陳一凡，闞新意，蔣曉嵐，高麗萍，夏濤*

1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036

單寧（Tannins，tannic acid），味澀，主要存在于植物的各個組織中，在柿子、葡萄類植物中含量較高[1-2]。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性的差異，植物單寧化合物可分為水解單寧（Hydrolyzalable tannins）和縮合單寧（Condensed tannins）兩大類[3-5]。水解單寧化合物根據(jù)攜帶的基團不同，又分為沒食子單寧和鞣花單寧[6]，沒食子單寧是結(jié)構(gòu)最為簡單的一種由沒食子?；倌軋F組成的水解單寧，鞣花單寧是現(xiàn)今了解到的最大單寧組群；縮合單寧化合物也稱為原花青素（Proanthocyanidins），由多個兒茶素組分組成，不含酯鍵，不能被水解[7]。

單寧酶（Tannase，EC.3.1.1.20）能夠水解單寧類化合物中的酯鍵[8]。單寧酶的理化性質(zhì)是目前單寧酶研究中比較熱門的內(nèi)容之一，單寧酶性質(zhì)的差異主要是由其來源與培養(yǎng)條件決定[9]。單寧酶的蛋白分子量大小范圍為50～320 kDa，最適反應(yīng)溫度大致在30～60 ℃，最適反應(yīng)pH為5～6，不同來源的單寧酶對底物的親和性存在差異，當(dāng)使用單寧酸作為底物時，來自黑曲霉、黃曲霉、宛氏擬青酶和產(chǎn)黃曲霉的米氏常數(shù)（Km）值分別為1.03、0.05、0.000 61、0.048[10]。Kar等[11]研究了金屬離子對單寧酶的影響，發(fā)現(xiàn)Mg2+和Hg+能夠提高單寧酶活力，而Ca2+、Hg2+和Ag+會抑制酶活性。Chhokar等[12]對泡盛曲霉單寧酶研究發(fā)現(xiàn)，Mg2+、Mn2+、Ca2+、Na+和K+能夠增強單寧酶活力，而Cu2+、Fe3+和Co2+則會大大降低其活性。唐佳代等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+、Fe3+和Mn2+對重組后的黑曲霉單寧酶酶活性幾乎沒有影響。

單寧酶在茶葉加工中應(yīng)用廣泛，主要目的是去除茶乳酪，水解具有苦澀味的酯型兒茶素從而提升茶湯口感，提高茶葉在加工中的提取率等。胡雄飛[14]研究表明，用單寧酶處理的綠茶濃縮汁可以減少綠茶茶湯的沉淀；寧井銘等[15]探究單寧酶對綠茶澄清作用的影響，認(rèn)為單寧酶與其他水解酶（果膠酶、纖維素酶、淀粉酶）的協(xié)同作用更利于防止綠茶飲料中沉淀的形成。Cao等[16]研究了單寧酶對于夏季綠茶品質(zhì)提升的作用，發(fā)現(xiàn)在綠茶加工中加入單寧酶可以減輕茶葉中的苦澀味，提升茶湯口感。

目前有關(guān)植物單寧酶的研究已逐漸被報道，Niehaus等[17]在1997年從橡木的新鮮葉片中分離并純化了一種酯酶，利用體外酶活的手段發(fā)現(xiàn)該酶可以催化沒食子酸葡萄糖酯、沒食子酸甲酯以及縮酚酸類（如綠原酸）等化合物水解生成沒食子酸和糖或各種酚酸類單體，證明其酶學(xué)特性與真菌單寧酶相似，因此將其命名為“單寧酶”；Belur等[18]研究發(fā)現(xiàn)，從柯子樹的果實和漆樹的葉片等中提取的粗酶也具有單寧酶的酶學(xué)特性；聶志銀等[19]研究報道了茶樹中存在單寧酶，并建立了茶樹酯型兒茶素水解酶的檢測體系；Dai等[20]首次從茶樹中分離純化并鑒定出了一類植物單寧水解酶，將其命名為CsTA，它可以催化酯型兒茶素EGCG及簡單沒食子酰葡萄糖PGG酯鍵的水解產(chǎn)生EGC和一系列中間沒食子酰葡萄糖產(chǎn)物并釋放GA。

