郭雨軒，陳 騁，師希雄，郭兆斌，馬國源，馬紀兵，余群力

（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

宰后成熟過程中以糖酵解為主要途徑的能量代謝反應對牛肉品質(zhì)的形成起至關(guān)重要的作用[1]。屠宰后缺氧迫使肌肉細胞啟動缺氧應答反應，通過糖酵解維持細胞能量供應，該過程引起肌肉pH值變化進而對嫩度、保水性、色澤、風味等關(guān)鍵品質(zhì)產(chǎn)生重要影響[2]。目前，大量學者基于飼喂管理、屠宰工藝以及宰后成熟等不同角度，對調(diào)控糖酵解反應的因素進行了全面研究。例如，采用電刺激處理提升宰后成熟過程中牦牛肉能量代謝水平，加速pH值降低繼而促進牦牛肉骨架蛋白質(zhì)降解，有利于牦牛肉嫩度的改善[3]。飼料中添加直鏈淀粉以提升宰后能量代謝底物濃度和關(guān)鍵酶活性，間接調(diào)節(jié)pH值變化速率從而影響肌肉的保水性[4]。但是，宰后成熟過程中牛肉能量代謝受到宰前、屠宰及成熟環(huán)節(jié)眾多因素的影響，現(xiàn)有研究尚不能完全解釋宰后能量代謝的調(diào)控機理。

缺氧狀態(tài)下，肌肉細胞能量代謝方式向糖酵解的轉(zhuǎn)變依賴于蛋白質(zhì)的表達。缺氧誘導因子-1（hypoxiainducible factor-1，HIF-1）作為細胞缺氧條件下能量代謝的重要調(diào)控因子，其氧敏感的亞基HIF-1α直接調(diào)控大多數(shù)糖酵解酶的表達或激活[5-6]。供氧正常時，HIF-1α被脯氨酰羥化酶（prolineamide hydroxylase，PHD）降解，反之HIF-1α則正常表達并上調(diào)糖酵解酶表達，促使細胞能量代謝轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒鈁7]。近期研究認為，細胞缺氧應激過程中ROS通過信號傳導功能對糖酵解反應的啟動表現(xiàn)出重要調(diào)控作用。缺氧導致肌肉細胞線粒體的電子傳遞受阻而產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），部分ROS擴散至細胞質(zhì)中作為信號傳導分子調(diào)控多種細胞生理反應，其中就包括細胞能量代謝[8]。目前，ROS介導HIF-1α調(diào)控細胞能量代謝主要有2 種途徑：一是ROS通過細胞氧化修飾作用引起PHD活力降低，抑制PHD對HIF-1α的降解作用，促進HIF-1α穩(wěn)定積累[9]；二是ROS能夠激活磷酸肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）并促進蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）磷酸化，磷酸化AKT（p-AKT）調(diào)控HIF-1α穩(wěn)定表達并與細胞缺氧反應元件（hypoxia response elements，HRE）結(jié)合，進而啟動糖酵解反應[10]。但是，宰后成熟過程中牛肉細胞糖酵解反應的調(diào)控是否依賴于上述機制還有待研究。

因此，本研究選取牛背最長肌，采用ROS激活劑H2O2、清除劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）和生理鹽水處理后，在溫度為4 ℃、相對濕度為85%條件下成熟，依次在第0.5、6、12、24、48小時測定ROS細胞分布及含量、PHD活力、PI3K/AKT信號通路表達水平、HIF-1α細胞聚集和表達水平、糖原含量、R值以及pH值變化水平，進而探究ROS含量對宰后成熟初期牛肉代謝水平的調(diào)控機制，以期為進一步明確宰后牛肉品質(zhì)形成及調(diào)控機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平均年齡3 歲、體質(zhì)量（500±50）kg、飼養(yǎng)條件相同、健康無病的安格斯雜交公牛6 頭，選自甘肅康美現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)集團有限公司。

糖原、次黃苷酸、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷含量檢測試劑盒、PHD活力檢測試劑盒 上海梵態(tài)生物科技有限公司；PI3K、p-AKT、HIF-1α、肌動蛋白多克隆抗體（一抗）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、Cy3標記的山羊抗兔IgG（二抗）、聚偏二氟乙烯膜、NAC上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、H2O2北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FV1200激光共聚焦顯微鏡 日本奧林巴斯公司；GelDoc-It310凝膠成像系統(tǒng) 美國耶拿分析有限公司；Aperio GT450智能數(shù)字掃描儀 上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；DYCZ-25D電泳儀 濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；MK-40A離心機 湖南邁克爾實驗儀器有限公司；R255自動切片機 湖北泰維科技實業(yè)股份有限公司；HS-1145生物組織攤片機 金華華速科技有限公司；UV755B紫外-可見分光光度計 上海荊和分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集與處理

