萬(wàn)鵬聰，張俊，杜晨暉，梁惠珍，裴香萍

山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院（晉中 030619）

沙棘異功方是以《小兒藥證直訣》中的經(jīng)典方“異功散”為基礎(chǔ)，由沙棘、炙甘草、陳皮、黨參、炒白術(shù)、茯苓等藥味組成，具有健脾消食、行氣化滯、止咳祛痰的功效，臨床用于治療因小兒脾胃氣虛引起的食積、厭食、咳嗽等癥。方中多數(shù)藥味所含的總黃酮成分具有良好的抗氧化能力[1-8]。而且益氣健脾中藥（如黨參、甘草）中的黃酮類成分對(duì)修復(fù)胃腸黏膜損傷有較好的藥理活性，可用于治療胃腸疾病[9]。沙棘中的黃酮類成分（如原花青素類）對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍具有保護(hù)作用[10]。廣陳皮中的多甲氧基黃酮類化合物（如川陳皮素和橘皮素）能夠增強(qiáng)腸蠕動(dòng)，具有促消化功能[11]。文章采用大孔樹(shù)脂吸附法對(duì)沙棘異功方水提取物中的總黃酮進(jìn)行分離純化，并比較分析大孔樹(shù)脂純化前后總黃酮的抗氧化能力，為后續(xù)有效部位的藥效學(xué)試驗(yàn)研究提供理論依據(jù)，也為以該復(fù)方為基礎(chǔ)研發(fā)的相關(guān)制劑研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CP214分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；ALC-210.4電子分析天平（上海精密儀表有限公司）；HH-2恒溫水浴箱（金壇市杰瑞爾有限公司）；BGZ-30數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；SB-800 DTD超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Ultra-3660型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普源精電科技有限公司）。

1.2 藥材與試劑

炙甘草、黨參、陳皮（山西元和堂中藥有限公司）；炒白術(shù)、茯苓（山西維康堂中藥飲片有限公司）；沙棘（新疆塔城誠(chéng)信藥業(yè)），由山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室的裴香萍教授鑒定，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部項(xiàng)下規(guī)定。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-202012，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

無(wú)水乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；亞硝酸鈉（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；硝酸鋁（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（天津市北辰方正試劑廠）；鄰二氮菲、硫酸亞鐵（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；雙氧水（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海伊卡生物技術(shù)有限公司）；2, 6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT，北京索萊寶科技有限公司）；磷酸緩沖溶液（PBS溶液，北京索萊寶生物科技有限公司）；水為蒸餾水，試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測(cè)定方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取5.15 mg蘆丁對(duì)照品，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備

按照處方比例稱取36 g沙棘、24 g炙甘草、24 g陳皮、24 g黨參、24 g炒白術(shù)、24 g茯苓，加10倍量水，煎煮2次，每次30 min，濾過(guò)，合并濾液，濃縮，濃縮液置1 000 mL容量瓶中，加水定容至刻度，再精密量取500 mL，置1 000 mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[12]

精密量取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0和2.4 mL對(duì)照品溶液，分別置10 mL帶塞試管中，各加水至2.4 mL，加0.4 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min，加0.4 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min，加4 mL 4% NaOH溶液，再加2.8 mL水，搖勻，放置15 min，以第1支試管為空白，在500 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：y=9.621 8x+0.137，r=0.998 4。說(shuō)明蘆丁在0.008～0.049 mg/mL內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取1.2 mL蘆丁對(duì)照品溶液，置10 mL帶塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)2.1.3小節(jié)操作，在500 nm處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定6次，結(jié)果顯示：吸光度的SRSD為0.26%（n=6）。表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取0.2 mL供試品溶液，置10 mL帶塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)2.1.3小節(jié)操作，分別在0，30，60，90，120和150 min測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示：吸光度的SRSD為2.14%（n=6）。表明供試品溶液在150 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按照處方比例稱取適量各復(fù)方藥材，共6份，按照2.1.2小節(jié)中供試品溶液的制備方法制備，精密吸取0.2 mL，置10 mL的帶塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)2.1.3小節(jié)操作，在500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算復(fù)方藥材中總黃酮含量。結(jié)果顯示：平均含量為13.05 mg/g（n=6），SRSD為1.85%（n=6）。說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn)