然而這些研究僅僅是停留在分子機制上，這類植物單寧酶的理化性質(zhì)及其是否能應(yīng)用到綠茶飲料加工過程中降低酯型兒茶素的含量目前未見報道。因此，本研究在之前工作的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對茶樹單寧酶CsTA的理化性質(zhì)進(jìn)行探究，并分析其在不同蛋白添加量、料液比、作用時間與溫度下對綠茶茶湯中兒茶素類物質(zhì)及沒食子酸含量的影響，旨在為綠茶飲料加工中降低苦澀味，提升滋味品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試茶樹品種為舒茶早，種植于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研基地，綠茶茶樣原料采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉。用于比較分析試驗使用的市售商品單寧酶購自上海源葉生物科技有限公司，生物試劑，200 U·g-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶樹RNA的提取及CsTA的基因克隆

茶樹RNA提取參照TAKARA公司的植物RNA提取試劑盒進(jìn)行，使用凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量，并利用核酸定量儀檢測總RNA樣品的含量和質(zhì)量。

CsTA的基因克?。焊鶕?jù)TaKaRa公司PrimeScript? RT reagent Kit perfect Real Time試劑盒說明書合成cDNA，使用的PCR引物列于表1。以茶樹嫩葉cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)體系為高保真酶25 μL、cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL，無菌水補齊至總體積為50 μL。PCR擴增程序為98 ℃ 10 s，62 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃ 6 min，16 ℃至結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳驗證，對目的條帶進(jìn)行膠回收，產(chǎn)物克隆至pEASY-Blunt Simple載體（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司），轉(zhuǎn)化DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（上海唯第生物技術(shù)有限公司），選取陽性克隆委托通用生物（安徽）股份有限公司進(jìn)行測序，測序正確的菌用于后續(xù)試驗。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2 蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白純化

利用BamHⅠ和PstⅠ限制性內(nèi)切酶對pRSFDuet-1（Novagen，Schwalbach，Germany）載體進(jìn)行雙酶切，將CsTA的開放閱讀框通過ClonExpress MultiS onestep克隆試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）連接到pRSFDuet-1載體，之后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將陽性菌添加到100 mL LB培養(yǎng)基中，并加入50 mg·mL-1卡那霉素，在37 ℃搖床孵育。當(dāng)菌液OD600值為0.6～0.8時，加入90 μL 1 mol·L-1誘導(dǎo)劑（IPTG），置于16 ℃搖床中孵育24 h。然后在10 ℃條件下，6 000 r·min-1離心6 min去除上清液，將菌體儲存在-20 ℃。收集的菌體在4 ℃、20%功率下超聲30 min后，通過His-tag親和層析（Roche，Mannheim，Germany）直接純化重組蛋白。然后將收集的蛋白在不同的濃縮管中進(jìn)行濃縮，得到的蛋白經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和考馬斯亮藍(lán)染色確定。純化的重組蛋白保存在-80℃冰箱用于體外酶學(xué)試驗。

1.2.3 單寧酶活力的測定

配制EGCG、ECG、EGC、EC、GA 5種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，將5 mmol·L-1的母液標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成濃度為0、25、50、100、150、200、250、300、450、550 μmol·L-1的溶液。利用高效液相色譜儀（HPLC）檢測。驗證酶活體系和方法參照文獻(xiàn)[20]。

1.2.4 茶樹單寧酶酶學(xué)性質(zhì)測定

最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性測定：將純化的酶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，分別在不同溫度下（15、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃）反應(yīng)測定酶活力，以及分別放在4、20、30、40、50、60 ℃水浴下保溫0.5 h，待酶液冷卻后測定CsTA相對活力（酶活性最大值定為100%）。

酶的貯存穩(wěn)定性測定：將純化好的酶液按照每管500 μL進(jìn)行等量分裝，冷凍干燥48 h變?yōu)榉勰┖?，分別放置在-80、-20、4 ℃和室溫下（避光），每隔7 d檢測一次酶活力。

最適反應(yīng)pH與蛋白pH穩(wěn)定性測定：用Na2HPO4和NaH2PO4配制0.1 mol·L-1、pH 4.5～9.0的PBS緩沖液，用Tris與HCl配制0.1 mol·L-1、pH 9.0～10.5的Tris-HCl緩沖液，分別在pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5的緩沖液中進(jìn)行酶反應(yīng)，測定酶活力，用于最適反應(yīng)pH分析；將蛋白分別置于pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液中，4 ℃放置72 h后進(jìn)行酶反應(yīng)測定酶活力，用于pH穩(wěn)定性分析。