肉牛屠宰前24 h禁食、6 h禁水，采用擊暈聯(lián)合三管齊斷法屠宰，降低屠宰應激引起的糖原過度消耗。宰后45 min內(nèi)取背最長肌，切割成厚約3 cm、質(zhì)量約200 g的肉塊。將肉樣分成H2O2處理組、NAC處理組及對照組，分別按照肉液比10∶1（g/mL）均勻注射20 mmol/L H2O2溶液、20 mmol/L NAC溶液和0.9%生理鹽水。樣品置于溫度4 ℃、相對濕度85%條件下成熟，分別在0.5、6、12、24、48 h測定pH值并立即采用液氮速凍，然后在-80 ℃條件下保存。

1.3.2 ROS含量測定

參考張玉林[11]的方法制備和封閉切片，滴加ROS熒光探針，37 ℃條件下孵育60 min。然后加入DAPI染色，避光反應3 min顯核，用磷酸緩沖液洗去DAPI，甘油封片后立即使用共聚焦顯微鏡拍照觀察ROS的細胞分布情況。ROS熒光強度使用ImageJ進行分析，并以單位面積的熒光強度表示ROS含量。

1.3.3 PHD活力測定

參考Kaluz等[12]的方法，稱取1 g肉樣剪碎，加入9 mL磷酸鹽緩沖液，冰浴勻漿，在6000×g、4 ℃條件下離心10 min，使用PHD活力試劑盒檢測上清液PHD活力。PHD活力表示為每克肌肉組織中的酶活力單位數(shù)（U）。

1.3.4 PI3K/AKT信號通路表達水平測定

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法測定PI3K/AKT信號通路表達水平。參考Jia Zhen等[13]的方法分離目標蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，封閉60 min后加入相應一抗（1∶1000），孵育過夜，再加入相應二抗（1∶500）避光反應60 min。完成后經(jīng)試劑盒發(fā)光，采用凝膠成像系統(tǒng)和化學發(fā)光系統(tǒng)進行定量分析，以目的蛋白和標準蛋白灰度的比值表示蛋白表達水平。

1.3.5 HIF-1α細胞聚集與表達水平測定

采用單標免疫熒光法分析HIF-1α細胞聚集與表達水平。參考Federico等[14]的方法制備切片（4 μm），切片采用由高到低不同濃度的乙醇進行洗滌，然后用抗原修復液修復并以5%的BSA封閉。加入相應一抗（1∶500），搖床孵育過夜，再加入相應二抗（1∶100），避光反應60 min。加入染色液反應10 min后滴加淬滅劑孵育5 min，封片處理。立即使用全景切片掃描儀拍照觀察。HIF-1α細胞聚集情況以陽性細胞的熒光強度表示。

1.3.6 能量代謝指標測定

樣品處理和R值計算參考Wicks等[15]的方法，稱取2 g肉樣，加入18 mL提取液，高速間歇式勻漿，勻漿液以4 ℃、6000×g離心20 min，收集上清液。分別按照試劑盒說明書測定上清液中糖原、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、次黃苷酸含量。其中，R值按下式計算：

式中：A為二磷酸腺苷含量/（μmol/g）；B為次黃苷酸含量/（μmol/g）；C為三磷酸腺苷含量/（μmol/g）。

1.3.7 pH值測定

參照邢通[16]的方法，使用便捷式pH計進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 ROS含量變化

