否參與水稻根部氨基酸的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn),將qPC1超量表達(dá)(OX)和抑制表達(dá)(RNAi)以及對(duì)應(yīng)的對(duì)照水稻苗期根部浸入含有20種氨基酸培養(yǎng)液中,根對(duì)氨基酸的吸收速率以6 h內(nèi)溶液中氨基酸減少的速率來(lái)計(jì)算。結(jié)果表明,相對(duì)于qPC1超量表達(dá)陰性O(shè)X (-)植株,脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸和總氨基酸含量在qPC1超量陽(yáng)性O(shè)X (+)植株中顯著升高,甲硫氨酸則明顯下降(圖10-A),而在qPC1抑制表達(dá)(RNAi)轉(zhuǎn)基因植株中的情況卻完全相反(圖10-B),即qPC1能夠促進(jìn)水稻根對(duì)多種氨基酸的吸收,且對(duì)蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和酸性氨基酸具有較快的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)速率。

A:pDR-24433c;B:pDR-22Δ8AA;C:qPC1-22Δ8AA。

a: OD600值為1.0; b: 稀釋10倍;c: 稀釋100倍; d: 稀釋1000倍; e:稀釋10 000倍。a: OD600 value of liquid bacterial germ is 1.0; b: Liquid bacterial germ is diluted 10 times;c: Liquid bacterial germ is diluted 100 times; d: Liquid bacterial germ is diluted 1000 times; e: Liquid bacterial germ is diluted 10 000 times.

3 討 論

水稻qPC1基因是一個(gè)控制稻米蛋白質(zhì)含量高低的正調(diào)控因子,定位于水稻第1染色體上,即qPC1表達(dá)水平高時(shí)能合成并積累更多的水稻種子儲(chǔ)藏蛋白和總的必需氨基酸,最終提高稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[3]。大田試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著田間氮肥濃度增加,qPC1表達(dá)量逐漸升高,促進(jìn)稻米中蛋白質(zhì)、總必需氨基酸和總氨基酸的積累,有利于稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的提升[4, 29]。前期研究發(fā)現(xiàn),qPC1基因(又稱OsAAP6)在啟動(dòng)子區(qū)的變異是引起稻米蛋白質(zhì)含量變異的主要原因[3]。通過(guò)分析197份世界微核心種質(zhì)資源qPC1基因序列發(fā)現(xiàn),qPC1啟動(dòng)子區(qū)存在3個(gè)共同的多態(tài)性變異位點(diǎn),且其中2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)存在3個(gè)潛在的順式作用元件,它們是轉(zhuǎn)錄活化因子結(jié)合的靶位點(diǎn)[3]。本研究定點(diǎn)突變qPC1啟動(dòng)子翻譯起始位點(diǎn)上游-7和-32 bp這2個(gè)位點(diǎn),并將其克隆至雙熒光素酶報(bào)告基因載體pGreenII 0800-LUC上,將4種重組表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至水稻原生質(zhì)體,檢測(cè)熒光素酶的活性。結(jié)果顯示qPC1啟動(dòng)子區(qū)-7～-12 bp處6 bp的缺失,能夠促進(jìn)qPC1啟動(dòng)子活性顯著增加。因此,qPC1啟動(dòng)子翻譯起始位點(diǎn)上游-7和-32 bp處即為qPC1基因的功能性變異位點(diǎn),并針對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記PB13進(jìn)一步進(jìn)行了驗(yàn)證,本研究結(jié)果為后期全面揭示水稻種子蛋白質(zhì)含量的分子調(diào)控機(jī)理提供了重要依據(jù)。

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,其中擬南芥AtLHT1能夠針對(duì)組氨酸和賴氨酸進(jìn)行特異性轉(zhuǎn)運(yùn)[30],玉米中ZmAAP4可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸和脯氨酸[31]。作為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員的一個(gè)亞家族,氨基酸通透酶在植物體內(nèi)能夠轉(zhuǎn)運(yùn)多種氨基酸,參與調(diào)控水稻產(chǎn)量與品質(zhì)。例如,OsAAP1基因通過(guò)增加中性氨基酸的攝取和再分布來(lái)改善水稻的生長(zhǎng)和種子產(chǎn)量[20]。OsAAP4基因參與調(diào)節(jié)中性氨基酸的分配,能夠提高水稻分蘗數(shù)及其產(chǎn)量[22]。OsAAP5主要轉(zhuǎn)運(yùn)堿性氨基酸(賴氨酸和精氨酸)[23]。OsAAP7能夠轉(zhuǎn)運(yùn)甘氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸[24]。OsAAP10在水稻中參與中性和酸性氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn),并且影響直鏈淀粉含量與食味值等品質(zhì)性狀[25]。除了天冬氨酸和β-丙氨酸,其余的氨基酸都能被OsAAP16轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。qPC1(OsAAP6)是水稻種子蛋白質(zhì)含量和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的正向調(diào)節(jié)因子[3-4],但尚不清楚其轉(zhuǎn)運(yùn)功能。為探究qPC1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能,將qPC1轉(zhuǎn)入氨基酸缺陷型酵母,結(jié)果發(fā)現(xiàn)qPC1-22Δ8AA酵母在供試6種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng),即qPC1蛋白能夠轉(zhuǎn)運(yùn)多種氨基酸。為進(jìn)一步探究qPC1在水稻體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)功能,利用qPC1超量表達(dá)和抑制表達(dá)材料進(jìn)行水稻根部氨基酸的吸收試驗(yàn),結(jié)果顯示qPC1參與水稻根部多種氨基酸的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。水稻根部氨基酸的吸收試驗(yàn)和缺陷型酵母的互補(bǔ)試驗(yàn)結(jié)果均表明,qPC1蛋白參與多種氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn),暗示qPC1蛋白是一種廣譜性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,這為全面解析qPC1基因的生物學(xué)功能提供重要線索。

A和B分別表示qPC1超量表達(dá)和RNAi抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株根部氨基酸的吸收試驗(yàn)結(jié)果。 (+) 和 (-)分別表示在T2 代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性和陰性植株;“*”和“**”分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示,差異基于雙尾t-測(cè)驗(yàn),3次生物學(xué)重復(fù)。插入的表示總氨基酸。A and B represent the absorption results of amino acids in the roots of transgenic plants with qPC1 overexpression and RNAi inhibition, respectively. (+) and (-) represent transgenic positive and negative plants in T2 generation, respectively; ‘*’ and ‘**’ indicate significant differences at the 0.05 and 0.01 levels, respectively. The data is displayed as mean ± standard deviation, with differences based on a two tailed t-test and three biological replicates. The inserted represents the total amino acids.

4 結(jié) 論

水稻qPC1啟動(dòng)子區(qū)-7～-12 bp位置為其功能性變異位點(diǎn),設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的功能性分子標(biāo)記PB13并進(jìn)行驗(yàn)證。qPC1基因參與多種氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn),這為后期全面解析qPC1分子調(diào)控機(jī)制及其利用qPC1基因進(jìn)行水稻新品種的分子設(shè)計(jì)育種提供了重要理論依據(jù)。