鄧曉旭，謝夏，潘婭梅，趙豐華，蔣雙豐，徐文，張潔，孫潤紅，夏明聰，楊麗榮*

1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/河南省生物農(nóng)藥工程研究中心，河南 鄭州 450002；2.信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 信陽 464000

茶樹是我國重要的經(jīng)濟作物，茶葉的出口貿(mào)易量近年快速增長[1-2]。茶葉含有茶多酚、茶多糖等多種特有活性物質(zhì)，具有降血糖、防癌抗癌、抗氧化等功效。世界上已有記載的茶樹病原種類多達 500余種[3]，目前仍陸續(xù)有新病害和新病原的報道，例如擬盤多毛孢（Pestalotia theae）引起的茶輪斑病和黑褐色葉斑病，莖點霉屬病原菌（Phoma segeticola var.camelliae和P.herbarum）所引起的茶葉斑病[4-6]，腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）引起的茶樹莖腐和枯萎病等[7]。腐皮鐮刀菌引起的茶樹病害多發(fā)于 5月，由分生孢子傳播，在茶樹根莖部發(fā)病，自下而上導(dǎo)致葉片逐漸凋落，最終整株樹干枯死[8-9]。茶樹莖腐和枯萎病的發(fā)生不僅影響茶樹的生長，還會誘導(dǎo)茶樹次級代謝產(chǎn)物的變化，嚴重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，極大損害茶葉的經(jīng)濟效益[10-11]。

目前，國內(nèi)外利用生物防治手段抑制由腐皮鐮刀菌引起的植物病害的研究已經(jīng)取得一定進展。胡嫻等[12]從蘭花根部分離出鉤狀木霉菌（Trichoderma hamatum）LAN2B-1，其發(fā)酵液處理后的腐皮鐮刀菌菌絲可溶性蛋白和還原糖含量均顯著降低，對腐皮鐮刀菌的生長抑制率達到 59.38%；Kriaa等[13]從番茄中分離出一種塔賓曲霉菌（Aspergillus tubingensis），該曲霉產(chǎn)生的葡萄糖氧化酶可以抑制腐皮鐮刀菌菌絲的生長和產(chǎn)孢量；Moussa等[14]發(fā)現(xiàn)，70%的金霉素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）發(fā)酵液可以顯著抑制腐皮鐮刀菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長，在對甜菜種子進行菌劑包衣處理后，對由腐皮鐮刀菌引起的紋枯病防效顯著；Rojo等[15]的試驗結(jié)果表明，Trichoderma harzianum ITEM 3636和T.longibrachiatum ITEM 3635對花生根腐病有明顯的防治效果。目前，茶樹上抑制腐皮鐮刀菌效果較好的菌株尚未見報道。本研究篩選到一株生防效果良好的茶樹內(nèi)生菌株YB-1476，在此基礎(chǔ)上進一步檢測了菌株YB-1476的促生防病指標，旨在為該菌株的開發(fā)應(yīng)用及茶樹莖腐和枯萎病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生防菌株篩選所用茶樹葉片于2019年采摘自河南省信陽市新縣茶園，茶樹品種為信陽10號。病原真菌：腐皮鐮刀菌（F.solani），由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所分離、保藏。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

內(nèi)生細菌的分離純化采用LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基[16]，平板對峙采用 PDA（Potato dextrose agar）培養(yǎng)基，菌株溶磷測定使用無機磷（NBRIP）培養(yǎng)基[17]，產(chǎn)鐵載體使用鉻天青（CAS）固體培養(yǎng)基[18]，產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）能力測定采用Salkowski’s試劑[19]，產(chǎn)纖維素酶使用羧甲基纖維素鈉（CMC）固體培養(yǎng)基，β-1,3-葡聚糖酶活性檢測采用β-1,3-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基。

1.3 試驗方法

1.3.1 內(nèi)生細菌的分離和純化

茶樹葉片消毒方法：用75%的乙醇浸泡葉片2 min，無菌水沖洗3次，然后用滅菌的剪刀將葉片剪成約0.5 cm×0.5 cm的小片，轉(zhuǎn)移至無菌研缽中，加入少量的無菌水和滅菌的石英砂進行研磨。將磨碎的樣品分別進行10-1、10-2、10-3梯度稀釋后，分別取50 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)，24 h后挑取單菌落在LB固體培養(yǎng)基上劃線。