金屬離子對酶活力的影響：用0.1 mol·L-1、pH為7.0的PBS緩沖液配制濃度為1 mmol·L-1的MgCl2、EDTA、CoCl2、CaCl2、ZnCl2、MnCl2、CuCl2、AlCl3、FeCl3、FeSO4、LiCl、KCl 溶液，以含有這些金屬離子的溶液作為緩沖液，測定酶活力。

1.2.5 純化后的單寧酶CsTA作為外源酶對綠茶茶湯的影響

不同蛋白添加量對綠茶茶湯的影響：稱取綠茶（干茶用研缽磨碎過200目篩后混勻）4.0 g，按茶水比1∶50（m∶V）加入純水并定容至200 mL，放入85 ℃水浴鍋浸提30 min，每5 min攪動一次，過濾茶渣得到茶湯，離心20 min取上清液作為酶反應(yīng)底物。預(yù)試驗結(jié)果表明，95 ℃滅活5 min能使單寧酶完全失活且對兒茶素濃度無明顯影響，因此采用95 ℃滅活5 min作為終止反應(yīng)的處理方法。分別用0、1、3、5、7、9、11、15 μg的CsTA蛋白處理綠茶茶湯（50 μL反應(yīng)體系），35 ℃水浴30 min，產(chǎn)物在95 ℃下滅活。離心20 min取上清液，用HPLC檢測樣品兒茶素組分含量的變化。在波長λ=280 nm下對兒茶素類物質(zhì)進(jìn)行定量分析，試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

不同料液比對綠茶茶湯的影響：稱取磨碎過 200目篩后的綠茶粉末1.0 g，分別按照1∶20、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶300的茶水比（m∶V）加入純水后放入85 ℃水浴鍋浸提30 min，過濾離心后的上清液作為酶反應(yīng)底物，50 μL反應(yīng)體系中添加11 μg純化的蛋白、35 ℃水浴30 min，產(chǎn)物在95 ℃下滅活后定量分析兒茶素類物質(zhì)含量。

不同反應(yīng)時間對綠茶茶湯的影響：以茶水比1∶50、85 ℃水浴鍋浸提30 min后的上清液作為酶反應(yīng)底物，分別于反應(yīng)0、5、10、20、30、60、90、120、180 min時取樣，在95 ℃下滅活后定量分析兒茶素類物質(zhì)含量。

不同反應(yīng)溫度對綠茶茶湯的影響：以茶水比1∶50、85 ℃水浴鍋浸提30 min后的上清液作為酶反應(yīng)底物，分別于10、20、30、35、40、45、50、60、70 ℃下反應(yīng)30 min，在95 ℃下滅活后定量分析兒茶素類物質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組單寧酶CsTA的純化和酶活性驗證

首先將構(gòu)建到pRSFDuet-1載體上的重組單寧酶CsTA在上清液中成功表達(dá)并純化，SDS-PAGE驗證發(fā)現(xiàn)，茶樹單寧酶CsTA的分子量約為35 kDa（圖1A），與預(yù)測分子量幾乎一致。以EGCG為底物進(jìn)行體外酶活試驗，利用HPLC對酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示重組單寧酶CsTA能夠水解EGCG生成EGC與GA，表明其具有水解活性（圖1B）。這與課題組前期已取得的試驗結(jié)果[20]一致。

圖1 重組單寧酶CsTA的SDS-PAGE分析及酶活性鑒定Fig.1 SDS-PAGE analysis and enzymatic activity identification of recombinant protein

2.2 重組單寧酶CsTA的理化性質(zhì)分析

2.2.1 單寧酶CsTA的最適作用溫度與熱穩(wěn)定性

如圖2A所示，45 ℃是單寧酶CsTA的最適反應(yīng)溫度，CsTA在35～55 ℃具有較高的活性，當(dāng)溫度為65 ℃時，相對酶活力下降到11.9%。熱穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，單寧酶CsTA在4、20、30、40、50 ℃下保溫 0.5 h后的相對酶活力仍能保持在50%以上，且隨著溫度升高相對酶活力先增強后迅速下降，在60 ℃下保溫0.5 h后已失活（圖2B），表明 CsTA在50 ℃以下具有較高的熱穩(wěn)定性。

圖2 重組單寧酶CsTA的最適反應(yīng)溫度（A）與熱穩(wěn)定性分析（B）Fig.2 The optimum temperature (A) and thermal stability analysis (B) of CsTA recombinant protein