肌肉細胞中ROS一方面作為重要的信號分子參與調(diào)控多種細胞生理反應，另一方面作為細胞毒性分子，通過加速脂質(zhì)過氧化反應導致ROS不斷積累[17]。從圖1可以看出，成熟0.5 h，H2O2處理組的ROS熒光強度（圖中綠色標記）略強于對照組與NAC處理組，但隨著成熟時間的延長，H2O2處理組的熒光強度顯著強于其他2 組。由圖2可以看出，3 組樣品中ROS含量整體呈顯著升高趨勢（P＜0.05）。其中，外源H2O2處理能夠顯著提升牛肉初始ROS含量，H2O2處理組成熟0.5 h ROS含量分別是對照組和NAC處理組的1.52、1.77 倍（P＜0.05），并在48 h內(nèi)顯著高于其他2 組（P＜0.05）。同時，NAC處理組能夠在0.5～12 h內(nèi)顯著抑制ROS的積累，但是隨成熟時間延長，ROS含量也出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05）。ROS可作為信號分子參與細胞存活和代謝過程的調(diào)控，張佳瑩[18]發(fā)現(xiàn)宰后初期ROS作為上游信號分子通過線粒體細胞凋亡級聯(lián)反應，加快細胞凋亡進而促進牛肉結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)降解，間接促進牛肉嫩化進程。劉瑜[19]發(fā)現(xiàn)細胞凋亡誘導因子可以顯著提升小鼠肌肉細胞中ROS含量，且ROS積累加速HIF-1α聚集進而影響細胞的能量代謝水平，但具體調(diào)控機制尚未清楚。由此可見，宰后成熟初期缺氧應激誘導ROS生成，較高的初始濃度能夠促進ROS在牛肉中快速積累，并可能對細胞能量代謝發(fā)揮調(diào)控作用。

圖1 宰后成熟過程中牛肉中ROS細胞分布變化（×400）Fig.1 Changes in the cellular distribution of ROS in postmortem bovine muscle (× 400)

圖2 宰后成熟過程中牛肉中ROS含量變化Fig.2 Changes in ROS content in bovine muscle during postmortem aging

2.2 PHD活力變化

PHD在供氧正常的細胞中通過降解HIF-1α而抑制其對糖酵解反應的激活作用[20]。為探究宰后缺氧狀態(tài)下ROS對HIF-1α降解酶PHD的作用，分析宰后成熟過程中不同ROS含量條件下牛肉PHD活力的變化。從圖3可以看出，3 組樣品PHD活力隨宰后成熟時間的延長呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。不同的是，H2O2處理組PHD活力在0.5～48 h顯著低于其余2 組（P＜0.05），并在24 h降低到最低水平（22.15 U/g），分別比對照組和NAC處理組降低30.11%和42.03%（P＜0.05）。而NAC處理能夠在0.5～12 h內(nèi)延緩PHD活力的降低，這可能歸因于NAC在宰后初期（0.5～12 h）對ROS的抑制作用（圖2）。Liu Yang等[21]發(fā)現(xiàn)當細胞處于低氧環(huán)境時，ROS大量產(chǎn)生并抑制PHD活力，同時檢測到HIF-1α表達水平上升，而當恢復供氧后，HIF-1α表達水平迅速下降。供氧正常細胞中，PHD的羥基化作用將HIF-1α修飾標記，后者被希佩爾-林道病蛋白靶向降解[22]。而在缺氧細胞中，不斷產(chǎn)生的ROS通過氧化修飾作用破壞PHD的活性位點，導致酶活力降低，從而抑制了HIF-1α的降解，為HIF-1α發(fā)揮能量代謝調(diào)節(jié)作用提供了必要條件[23-24]。本研究結(jié)果表明，宰后成熟過程中牛肉產(chǎn)生的ROS對PHD活力具備抑制作用，有利于HIF-1α的穩(wěn)定積累。

圖3 宰后成熟過程中牛肉中PHD活力變化Fig.3 Changes in PHD activity in bovine muscle during postmortem aging

2.3 PI3K/AKT信號通路表達水平變化

PI3K/AKT作為調(diào)控HIF-1α穩(wěn)定表達的關(guān)鍵信號通路，在細胞缺氧的能量代謝中具有重要作用[25]。從圖4a、b可以看出，在6～48 h內(nèi)，不同ROS水平下PI3K的表達水平存在顯著差異（P＜0.05），H2O2處理組PI3K表達水平在0.5 h分別是對照組和NAC處理組的2.39 倍和2.95 倍，在0.5～12 h內(nèi)上調(diào)42.63%，且顯著高于其他2 組（P＜0.05）。從圖4c、d可以看出，在0.5 h時，H2O2處理組p-AKT表達水平分別是對照組和NAC組的2.62 倍和4.87 倍（P＜0.05），并在0～6 h內(nèi)顯著高于其他2 組（P＜0.05）。這可能是由于H2O2處理組PI3K在相應時間區(qū)間（0.5～12 h）內(nèi)顯著上調(diào)，進而迅速靶向調(diào)控AKT磷酸化引起，同時也說明成熟初期PI3K/AKT信號通路的激活依賴于ROS的積累。PI3K/AKT是一種特殊的信號通路復合體，PI3K靶向調(diào)控AKT磷酸化形成具有活性的p-AKT，后者進一步誘導和活化HIF-1α，以提升HIF-1α的穩(wěn)定性[26]。近期研究發(fā)現(xiàn)，ROS的抑制劑人參皂苷Rk1可以減緩PI3K/AKT信號通路的激活，通過削弱AKT磷酸化水平進而降低能量代謝水平[27]。相反地，紅景天苷能夠提升PI3K/AKT信號通路活化水平，進而促進HIF-1α穩(wěn)定表達以加速細胞能量代謝方式的轉(zhuǎn)換[28]。也有研究發(fā)現(xiàn)，通過激活嘌呤核苷磷酸化酶能加速ROS的積累，進而提升p-AKT表達，增加HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平以維持代謝的完整性[29-30]。本研究中較高的初始ROS含量顯著加速PI3K/AKT通路的激活，結(jié)合ROS對PHD活力的抑制作用（圖3），表明宰后成熟初期ROS積累為HIF-1α的穩(wěn)定表達提供了必要條件。