1.3.2 內(nèi)生細菌對病原菌的拮抗作用

兩點對峙法：用打孔器在PDA培養(yǎng)基上分別接種直徑0.5 cm的植物病原菌菌餅，在距離病原菌3 cm處對稱點接菌株YB-1476，并將未接內(nèi)生菌的平皿設(shè)置為對照組。28℃恒溫培養(yǎng)5 d后采用十字交叉法測量菌絲直徑，計算菌絲生長抑制率r1。

r1=(Dck—Dt)/Dck×100%

式中，Dck為對照組直徑，cm；Dt為處理組直徑，cm。

1.3.3 菌株YB-1476的鑒定

參照文獻[20]的方法對菌株YB-1476進行形態(tài)特征、生理生化特性、革蘭氏染色等試驗。

按照TaKaRa Bacteria Genomic DNA Extraction Kit說明書提取菌株YB-1476的基因組，并采用細菌通用引物27-F（5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492-R（5′-G GTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增16 S rRNA基因序列，引物gyrA-F（5′-CAGTCAGGAAA TGCGTACGTCCTT-3′）和gyrA-R（5′-CAAG GTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′）擴增gryA基因序列。然后將PCR產(chǎn)物送至尚亞生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對。采用Mega X進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，抽樣次數(shù)為1 000[21]。

1.3.4 菌株YB-1476的生防和促生指標測定

產(chǎn)IAA能力、產(chǎn)鐵載體能力和溶磷能力檢測參考文獻[22]，β-1,3-葡聚糖酶的活性檢測參考文獻[23]，纖維素酶活性的檢測參考文獻[24]。

1.3.5 發(fā)酵濾液對茶樹腐皮鐮刀菌菌絲生長量的影響

種子液的制備方法：將菌株YB-1476在LB固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃黑暗培養(yǎng)12 h后，用接種環(huán)挑取單克隆至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r·min-1搖至OD600為0.6作為種子液。

在50 mL的CMC培養(yǎng)基中接入1個直徑為0.5 cm的腐皮鐮刀菌菌餅，28℃，150 r·min-1搖瓶培養(yǎng)5 d后，用濾布將孢子收集到50 mL離心管中，計數(shù)后備用。接種1%的YB-1476種子液于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)20 h，經(jīng)0.22 μm的細菌過濾器除菌，將發(fā)酵濾液稀釋10倍和100倍備用。將孢子加入50 mL的PDB培養(yǎng)基中，將其終濃度調(diào)至1.0×105cfu·mL-1。設(shè)置3個處理組，分別加入發(fā)酵液原液、稀釋10倍發(fā)酵液和稀釋100倍發(fā)酵液各1 mL，加入等量LB培養(yǎng)基作為對照。28 ℃，150 r·min-1搖瓶培養(yǎng)12 h，將菌絲用濾布過濾收集后于60 ℃的烘箱中烘干，測定菌絲干質(zhì)量，每個處理3次重復(fù)，計算菌絲生長抑制率r2。

r2=(mck—mt)/mck×100%

式中，mck為對照菌絲干質(zhì)量，g；mt為處理菌絲干質(zhì)量，g。

1.3.6 揮發(fā)性物質(zhì)對茶樹腐皮鐮刀菌菌絲生長的影響

采用平板對扣法進行內(nèi)生細菌揮發(fā)性物質(zhì)抑菌試驗。在 LB固體培養(yǎng)基平板劃線培養(yǎng)菌株YB-1476，在PDA平板中央接種直徑為0.5 cm的腐皮鐮刀菌菌餅。LB固體培養(yǎng)基在下，PDA培養(yǎng)基在上，兩平板對扣后用封口膜封閉，3次重復(fù)，以空白LB平板為對照，28 ℃培養(yǎng)5 d后，十字交叉法測定真菌菌絲直徑，計算菌絲生長抑制率（r1）[25]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 25進行方差分析，并通過LSD法比較各處理間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌的分離篩選

從健康葉片中共分離出內(nèi)生細菌56株，通過平板對峙法獲得1株對腐皮鐮刀菌具有明顯抑制效果的菌株（圖1），抑制率為63.31%，編號為YB-1476。

圖1 菌株YB-1476對腐皮鐮刀菌的拮抗作用Fig.1 The inhibitory effect of strain YB-1476 on PDA plate of Fusarium solani