2.2.2 單寧酶CsTA的貯藏穩(wěn)定性

將大量純化后的單寧酶CsTA蛋白液進(jìn)行冷凍干燥，得到的固體粉末酶活力計為100%。單寧酶CsTA的貯藏穩(wěn)定性結(jié)果如圖3所示，CsTA分別在-80、-20 ℃和4 ℃貯存7 d后均展現(xiàn)出很好的貯存穩(wěn)定性，酶活力均在 97%以上，而室溫下酶活力降至95%，存在顯著差異；貯存14 d后，在-80 ℃和-20 ℃下貯存的酶活力差異不大，而4 ℃下貯存的酶活力降至96%，室溫下貯存的酶活力降至 88%；貯存21 d后，-20、4 ℃及室溫貯存條件下酶活力均有顯著下降；貯存28 d后，-80、-20、4 ℃及室溫貯存溫度條件下單寧酶CsTA的酶活力分別為99.1%、97.6%、8.08%和71.1%。表明純化后的單寧酶CsTA固體粉末在-80 ℃條件下具有很高的貯存穩(wěn)定性，而在室溫條件下穩(wěn)定性最差。

圖3 單寧酶CsTA的儲藏穩(wěn)定性Fig.3 Storage stability of CsTA recombinant protein

2.2.3 單寧酶CsTA的最適反應(yīng)pH與pH穩(wěn)定性

為了探究不同酸堿環(huán)境對CsTA酶活力的影響，本研究比較了不同pH下的酶活性。由圖4A可知，CsTA的最適反應(yīng)pH為7.0，在pH為5.5～7.5時其相對酶活力能保持在65%以上，而pH小于4.5或大于10.0時單寧酶CsTA活性微弱，可忽略不計。為了解重組CsTA在不同pH環(huán)境下的穩(wěn)定性，將純化的CsTA蛋白用不同酸堿度的緩沖液稀釋后進(jìn)行酶反應(yīng)分析，結(jié)果如圖4B所示。CsTA在pH為6.0～8.0的緩沖液范圍內(nèi)放置72 h后仍有較高的穩(wěn)定性，此時酶活力能保持在80%以上；當(dāng)緩沖液pH為10.0時，CsTA的酶活力仍在50%以上；而緩沖液pH為5.0時，酶活力僅為10%，這表明CsTA在偏堿性環(huán)境中較酸性環(huán)境更穩(wěn)定。

圖4 單寧酶CsTA重組蛋白的最適反應(yīng)pH（A）與pH穩(wěn)定性分析（B）Fig.4 The optimum pH (A) and pH stability analysis (B) of CsTA recombinant protein

2.2.4 金屬離子對單寧酶CsTA活力的影響

為了探究不同金屬離子對CsTA酶活力的影響，本研究選擇了13種含有不同金屬離子的緩沖液對CsTA的酶活力進(jìn)行分析。以Na+鹽溶液的酶反應(yīng)相對活力為100%，結(jié)果如圖5所示。Mg2+對CsTA的酶活力有明顯的促進(jìn)作用，酶活力為228%；而Cu2+明顯抑制CsTA活性，使酶完全失活；Co2+和Ca2+對酶活力有一定的抑制作用，其相對酶活力約為85%；Li+可使酶活力降至 60%；Zn2+、Mn2+、、Al3+、Fe3+、Fe2+條件下CsTA的酶活力分別為46%、41%、40%、22%、21%，呈現(xiàn)抑制作用；K+對單寧酶的活力則沒有明顯影響。

圖5 金屬離子對茶樹CsTA重組蛋白活性的影響Fig.5 Effect of metal ions on the activity of CsTA recombinant protein

2.2.5 單寧酶CsTA與商品單寧酶最適溫度與最適pH的比較

由于我國生產(chǎn)的商品單寧酶是由真菌菌種經(jīng)液體深層發(fā)酵純化提取制成，已被證實可用于茶飲料等的生產(chǎn)[21]。因此本研究以商品單寧酶（源葉生物，BR，200 U·g-1）作為參照，分析比較CsTA的最適反應(yīng)溫度和pH，結(jié)果如圖6所示。商品單寧酶的最適反應(yīng)溫度為25 ℃，最適反應(yīng)pH為5.0；茶樹單寧酶CsTA與商品單寧酶的結(jié)果顯著不同，其最適溫度為45 ℃，最適pH為7.0。通過對比可以發(fā)現(xiàn)，相較于市售的商品單寧酶，CsTA更能適應(yīng)高溫環(huán)境和中性偏堿性環(huán)境，這可能在茶樹適應(yīng)高溫和中性及偏堿性環(huán)境中具有一定的作用。

