張淑霞，劉勝男，祝偉霞，封 琳，田 亞，宋麗亞，邢榮花

(鄭州海關(guān)技術(shù)中心，鄭州 450000)

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，真菌毒素的檢測方法和手段越來越多。目前有關(guān)糧食及其制品中真菌毒素的檢測主要有光譜法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、膠體金快速檢測法、高效液相色譜法(HPLC)[1-5]等。本研究采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道離子阱質(zhì)譜法建立小麥粉和玉米粉中35 種典型真菌毒素的篩查方法，采集了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)化合物色譜信息，通過高分辨質(zhì)譜正負(fù)離子切換FullMS/ddMS2掃描方式分析，獲得多種真菌毒素的保留時間、一級母離子和二級碎片離子精確質(zhì)量數(shù)，建立了35種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，并完成裂解途徑解析與特征碎裂片段篩選； 采用數(shù)據(jù)非依賴掃描，獲取可追溯的樣品質(zhì)譜信息，建立非定向篩查方法。該方法具有前處理簡單、檢測時間短、靈敏度和準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢，適用于大批量糧食及其制品中多種真菌毒素的快速篩查。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)，美國Millipore公司； Hettich Rotofix 32A離心機(jī)，德國Hettich公司；S10H型超聲波清洗器，德國Elma公司；Heidolph multi reax多功能振蕩器，德國 Heidolph公司；液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜(HPLC-Q-Exactive配Ultimate 3000液相色譜)，美國Thermo Fisher公司。

1.2 試劑與材料

甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國 ACS 恩科化學(xué)公司)；乙酸銨(色譜純，美國ThermoFisher Scientific公司)；35種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(濃度均為10 mg/L，天津阿爾塔科技有限公司)(表1)。玉米、小麥粉，購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場或超市。

表1 35種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫信息

1.3 方法

稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水-甲酸(84:15:1)混合提取溶液，超聲提取10 min，加入3 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉渦旋振蕩1 min，4 000 r/min離心5 min，移取4 mL上層溶液至試管，在40℃水浴下氮氣吹干，最后加入1 mL甲醇-水-甲酸(30+70+0.1)超聲溶解1 min，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，供HPLC-Q/Exactive測定。

1.4 基質(zhì)匹配溶液的配制

按照樣品的前處理方法處理2種不同基質(zhì)的空白樣品，得空白基質(zhì)溶液，取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用空白基質(zhì)溶液將其逐級稀釋，得到混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件 35種真菌毒素依據(jù)其化學(xué)性質(zhì)在正、負(fù)離子模式下同時進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，色譜條件如下：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS C18 SB色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：35℃；流動相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-1 mmol/L乙酸銨水溶液；流動相B為甲醇。色譜梯度為：0～2 min，10% B相；2～4 min，10% B～20% B相；4～5 min，20% B～26% B相；5～7 min，26% B相；7～10.5 min，26% B～60% B相；10.5～13.5 min，60% B相；13.5～14.5 min，60% B～95% B相；14.5～17 min，95% B相；17～18 min，95% B～10% B相；18～21 min，10% B相。流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 噴霧電壓：3 500 V；毛細(xì)管溫度：320℃；離子源加熱溫度：300℃；鞘氣流量：30 Arb，輔助氣流量10 Arb；質(zhì)譜掃描模式：Full MS/ddMS2(TopN)；全掃描分辨率：70 000 FWHM；AGC target：3e6；一級Maximum IT：100 ms，掃描范圍：70～800 m/z；二級分辨率：17 500 FWHM；AGC target：1e5；TopN：5；進(jìn)樣時間50 ms；當(dāng)待碎裂的離子響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到強(qiáng)度閾值2e4時，即送往高能碰撞解離碰撞池(HCD)進(jìn)行碰撞，碰撞池能量分別為17.5、35.0、52.5 eV。

1.5.3 數(shù)據(jù)分析 對質(zhì)譜采集到的原始.RAW圖譜文件，采用XCaliber 2.0、TraceFinder 3.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Msaa Frontier 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

甲醇和乙腈是目前常用的提取溶劑，由于甲醇溶解性強(qiáng)，易將樣品中的酸、蛋白、脂肪等物質(zhì)提取出來，而乙腈對不同極性的真菌毒素均有較好的溶解性，且其可沉淀蛋白，共提物較少，因此選用乙腈作為提取劑。由于35種真菌毒素大部分為中性和酸性物質(zhì)，提取溶液的pH值會影響真菌毒素的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響其回收率，加入1%甲酸能抑制待測酸性物質(zhì)離子化使其更多地溶于有機(jī)相，同時考慮真菌毒素的極性問題，選擇乙腈:水:甲酸(84:15:1)作為提取溶劑。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制35種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用高分辨質(zhì)譜正負(fù)離子切換FullMS/ddMS2掃描方式分析，根據(jù)目標(biāo)物分子式在正負(fù)模式和不同加合方式下分別計算精確質(zhì)量數(shù)，提取離子色譜圖，比較待測物在正負(fù)離子模式下的響應(yīng)強(qiáng)度和不同加合方式下的響應(yīng)強(qiáng)度。研究發(fā)現(xiàn)，玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇在負(fù)離子模式下響應(yīng)高，母離子均為[M-H]-；T-2毒素、HT-2毒素、15-乙?；撗跹└牭毒┐?、蛇形菌素和新茄病鐮刀菌烯醇在正離子模式下響應(yīng)高，母離子為[M+NH4]+；疣孢青霉原和T-2三醇的母離子為[M+Na]+；其余目標(biāo)物則均為[M+H]+模式信號更強(qiáng)。選擇質(zhì)譜信號響應(yīng)最佳的加合離子作為定量離子進(jìn)行分析，通過綜合考慮母離子精確質(zhì)量數(shù)、保留時間和二級碎片離子等相關(guān)信息進(jìn)行篩查確證，母離子峰面積定量，確保定性定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，35種真菌毒素相應(yīng)的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 35種真菌毒素提取離子色譜圖