按照處方比例稱取1/2量的重復(fù)性試驗(yàn)所使用的復(fù)方各藥材，共6份，再加入10.0 mg蘆丁對(duì)照品，按照2.1.2小節(jié)中供試品溶液的制備方法制備，再精密吸取0.2 mL供試品溶液，置10 mL的帶塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)2.1.3小節(jié)操作，在500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.1.8 樣品測(cè)定

按照處方比例稱取適量各復(fù)方藥材，共3份，按照2.1.2小節(jié)中供試品溶液的制備方法制備，精密吸取0.2 mL，置10 mL的帶塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)2.1.3小節(jié)操作，在500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算復(fù)方藥材中總黃酮含量。結(jié)果顯示，總黃酮含量為12.85，13.37和13.51 mg/g。

2.2 總黃酮的純化工藝研究

2.2.1 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理[13]

將大孔樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后用水洗至無(wú)醇味，然后用5% HCl溶液浸泡2～3 h，用水洗至中性，再用5% NaOH溶液浸泡2～3 h，最后用水洗至中性，備用。

2.2.2 大孔樹(shù)脂的選擇

分別精密稱取已處理好的5種大孔樹(shù)脂，各1 g，置100 mL具塞三角瓶中，分別精密加入20 mL供試品溶液，室溫下放置吸附24 h，不時(shí)振搖，精密吸取1 mL上清液置10 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，搖勻。再精密吸取2 mL至10 mL具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法制備，在500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮的吸附率[14]。將吸附試驗(yàn)抽濾后的大孔樹(shù)脂放入100 mL具塞三角瓶中，加30 mL 60%乙醇進(jìn)行洗脫，室溫下放置解吸24 h，不時(shí)振搖，精密吸取1 mL上清液置10 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，再精密吸取2 mL置10 mL具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法制備，在500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮解析率[14]。結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)分析，選擇DM301型大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化。

表2 大孔樹(shù)脂篩選結(jié)果 單位：%

2.2.3 上樣濃度的考察

將5 g已處理好的DM301型大孔樹(shù)脂裝入色譜柱（內(nèi)徑為1.3 cm）中，共5份，分別加入質(zhì)量濃度為0.553，1.106，1.659，2.212和2.765 mg/mL的供試品溶液，各30 mL，以流速2 mL/min進(jìn)行吸附，之后用水洗至流出液無(wú)色，合并收集到的流出液，按2.1.3小節(jié)的方法進(jìn)行制備，測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附率。結(jié)果見(jiàn)圖1。質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL時(shí)，吸附率為60.89%，達(dá)到最大，故上樣質(zhì)量濃度選擇2.212 mg/mL。

圖1 上樣濃度的考察

2.2.4 上樣體積的考察

將5 g已處理好的DM301型大孔樹(shù)脂裝入色譜柱（內(nèi)徑為1.3 cm）中，加入供試品溶液（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL），以流速2 mL/min進(jìn)行吸附，收集流出液，每5 mL收集1份，按2.1.3小節(jié)的方法進(jìn)行制備，測(cè)定吸光度，計(jì)算流出液中總黃酮的泄漏量。結(jié)果見(jiàn)圖2?？傸S酮泄漏量隨著上樣體積的增加逐漸增多，當(dāng)上樣體積從25 mL增加至30 mL時(shí)，泄漏量從6.168 3 mg迅速上升至14.420 4 mg，樹(shù)脂達(dá)到飽和吸附，為了減少總黃酮的損失，故上樣體積選擇25 mL（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL）。