圖6 茶樹單寧酶CsTA及商品單寧酶最適溫度（A）和pH的比較（B）Fig.6 Comparison of optimal temperature (A) and pH (B) of CsTA and a commercial tannase

2.3 重組單寧酶CsTA在綠茶飲料中的應(yīng)用

2.3.1 不同添加量的外源茶樹單寧酶CsTA對綠茶茶湯中酯型兒茶素的影響

據(jù)研究報道，在200 mg·L-1下，茶湯中兒茶素成分的抗氧化能力大小為EGC＞EGCG＞EC＞ECG[22]，這表明非酯型兒茶素（EGC和EC）含量的增加有助于茶湯抗氧化能力的提高。此外，EGCG作為茶樹中主要的黃烷-3-醇類物質(zhì)之一，被認(rèn)為在苦澀味的傳遞中具有重要作用[23-24]，因此首先比較了綠茶茶湯經(jīng)過不同蛋白量CsTA處理（茶水比1∶50，50 μL體系反應(yīng)30 min）后酯型兒茶素EGCG、ECG及其產(chǎn)物（EGC、EC及GA）的變化，結(jié)果如表2所示。酯型兒茶素EGCG和ECG的含量隨單寧酶CsTA添加量的增加而明顯降低，EGCG從0.430 mmol·L-1下降至0.052 mmol·L-1，下降了88%；ECG從0.095 mmol·L-1下降至0.022 mmol·L-1，下降了77%；而 EGC、EC和GA的含量則隨著單寧酶含量的增加而增加，分別從0.301、0.073、0.032 mmol·L-1增加至0.644、0.166、0.579 mmol·L-1，分別增加了1.14倍、1.27倍和17.09倍。并且當(dāng)茶樹單寧酶CsTA添加量為11 μg時對酯型兒茶素的降解效果最好。

表2 不同濃度茶樹單寧酶CsTA對綠茶茶湯中兒茶素類與沒食子酸濃度的影響Table 2 Effect of different concentrations of tannase CsTA on catechins and gallic acid in green tea infusion mmol·L-1

2.3.2 不同茶水比中添加外源茶樹單寧酶CsTA對綠茶茶湯中酯型兒茶素的影響

如表3所示，隨著茶水比的增加，茶湯中的酯型兒茶素EGCG和ECG逐漸下降，而相應(yīng)的產(chǎn)物含量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。在茶水比為1∶100時，EC和GA濃度達(dá)到最大，分別為0.016 mmol·L-1和0.244 mmol·L-1，較茶水比為1∶20時分別增加了100%和50%，此時 EGC 達(dá)到 0.070 mmol·L-1。

2.3.3 外源茶樹單寧酶CsTA作用時間對綠茶茶湯中酯型兒茶素的影響

從表4可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，酯型兒茶素EGCG和ECG作為底物逐漸被消耗，EGCG從0.401 mmol·L-1下降到0.108 mmol·L-1，降幅73%，且ECG從0.212 mmol·L-1下降到0.091 mmol·L-1，降幅57%。而相應(yīng)的水解產(chǎn)物逐漸增加，EGC、EC和GA分別從0.029、0.002 mmol·L-1和0.121 mmol·L-1增加到了0.052、0.016 mmol·L-1和0.220 mmol·L-1，分別增加了79%、700%和82%。

在反應(yīng)了20 min時外源CsTA對綠茶茶湯中酯型兒茶素的總體降解效果最好，此時與0 min相比，EGCG和ECG分別減少了44%和49%，而EGC、EC和GA分別增加了83%、600%和75%。之后繼續(xù)增加作用時間，綠茶茶湯中酯型兒茶素及其產(chǎn)物的變化較小，因此外源茶樹單寧酶CsTA作用于綠茶茶湯的最佳時間應(yīng)為10～20 min。

2.3.4 不同溫度下外源茶樹單寧酶CsTA對綠茶茶湯中酯型兒茶素的降解作用

由表5可知，隨著溫度的升高，酯型兒茶素EGCG和ECG均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，相應(yīng)的產(chǎn)物則呈現(xiàn)相反的趨勢。在35 ℃時EGCG和ECG下降到最低，分別為0.184 mmol·L-1和0.086 mmol·L-1，此時的EGC、EC和GA含量達(dá)到最高，分別為0.052、0.017 mmol·L-1和0.222 mmol·L-1。在70 ℃時茶樹單寧酶CsTA對綠茶茶湯降解效果最差，此時EGC、EC和GA含量最低，分別為0.007、0.006 mmol·L-1和0.157 mmol·L-1。

