王詩(shī)蒙，王帥，2，3，李天驕，2，3，孟憲生，2，3，包永睿，2，3*，趙琳*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

核桃楸皮為胡桃科植物核桃楸(JulansmandshurecaMaxim.)的枝皮或干皮，主要分布于東北、河北、山西等地。其苦，辛，性微寒?！堕_寶本草》中最早記載核桃楸有補(bǔ)腎固精、斂肺定喘、抑菌鎮(zhèn)咳及抗癌之功效[1]，主治濕熱下痢、目赤腫痛、瞼腺炎、迎風(fēng)流目、骨結(jié)核等[2]?，F(xiàn)代研究表明，核桃楸皮中含有醌類、黃酮類、揮發(fā)油類、苷類、鞣質(zhì)、多酚、多糖等化學(xué)成分[3]，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用。目前對(duì)核桃楸皮的研究主要集中在藥理作用[4-6]等方面，關(guān)于藥效物質(zhì)研究的文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少。

本研究采用高效液相色譜(HPLC)法建立了核桃楸皮不同極性部位的指紋圖譜；采用CCK-8法進(jìn)行核桃楸皮治療肝癌的體外藥效研究；運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析法和偏最小二乘回歸分析法兩種分析方法，將指紋圖譜與體外抗肝腫瘤藥效相關(guān)聯(lián)，建立了核桃楸皮治療肝癌的譜效關(guān)系，明確了核桃楸皮活性部位與抗肝癌藥效之間的關(guān)聯(lián)性，篩選出了核桃楸皮治療肝癌的藥效物質(zhì)，初步揭示了其治療肝癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為核桃楸皮的藥物代謝及作用機(jī)制研究提供前期基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 1260 Ⅰ型快速高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；SUNRISE酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；US AUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)NU-AIRE公司)。

1.2 試劑與藥物 核桃楸皮藥材由丹東藥業(yè)集團(tuán)提供，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為胡桃科胡桃屬植物核桃楸(JulansmandshurecaMaxim.)的枝皮或干皮；阿魏酸、槲皮苷、柚皮素、山柰酚(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為17120702、151016、17061301、130708)；丁香酸、沒食子酸、鞣花酸(四川維克奇生物科技有限公司，批號(hào)分別為21090106、170824、22012407)；胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó) GIBCO公司)；胰蛋白酶(美國(guó)GIBCO公司)；青霉素/鏈霉素溶液(Meilunbio公司)；CCK-8增強(qiáng)型溶液細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(Meilunbio公司)。

1.3 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞株HepG2，購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 核桃楸皮指紋圖譜研究

2.1.1 供試品溶液的制備 取核桃楸皮粉末(過3號(hào)篩)適量，分別加入10倍量的乙酸乙酯、70%乙醇溶液、正丁醇、氯仿、石油醚、水，加熱回流提取2 h，放冷，抽濾，揮干，制得核桃楸皮不同極性部位提取物。

精密稱取核桃楸皮不同極性部位提取物0.2 g，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，0.22 μm微孔濾膜過濾，制成濃度為0.02 g·mL-1的供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、丁香酸、阿魏酸、鞣花酸、槲皮苷、柚皮素、山柰酚對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制得濃度為0.159、0.118、0.154、0.192、0.155、0.115、0.884 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

精密稱取各對(duì)照品適量，加甲醇制成含沒食子酸0.034 mg·mL-1、丁香酸0.026 mg·mL-1、阿魏酸0.009 mg·mL-1、鞣花酸0.038 mg·mL-1、槲皮苷0.030 mg·mL-1、柚皮素0.022 mg·mL-1、山柰酚0.017 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell SB-C18色譜柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)；梯度洗脫程序：(0～2 min，10%→15%B；2～4 min，15%→19%B；4～9 min，19%→36%B；9～12 min，36%→37%B；12～14 min，37%→38%B；14～30 min，38%→70%B；30～43 min，70%→87%B；43～55 min，87%→100%B)；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm。