圖2 上樣體積的考察

2.2.5 上樣流速的考察

9、《關(guān)于進(jìn)一步落實(shí)重點(diǎn)群體創(chuàng)業(yè)就業(yè)稅收政策的通知》。11月23日，為支持和促進(jìn)重點(diǎn)群體創(chuàng)業(yè)就業(yè)，財(cái)政部、稅務(wù)總局、人力資源社會(huì)保障部財(cái)政部等三部門(mén)下發(fā)《關(guān)于進(jìn)一步落實(shí)重點(diǎn)群體創(chuàng)業(yè)就業(yè)稅收政策的通知》（財(cái)稅〔2018〕136號(hào)），就政策落實(shí)提出具體要求。

將5 g已處理好的DM301型大孔樹(shù)脂裝入色譜柱（內(nèi)徑為1.3 cm）中，共5份，分別加入25 mL供試品溶液（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL），以流速1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL/min進(jìn)行吸附，之后用水洗至流出液無(wú)色，合并收集到的流出液，按2.1.3小節(jié)的方法進(jìn)行制備，測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附率。結(jié)果見(jiàn)圖3。流速為1.0 mL/min時(shí)總黃酮的吸附率最大，故選1.0 mL/min作為最佳上樣流速。

圖3 上樣流速的考察

2.2.6 洗脫溶劑的考察

將5 g已處理好的DM301型大孔樹(shù)脂裝入色譜柱（內(nèi)徑為1.3 cm）中，共5份，分別加入25 mL供試品溶液（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL），以流速1.0 mL/min進(jìn)行吸附，之后用水洗至流出液無(wú)色，再分別加入30 mL 20%，40%，60%，80%和95%乙醇，以流速2.0 mL/min進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，按2.1.3小節(jié)的方法進(jìn)行制備，測(cè)定吸光度，計(jì)算解吸率。結(jié)果見(jiàn)圖4。80%的乙醇洗脫時(shí)解吸率最大，因此選用80%乙醇作為洗脫劑。

圖4 洗脫溶劑的考察

2.2.7 洗脫流速的考察

將5 g已處理好的DM301型大孔樹(shù)脂裝入色譜柱（內(nèi)徑為1.3 cm）中，共5份，分別加入25 mL供試品溶液（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL），以流速1.0 mL/min進(jìn)行吸附，之后用水洗至流出液無(wú)色，再加入30 mL 80%乙醇，分別以流速1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL/min進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，按2.1.3小節(jié)的方法進(jìn)行制備，測(cè)定吸光度，計(jì)算解吸率。結(jié)果見(jiàn)圖5。流速在3 mL/min時(shí)，解吸率達(dá)到最大，因此選3 mL/min為最佳洗脫流速。

圖5 洗脫流速的考察

2.2.8 洗脫劑體積的考察

圖6 洗脫劑體積的考察

2.2.9 工藝驗(yàn)證

按照上述最佳純化工藝條件進(jìn)行裝柱、上樣、洗脫、收集洗脫液、回收乙醇、減壓干燥，即得純化后干膏。取適量供試品溶液（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL），濃縮，減壓干燥，即得純化前干膏。分別精密稱取適量純化前、后干膏，各3份，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。由結(jié)果可知：純化前干膏中總黃酮含量分別為5.20%，5.44%和5.78%，平均含量為5.47%（n=3）；純化后干膏中總黃酮含量分別為48.10%，53.28%和54.33%，平均含量為51.90%（n=3）。

2.3 總黃酮的抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

精密稱取5 mg DPPH置100 mL棕色容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解，并定容至刻度，避光備用。分別精密吸取2 mL不同濃度的BHT乙醇溶液和純化前、后的樣品溶液（20，40，60，80和100 μg/mL），加2 mL DPPH溶液，混勻，放在暗處反應(yīng)30 min，在500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算清除率。以2 mL水加2 mL DPPH溶液為控制樣本，BHT乙醇溶液為陽(yáng)性對(duì)照，50%乙醇為空白。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算[15]。