3 討論

沒食子酰黃烷-3-醇也被稱為酯型兒茶素，是茶葉重要的組成部分，也是茶葉中含量最多的多酚類化合物[25-27]。夏秋季采摘的茶葉原料粗老，沒食子?；狞S烷-3-醇類物質(zhì)（如EGCG）積累過多，所制茶葉大多氨基酸含量較低，滋味單薄且茶湯苦澀味較重[28]，商業(yè)價值不高，致使大多數(shù)茶農(nóng)放棄夏秋茶的采摘，造成了嚴(yán)重的茶樹資源浪費。Rossetti等[29]認(rèn)為茶葉中酯型兒茶素是澀味重要的貢獻(xiàn)者；Scharbert等[30]研究發(fā)現(xiàn)，高聚合形式的兒茶素是紅茶中苦味因子的重要組成部分，而苦澀味嚴(yán)重影響著消費者對產(chǎn)品的選擇，因此茶樹中酯型兒茶素的過多積累會極大降低茶葉的滋味品質(zhì)。

在制茶過程中添加外源酶制劑以改變茶葉內(nèi)含物質(zhì)構(gòu)成，提升茶葉滋味品質(zhì)的相關(guān)研究越來越受到關(guān)注[31]。作為外源酶之一的單寧酶能夠水解單寧化合物中的酯鍵來降低茶葉中具有苦澀味的酯型兒茶素的相對含量，從而提升茶湯的口感以增強茶葉的品質(zhì)[32]。胡雄飛[14]研究發(fā)現(xiàn)，使用單寧酶處理綠茶茶湯可以減少80%的沉淀；蘇祝成等[33]研究表明，在傳統(tǒng)夏季綠茶加工過程中加入單寧酶，能大大降低總兒茶素中EGCG的比例，增加一些味覺敏感的氨基酸（如Glu），可以減少綠茶的刺激性并增強其醇香度。Cao等[16]認(rèn)為，在夏季綠茶加工過程中加入單寧酶能夠降低茶湯中酯型兒茶素含量并減輕茶湯澀味。黃玉鳳等[34]研究發(fā)現(xiàn)，加入單寧酶的綠茶茶湯，其清除自由基能力顯著增強，茶湯的儲存性與澄清度也有所提高。

目前所報道的應(yīng)用于茶飲料加工過程中的單寧酶多局限于微生物源單寧酶，Dai等[20]首次從茶樹中分離純化并鑒定出了植物單寧水解酶CsTA，并證實其可以在體外參與并調(diào)控酯型兒茶素的降解過程，但并未對這類植物源單寧酶的應(yīng)用有進(jìn)一步研究。本研究在前人的研究基礎(chǔ)上對植物單寧酶CsTA進(jìn)行了更深入的理化性質(zhì)分析，并將其與商品單寧酶進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)植物單寧酶CsTA比商品單寧酶具有更廣泛的適應(yīng)溫度和酸堿度，表明CsTA更能適應(yīng)高溫環(huán)境和中性偏堿性環(huán)境，為日后單寧酶的高效制備提供理論指導(dǎo)。

此外，本研究將植物單寧酶CsTA作為外源酶加入到綠茶茶湯中并進(jìn)行了參數(shù)優(yōu)化試驗，結(jié)果顯示，茶樹單寧酶CsTA能夠顯著改善茶湯中兒茶素的組成，茶湯中添加外源茶樹單寧酶CsTA后酯型兒茶素EGCG和ECG大幅降低，相應(yīng)的降解產(chǎn)物EC、EGC及GA含量明顯增加。當(dāng)CsTA添加量為11 μg、茶水比為1∶100、反應(yīng)時間為20 min、溫度為35 ℃時，綠茶茶湯酯型兒茶素降解效果最好。酯型兒茶素的降低、非酯型兒茶素及GA含量的提高不僅保證了茶湯的濃度，而且能夠有效減輕茶湯的苦澀味，由于考慮到茶樹單寧酶CsTA大腸桿菌表達(dá)體系的安全性，本研究并未進(jìn)行CsTA處理綠茶茶湯后的審評試驗，將來可以換用安全性更高的酵母表達(dá)體系來進(jìn)一步完善試驗。

茶樹單寧酶CsTA作為最近從植物中被分離純化出的植物源單寧酶，其在綠茶飲料加工生產(chǎn)過程中對提高茶葉滋味品質(zhì)具有極大的挖掘潛力和利用前景。