2.2 菌株YB-1476的鑒定

將菌株YB-1476在LB固體培養(yǎng)基上均勻涂布，于37 ℃過夜培養(yǎng)，觀察其菌落形態(tài)及顏色。菌株 YB-1476生長狀態(tài)良好，菌落直徑較小，白色不透明狀，表面無光澤，易挑起，有腥臭氣味（圖2A）。菌體桿狀有芽孢，為革蘭氏陽性菌（圖2B）。

圖2 菌株YB-1476的單菌落形態(tài)和顯微鏡形態(tài)Fig.2 Single colonies and microscopic morphology of strain YB-1476

生理生化鑒定結(jié)果如表 1所示，結(jié)合細胞形態(tài)特征和生理生化特性試驗結(jié)果，半乳糖、吲哚乙酸、甲基紅、D-木糖和檸檬酸鹽利用試驗為陰性，10% NaCl、D-果糖、甘油、乳糖、纖維二糖、淀粉水解酶、蔗糖、淀粉、明膠水解、V-P試驗和脲酶試驗均為陽性。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》，初步鑒定菌株YB-1476為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

表1 菌株YB-1476的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain YB-1476

以菌株YB-1476基因組DNA為模板擴增得到16 S rRNA和gyrA基因，將測序結(jié)果與GenBank中的序列進行比對。16 S rRNA分析結(jié)果顯示，YB-1476與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）的相似度為99%（圖3）。gyrA序列分析結(jié)果表明，菌株YB-1476的 gyrA序列與貝萊斯芽孢桿菌的同源性達100%（圖4）?；?6 S rRNA和gyrA基因采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明，YB-1476與貝萊斯芽孢桿菌處于進化樹的同一分支。因此，將 YB-1476菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖3 基于16 S rRNA序列構(gòu)建菌株YB-1476的系統(tǒng)進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain YB-1476 based on16 S rRNA gene sequences

圖4 基于gyrA基因序列構(gòu)建菌株YB-1476的系統(tǒng)進化樹Fig.4 The phylogenetic tree of strain YB-1476 based on gyrA gene sequences

2.3 菌株YB-1476的促生防病指標測定

經(jīng)過Salkowski比色法測定，YB-1476菌株具有產(chǎn)生IAA的能力（圖5A1和5A2）；YB-1476菌株在CAS培養(yǎng)基上生長，菌落周圍產(chǎn)生黃色透明圈，說明其具有產(chǎn)生鐵載體的能力（圖5B）；其在NBRIP固體培養(yǎng)基、β-1,3葡聚糖酶培養(yǎng)基和CMC培養(yǎng)基上均產(chǎn)生透明圈，說明YB-1476菌株具有溶磷能力和分泌β-1,3葡聚糖酶、纖維素酶的活性（圖5C、5D和5E）。

圖5 菌株YB-1476的促生防病指標Fig.5 Antifungal and growth-promoting traits of strain YB-1476

2.4 菌株YB-1476的抑菌譜

對峙試驗結(jié)果表明，菌株YB-1476對平臍蠕孢菌（Bipolaris sorokinana）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum PH-1）、念珠狀鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）、茄鏈格孢菌（Alternaria solani）均有明顯的抑制作用（圖6），抑菌率分別達(65.03±0.27)%、(42.32±0.23)%、(51.67±0.55)%、(52.33±0.39)%和(63.22±0.40)%。

圖6 菌株YB-1476對不同病原真菌的抑制作用Fig.6 Inhibitory activity of strain YB-1476 to different pathogens

2.5 菌株YB-1476發(fā)酵濾液和揮發(fā)性物質(zhì)對茶樹腐皮鐮刀菌菌絲生長量的影響

不同濃度的YB-1476發(fā)酵濾液對茶樹腐皮鐮刀菌菌絲生長量均有一定的抑制作用（表2），發(fā)酵濾液為原液時，菌絲干質(zhì)量接近對照的1/3，對菌絲生長量的抑菌率達到66.67%；當發(fā)酵濾液稀釋10倍時，菌絲干質(zhì)量接近對照的1/2，對菌絲生長量的抑菌率達到51.85%；隨著發(fā)酵濾液稀釋倍數(shù)增加，其抑菌率呈明顯下降趨勢，當發(fā)酵濾液稀釋100倍時，仍有18.52%的抑制效果。腐皮鐮刀菌和YB-1476通過對扣法培養(yǎng)5 d后，YB-1476對腐皮鐮刀菌的抑菌率達到53.37%（圖7），說明該菌株的揮發(fā)性物質(zhì)同樣對腐皮鐮刀菌的菌絲生長有明顯的抑制效果。