式中：A0為控制樣本的吸光度；As為測(cè)量樣本的吸光度。

清除DPPH自由基的能力用EC50表示，EC50越小，DPPH清除率越高，清除效果越好。由圖7可得，隨著總黃酮的濃度逐漸升高，消除率逐漸變大。BHT乙醇溶液清除DPPH自由基的能力EC50為80.57 μg/mL，沙棘異功方水提取物中總黃酮純化前的EC50為80.95 μg/mL，和BHT清除率基本相當(dāng)；純化后的EC50為52.91 μg/mL，說(shuō)明明顯高于BHT清除率。

圖7 DPPH自由基清除能力測(cè)定

2.3.2 羥自由基清除能力測(cè)定

精密稱取0.150 1 g鄰二氮菲，置100 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度；精密稱取0.204 7 g硫酸亞鐵，置100 mL容量瓶中，用水定容至刻度；精密吸取0.33 mL雙氧水，置10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，避光備用。分別精密吸取0.4 mL不同濃度的BHT乙醇溶液和純化前、后的樣品溶液（0.5，1.0，1.5，1.8和2.0 mg/mL），加2 mL PBS溶液、0.2 mL鄰二氮菲溶液、0.2 mL硫酸亞鐵溶液，混勻，于37 ℃水浴1 h，在536 nm處測(cè)定吸光度A樣；取2 mL PBS溶液、0.2 mL鄰二氮菲溶液、0.2 mL硫酸亞鐵溶液、4.6 mL水，于37 ℃水浴1 h，在536 nm處測(cè)定吸光度A空；取2 mL PBS溶液、0.2 mL鄰二氮菲溶液、0.2 mL硫酸亞鐵溶液、0.4 mL雙氧水溶液、4.2 mL水，于37 ℃水浴1 h，在536 nm處測(cè)定吸光度A損；取2 mL PBS溶液，5 mL水為校零。BHT乙醇溶液為陽(yáng)性對(duì)照。羥自由基清除率按式（2）計(jì)算[16]。

式中：A樣為樣品的吸光度；A空為空白的吸光度；A損為損傷的吸光度。

清除羥基自由基的能力用EC50表示，EC50越小，羥基自由基清除率越高，清除效果越好。由圖8可得，隨著總黃酮的濃度逐漸升高，消除率逐漸變大。BHT乙醇溶液清除羥基自由基的能力EC50為1.29 mg/mL，沙棘異功方水提取物中總黃酮純化前清除羥基自由基的能力EC50為2.04 mg/mL，明顯低于BHT清除率；純化后的EC50為1.51 mg/mL，略低于BHT清除率。

圖8 羥基自由基清除能力測(cè)定

3 結(jié)論與討論

在預(yù)試驗(yàn)中比較了大孔樹(shù)脂和聚酰胺對(duì)沙棘異功方水提取物中總黃酮的分離純化效果，結(jié)果采用大孔樹(shù)脂純化后的總黃酮含量較高，故選用大孔樹(shù)脂作為吸附劑。之后對(duì)不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂（D101、HNK-9、AB-8、DM301、HPD600）的分離純化能力進(jìn)行了比較分析，最終選擇DM301型作為試驗(yàn)樹(shù)脂。通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附和解吸附影響因素的考察，得出大孔樹(shù)脂純化沙棘異功方水提取物中總黃酮的最佳純化工藝：上樣體積為25 mL（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL），上樣流速為1 mL/min，用80%的乙醇50 mL進(jìn)行洗脫，洗脫流速為3 mL/min。純化前總黃酮含量為5.47%，純化后總黃酮的含量為51.90%，純度提高了9.49倍。

文章還比較分析了沙棘異功方水提取物中總黃酮在大孔樹(shù)脂純化前后的抗氧化能力，結(jié)果顯示：總黃酮純化前清除DPPH自由基的能力EC50為80.95 μg/mL，純化后的EC50為52.91 μg/mL；總黃酮純化前清除羥基自由基的能力EC50為2.04 mg/mL，純化后的EC50為1.51 mg/mL。說(shuō)明純化后沙棘異功方水提取物中總黃酮在純度提升的同時(shí)，抗氧化能力也有所增強(qiáng)，說(shuō)明DM301型大孔樹(shù)脂能夠用于分離純化沙棘異功方水提取物中的總黃酮。