2.1.4 指紋圖譜的建立 精密吸取核桃楸皮不同極性部位供試品溶液5 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,將不同極性部位的色譜圖導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，得到核桃楸皮不同極性部位的指紋圖譜(見圖1)。將相同保留時(shí)間下的色譜峰記為同一峰號(hào),若某部位在該保留時(shí)間下無(wú)峰,則將其峰面積記為0.01，得到各共有峰的保留時(shí)間和峰面積。從指紋圖譜中可以看出，不同極性部位的峰面積及峰數(shù)存在明顯差異，表明不同極性部位所含化學(xué)成分組成及含量有一定的差異性。

S1.乙酸乙酯提取物；S2.70%乙醇提取物；S3.正丁醇提取物；S4.氯仿提取物；S5.石油醚提取物；S6.水提取物

2.1.5 成分鑒定 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，得到核桃楸皮混合對(duì)照品圖譜(見圖2)。經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出2號(hào)峰為沒食子酸，4號(hào)峰為丁香酸，7號(hào)峰為阿魏酸，9號(hào)峰為鞣花酸，10號(hào)峰為槲皮苷，14號(hào)峰為柚皮素，16號(hào)峰為山柰酚。

圖2 混合對(duì)照品圖

2.2 核桃楸皮不同極性部位體外藥效研究

2.2.1 含藥培養(yǎng)液的制備 精密稱取核桃楸皮不同極性部位提取物，加DMEM完全培養(yǎng)基(5‰DMSO助溶)配制成濃度為0.6 mg·mL-1的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 不同極性部位對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人肝癌HepG2細(xì)胞，以1×105mL-1的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)體外培養(yǎng)6～8 h，待細(xì)胞貼壁完全后，設(shè)不同極性部位給藥組和空白對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，給藥24 h后，每孔避光加入100 μL的10%CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD)值，重復(fù)3次，結(jié)果見表1。與空白對(duì)照組相比，各給藥組吸光度明顯降低(P<0.01)。

表1 核桃楸皮不同極性部位對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率

2.3 譜效關(guān)系研究

2.3.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 根據(jù)核桃楸皮不同極性部位的指紋圖譜，從中篩選出分離度、對(duì)稱因子較好的24個(gè)色譜峰。采用歸一化法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理，將不同極性部位對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞抑制作用的藥效指標(biāo)作為母序列，不同極性部位的共有峰峰面積作為子序列。采用灰色關(guān)聯(lián)度分析軟件(Grey ModeLing_V3.0)進(jìn)行分析,得出核桃楸皮不同極性部位色譜峰與體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)(見表2)。

表2 核桃楸皮不同極性部位色譜峰峰面積及關(guān)聯(lián)系數(shù)

從表中數(shù)據(jù)可知，這24個(gè)主要色譜峰代表的化學(xué)成分對(duì)肝癌抑制作用有一定的差異性，其中相關(guān)系數(shù)大于0.7的有2、4、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、20號(hào)共13個(gè)色譜峰。

2.3.2 偏最小二乘回歸分析 為了進(jìn)一步明確核桃楸皮化學(xué)成分和藥效之間的相關(guān)性，將相關(guān)系數(shù)大于0.7的13個(gè)色譜峰峰面積作為自變量(X)，藥效數(shù)據(jù)作為因變量(Y)，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，OPLS-DA模型中R2X=0.813，模型預(yù)測(cè)參數(shù)Q2=0.913，均大于0.5，表明建立的模型有效穩(wěn)定[7]。結(jié)果見圖3～4。

其中，回歸系數(shù)的正、負(fù)代表各成分對(duì)抗肝癌藥效的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。由圖3可知，2、4、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17號(hào)峰與藥效呈正相關(guān)，對(duì)藥效貢獻(xiàn)較大。

圖3 回歸系數(shù)