圖4 宰后成熟過程中牛肉中PI3K和p-AKT表達水平變化Fig.4 Changes in PI3K and p-AKT expression levels in bovine muscle during postmortem aging

2.4 HIF-1α的細胞聚集與表達水平變化

HIF-1α作為糖酵解反應的上游轉(zhuǎn)錄因子在細胞缺氧應答過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在缺氧條件下HIF-1α能夠激活90%以上的糖酵解酶和其他關(guān)鍵蛋白質(zhì)[31]。為了明確ROS對成熟初期牛肉HIF-1α表達水平的影響，進一步分析宰后成熟過程中牛肉HIF-1α聚集情況與表達水平變化。從圖5可以看出，3 組樣品HIF-1α在0.5 h時聚集程度（圖中紅色標記）不明顯，但隨著宰后成熟時間的延長，HIF-1α聚集程度不斷升高。H2O2處理組HIF-1α聚集程度明顯高于對照組和NAC處理組。如圖6所示，宰后成熟0.5～24 h內(nèi)H2O2處理組和對照組HIF-1α表達水平均顯著升高（P＜0.05），NAC處理組HIF-1α表達水平在0.5～12 h被抑制，在12～24 h出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05）。此外，H2O2處理組HIF-1α表達水平在24 h時分別是對照組和NAC組的1.34 倍和1.81 倍，并且在6～48 h內(nèi)保持顯著較高水平（P＜0.05）。上述結(jié)果證實ROS能夠促進宰后成熟初期牛肉中HIF-1α穩(wěn)定表達，這可能是ROS通過抑制PHD活力（圖3）和激活PI3K/AKT信號通路（圖4）的綜合作用機制實現(xiàn)。HIF-1α在缺氧細胞中穩(wěn)定表達并向細胞核轉(zhuǎn)移，迅速調(diào)控HRE中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白以及多種糖酵解酶的表達，進而上調(diào)糖酵解反應通量以維持細胞能量供應[32]。此外，Paik等[33]發(fā)現(xiàn)ROS（特別是H2O2）能夠誘導細胞中HIF-1α表達，間接激活己糖激酶和磷酸果糖激酶2 種糖酵解限速酶，進而顯著提升細胞糖酵解供能效率。因此，宰后成熟初期產(chǎn)生的ROS作為信號分子調(diào)控HIF-1α表達并積累，可能對牛肉糖酵解能量代謝表現(xiàn)出調(diào)控作用。

圖5 宰后成熟過程中牛肉HIF-1α細胞聚集變化情況（×200）Fig.5 Changes in cellular aggregation of HIF-1α in bovine muscle during postmortem aging (× 200)

圖6 宰后成熟過程中牛肉HIF-1α表達水平變化Fig.6 Changes in HIF-1α expression level in bovine muscle during postmortem aging