2.3 二級碎片離子的選擇

將從ChemSpider化學(xué)數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)上下載的35種真菌毒素的結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入Mass Frontier 7.0軟件進(jìn)行模擬碎裂，研究其碎裂機(jī)理，并將結(jié)構(gòu)與采集的目標(biāo)物的二級碎片進(jìn)行匹配，選擇質(zhì)荷比較大且響應(yīng)較高的碎片離子為35種真菌毒素的特征碎片離子。以黃曲霉毒素G2為例，該化合物的裂解過程主要為電荷中心誘導(dǎo)的鍵斷裂(i斷裂)、電子遷移反應(yīng)和遠(yuǎn)端重排反應(yīng)(rHR)，脫去1個O后形成m/z313.070 66的碎裂片段(圖2)。圖3為采集的黃曲霉毒素G2的二級質(zhì)譜圖，紅色代表由Mass Frontier預(yù)測的碎片匹配，因此選取m/z313.070 41、m/z285.075 47和m/z245.080 81為其特征碎片離子。

圖2 黃曲霉毒素G2的部分碎裂途徑及其產(chǎn)生的碎裂片段

圖3 黃曲霉毒素G2的二級碎片離子與預(yù)測生成的碎片離子匹配圖

2.4 數(shù)據(jù)庫的建立及篩查確證方法參數(shù)設(shè)定

配制質(zhì)量濃度為500 μg/L的35種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用Full MS/dd-MS2掃描模式采集真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖，通過一級全掃描模式確定待測物母離子的精確質(zhì)量數(shù)和保留時間，同時通過自動觸發(fā)，設(shè)定3種不同碰撞能對強(qiáng)度大于2e4的母離子進(jìn)行碰撞，獲得豐富的二級碎片離子的質(zhì)荷比信息，構(gòu)建了目標(biāo)物的篩查譜庫，在本實驗儀器條件下35種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫信息見表1。

2.5 定性分析與篩查結(jié)果判斷

采用1.3的實驗方法進(jìn)行樣品測定，在5 ppm質(zhì)量窗口范圍內(nèi)進(jìn)行化合物提取，當(dāng)滿足母離子精確質(zhì)量數(shù)的質(zhì)量偏差≤5×10-6、碎片離子精確質(zhì)量數(shù)的質(zhì)量偏差≤10×10-6、保留時間偏差≤30 s、目標(biāo)物信號響應(yīng)S/N≥3、目標(biāo)物同位素豐度比偏差≤30%，且二級譜圖和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫相比，可以匹配上一級母離子和至少一個二級碎片離子等條件，且無空白基質(zhì)干擾，則可判斷樣品中可能檢出目標(biāo)物。以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇篩查為例，其提取離子流色譜圖見圖4A，由該圖可知脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的精確質(zhì)量數(shù)偏差<5 ppm，保留時間偏差為3.6 s。母離子同位素分布見圖4B，同位素比值與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇理論同位素分布匹配度為100%。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的3個二級碎片離子精確質(zhì)量誤差小于0.000 01Da，結(jié)果見圖4C。由此判斷樣品中含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。

圖4 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇篩查分析圖

2.6 定量分析方法的驗證

方法以母離子作為定量離子，空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。用基質(zhì)空白溶液逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至儀器能夠檢出的最低濃度為方法的檢出限，如表2所示，35種真菌毒素在各自線性濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，其檢出限滿足我國真菌毒素限量規(guī)定指標(biāo)。選擇玉米粉和小麥粉的空白樣品，分別添加20 μg/kg濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品處理方法進(jìn)行3次重復(fù)性試驗，回收率在60.1%～115.6%之間，變異系數(shù)在1.6%～18.2%之間，真菌毒素的回收率和變異系數(shù)均符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求。

表2 35種真菌毒素的線性范圍、檢出限、相關(guān)系數(shù)、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

2.7 實際樣品測定

采用所建立的方法篩查10個不同品種的玉米粉和小麥粉中的真菌毒素，其中4個樣品檢出了伏馬毒素B1，含量為17～417 μg/kg，其中3個樣品還同時檢出了伏馬毒素B2和伏馬毒素B3，含量均約為33 μg/kg；10個樣品均檢出了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，含量為17～220 μg/kg，4個樣品同時檢出了15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和3-乙?；撗跹└牭毒┐迹繛?～28 μg/kg，1個樣品檢出了玉米赤霉烯酮，含量約為6.8 μg/kg，其余真菌毒素均為未檢出。檢測結(jié)果提示，市售的玉米粉和小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢出率較高，但小于GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定的限量值，但仍應(yīng)給予持續(xù)關(guān)注。

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了玉米粉和小麥粉中35種真菌毒素的篩查數(shù)據(jù)庫，建立了基于液相色譜-四極桿/軌道阱質(zhì)譜技術(shù)同時測定玉米粉和小麥粉中35種真菌毒素的篩查確證和定量分析方法。與傳統(tǒng)的液質(zhì)聯(lián)用方法相比，本文建立的方法可實現(xiàn)正負(fù)離子模式同時掃描，具有分析速度快、靈敏度高、質(zhì)量精度高的特點，且方法線性范圍、檢出限、回收率及精密度滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，可用于多種真菌毒素的篩查確證和定量檢測，為真菌毒素污染風(fēng)險監(jiān)測和評估提供有效的技術(shù)支撐。