圖7 YB-1476與腐皮鐮刀菌的平皿對扣試驗Fig.7 Buckle-culture tests between YB-1476 and Fusarium solani

表2 YB-1476發(fā)酵濾液不同稀釋倍數(shù)對腐皮鐮刀菌菌絲生長的影響Table 2 Control efficiencies of different dilution multiples of the YB-1476 fermented liquid against Fusarium solani

3 討論

目前對茶樹病害常用的防治手段主要有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治。農(nóng)業(yè)防治，包括水肥管理、冬季清園、茶樹修剪等；化學(xué)防治主要指噴灑農(nóng)藥；生物防治是通過抗生素、真菌和細菌等生物資源對茶樹病害進行綜合治理[26-29]。農(nóng)業(yè)防治費時費力，化學(xué)防治易產(chǎn)生茶葉農(nóng)藥殘留問題[30]，生物防治不僅可以降低化學(xué)有害藥劑對生態(tài)環(huán)境的破壞，還可以有效控制作物病害，保證農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，有利于我國農(nóng)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展[31-32]。適量的菌肥可以增加土壤微生物的多樣性，改善土壤環(huán)境，緩解外部環(huán)境對植物的脅迫[33-36]。目前市面上防治茶樹主要病害的微生物菌肥數(shù)量有限，開發(fā)新的優(yōu)質(zhì)菌肥迫在眉睫，而篩選獲得新的高效生防菌株是菌肥開發(fā)的重要前提。

本研究篩選到的對腐皮鐮刀菌拮抗效果顯著的茶樹內(nèi)生菌株 YB-1476為貝萊斯芽孢桿菌。貝萊斯芽孢桿菌具有生物安全性，對細菌和真菌具有廣譜抑菌效果[37]。夏明聰?shù)萚38]研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌對小麥生長有促生增產(chǎn)效果，同時可以防治小麥紋枯??；Kim等[39]從人參根部土壤分離得到一株Bacillus velezensis AK-0，其次生代謝產(chǎn)物可以有效抑制蘋果果腐病的發(fā)生；Jiang等[40]篩選得到B.velezensis 5YN8和DSN012，其次級代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性物質(zhì)均對辣椒灰霉病有良好的防治效果。

菌株YB-1476具有產(chǎn)鐵載體和吲哚乙酸、分泌β-1,3-葡聚糖酶和纖維素酶及溶磷的能力。已有研究表明，菌株產(chǎn)生的鐵載體可與有害病原爭奪植物根系周圍土壤中的鐵元素，從而抑制有害病原菌的生長，間接促進植物的生長發(fā)育。生防菌產(chǎn)生的吲哚乙酸可以有效降低植物對重金屬的吸收，增加植物對重金屬的抗性，干擾重金屬離子在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運[41-44]。β-1,3-葡聚糖酶和纖維素酶是重要的細胞壁降解酶，能夠降解真菌細胞壁，抑制真菌的生長和繁殖，導(dǎo)致真菌病原體競爭活性下降。同時，水解過程中產(chǎn)生的寡糖也可以作為植物抗病反應(yīng)的激發(fā)因子，全面誘導(dǎo)植物的抗病反應(yīng)[45-46]。溶磷能力可將土壤中的難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，增加土壤中的養(yǎng)分，供植物直接吸收，促進植物的生長。因此推測，菌株YB-1476有效抑制腐皮鐮刀菌生長的同時可能通過促進植株的生長發(fā)育，增強茶樹的抗逆性。

研究表明，貝萊斯芽孢桿菌通過非核糖體途徑合成的環(huán)狀脂肽類物質(zhì)芽孢菌霉素D（Bacillomycin D）、豐元素A（Fengycin A）、芽孢柑橘素L（Bacillomycin L）和表面活性素（Surfactin）來抑制真菌菌絲的生長[47-49]。YB-1476的發(fā)酵濾液和揮發(fā)性物質(zhì)中均含有抑菌成分，但具體的抑菌物質(zhì)以及抑菌的機理亟需進一步鑒定和挖掘。