2.5 能量代謝水平變化

為明確ROS介導HIF-1α表達對能量代謝水平的影響，分別對糖酵解底物糖原含量和能量變化水平R值進行測定。圖7a中，3 組樣品糖原含量均呈現(xiàn)顯著下降趨勢（P＜0.05）。其中，H2O2處理組糖原含量在6～24 h顯著低于其他2 組，且在24 h內(nèi)下降到最低水平（P＜0.05），比其他2 組提前了24 h。而NAC組糖原含量下降速率相對較低，在6～48 h內(nèi)保持顯著較高水平（P＜0.05）。上述結(jié)果表明ROS能夠加速宰后初期牛肉糖酵解速率，NAC處理則對糖酵解反應表現(xiàn)出一定的抑制作用。這種影響同時也體現(xiàn)在R值變化特征上，R值是糖酵解過程中三磷酸腺苷供能后分解形成的產(chǎn)物二磷酸腺苷和次黃苷酸與自身含量的比值，R值越高表明能量代謝水平越高[34]。從圖7b可以看出，3 組樣品R值隨宰后成熟時間延長而顯著升高（P＜0.05）。其中，H2O2處理組R值在6～24 h內(nèi)顯著高于其他2 組（P＜0.05），這與圖7a中糖原含量變化相對應，表明ROS能夠提升宰后成熟初期牛肉糖酵解供能效率。對比3 組樣品，H2O2處理組PHD活力、PI3K、p-AKT表達水平在宰后0.5 h就表現(xiàn)出顯著差異（圖3、4），而HIF-1α表達和能量代謝水平的差異性則出現(xiàn)在6 h（圖6、7），進一步證實ROS作為上游信號分子，通過級聯(lián)反應介導HIF-1α表達，逐步調(diào)控和活化糖酵解供能途徑。在醫(yī)學領(lǐng)域，楊威[35]發(fā)現(xiàn)當清除肝癌細胞中的ROS后，HIF-1α表達量降低，下游葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達水平和糖酵解限速酶活性也隨之降低，最終導致糖酵解速率減慢。Feng Xiaomeng等[36]發(fā)現(xiàn)缺氧條件下細胞中上游信號分子ROS的增加導致HIF-1α穩(wěn)定聚集，促進了糖原消耗和R值升高。結(jié)合本實驗的結(jié)果，宰后成熟初期牛肉中ROS的積累促進HIF-1α穩(wěn)定表達，能夠顯著提升牛肉的能量代謝水平。

圖7 宰后成熟過程中牛肉糖原含量和R值變化Fig.7 Changes in glycogen content and R value in bovine muscle during postmortem aging

2.6 pH值變化

糖酵解反應供能過程中，糖原經(jīng)酶促反應轉(zhuǎn)化為乳酸，引起pH值下降直接影響肌肉的色澤、嫩度、保水性等重品質(zhì)，因此pH值常用作評價肉品質(zhì)的重要指標之一[37]。由圖8可以看出，3 組樣品在0.5 h時pH值差異不顯著，但在成熟過程中均呈現(xiàn)下降趨勢（P＜0.05）。其中，H2O2處理組pH值在6～12 h內(nèi)顯著低于其他2 組（P＜0.05），并且在第12小時達到極限pH值，分別比對照組和NAC處理組提前了12 h和36 h。pH值的變化規(guī)律與糖原消耗水平（圖7a）保持一致，進一步說明ROS對牛肉能量代謝的調(diào)控作用直接影響pH值變化速率。pH值在正常范圍內(nèi)快速降低能夠縮短牛肉宰后僵直時間，從而有利于加速肌肉成熟嫩化進程，對改善肉的嫩度、降低水分流失、延緩肉色劣變具有重要意義[38]。此外，肌肉成熟過程中，pH值的降低對糖酵解限速酶活性產(chǎn)生反向抑制作用，加之糖原消耗導致底物供應不足，最終使肌肉能量代謝速率減弱、pH值不再降低[39]，這也解釋本實驗不同處理組在48 h時糖原含量、R值以及pH值達到相近水平，表明ROS對宰后成熟初期能量代謝的調(diào)控作用表現(xiàn)在提升能量代謝速率而非程度。然而，上述調(diào)控作用對牛肉關(guān)鍵品質(zhì)影響也有待進一步研究。

圖8 宰后成熟過程中牛肉pH值變化Fig.8 Changes in pH in bovine muscle during postmortem aging

3 結(jié)論

宰后成熟過程中牛肉會不可避免地產(chǎn)生ROS，其一方面抑制PHD活力，減少了對HIF-1α的降解作用；另一方面能夠迅速激活PI3K/AKT信號通路，加速了HIF-1α的穩(wěn)定積累。HIF-1α作為重要的能量代謝調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，通過加速糖原消耗顯著提升牛肉能量代謝水平，促使牛肉在短時間達到極限pH值。同時，由于成熟過程中糖原的快速消耗和pH值降低對糖酵解反應的反向抑制作用，ROS介導HIF-1α對能量代謝的調(diào)控作用局限于加速宰后成熟初期能量代謝。上述結(jié)論有助于完善宰后成熟初期牛肉能量代謝的調(diào)控機理，為牛肉品質(zhì)改善技術(shù)的研發(fā)提供理論依據(jù)。