變量投影(variable influence on projection,VIP)可解釋自變量對(duì)因變量的貢獻(xiàn)程度，VIP值越大，說明該自變量對(duì)因變量的貢獻(xiàn)越大，VIP>1時(shí)表示對(duì)因變量有顯著貢獻(xiàn)[8]。對(duì)13個(gè)色譜峰的VIP值進(jìn)行分析，篩選出對(duì)核桃楸皮抗肝癌作用影響較大的色譜峰(以VIP>1為標(biāo)準(zhǔn))有4、8、9、10、11、13、15、16號(hào)峰。

綜合回歸系數(shù)和VIP值兩個(gè)指標(biāo)，明確4(丁香酸)、8、9(鞣花酸)、10(槲皮苷)、11、13、15、16(山柰酚)號(hào)峰所代表的化學(xué)成分對(duì)藥效貢獻(xiàn)較大，為核桃楸皮治療肝癌的藥效物質(zhì)。

圖4 VIP值

2.4 體外藥效單體成分驗(yàn)證研究

2.4.1 供試品溶液的制備 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備濃度為0.6 mg·mL-1的乙酸乙酯部位含藥培養(yǎng)液。

精密稱取丁香酸、鞣花酸、槲皮苷、山柰酚對(duì)照品適量，分別加培養(yǎng)液制成濃度為0.6 mg·mL-1的單體給藥溶液。

根據(jù)乙酸乙酯部位圖譜數(shù)據(jù)，計(jì)算出樣品中丁香酸、鞣花酸、槲皮苷、山柰酚的含量分別為2.11%、0.95%、2.08%、1.97%。按含量比例精密稱取4個(gè)對(duì)照品，制成濃度為0.6 mg·mL-1的混合單體配伍給藥溶液。

2.4.2 不同組分對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人肝癌HepG2細(xì)胞，以1×105mL-1密度接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)體外培養(yǎng)6～8 h，待細(xì)胞貼壁完全后，設(shè)乙酸乙酯部位給藥組、單體成分給藥組和空白對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。給藥24 h后，每孔避光加入100 μL的10%CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，4種單體成分對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞均有一定的抑制作用。

表3 不同組分對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率

根據(jù)上述結(jié)果，按“2.4.1”項(xiàng)下方法將4種單體成分進(jìn)行配伍驗(yàn)證，細(xì)胞抑制率為71.3%，占乙酸乙酯部位藥效的76.3%。表明核桃楸皮治療肝癌的藥效是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，明確了這4種單體成分為核桃楸皮治療肝癌的藥效物質(zhì)。

3 討論

中藥的資源豐富,從中藥中篩選出具有抗腫瘤活性成分已經(jīng)變成了近幾年來(lái)研究者關(guān)注的熱點(diǎn)領(lǐng)域[9]。核桃楸皮是滿藥復(fù)方木雞顆粒中抗肝癌的重要藥材之一,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有明顯的抗肝腫瘤活性[10-14]，但其抗肝腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。因此，本研究篩選出了核桃楸皮抗肝癌的藥效物質(zhì)，為抗腫瘤藥物的臨床研發(fā)提供參考。

譜效關(guān)系是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要手段[15]。本研究采用HPLC法建立了核桃楸皮不同極性部位指紋圖譜，獲得24個(gè)共有峰。采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法，獲得了與藥效關(guān)聯(lián)較大的13個(gè)色譜峰。由于灰色關(guān)聯(lián)度分析法僅標(biāo)識(shí)成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn),而不表示其正相關(guān)或是負(fù)相關(guān)[16],因此,本研究在灰色關(guān)聯(lián)分析方法基礎(chǔ)上進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，獲得了抗肝癌作用較強(qiáng)且呈正相關(guān)的8個(gè)色譜峰，確認(rèn)這8個(gè)峰所代表的化學(xué)成分為核桃楸皮治療肝癌的藥效物質(zhì)。經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出4號(hào)峰為丁香酸、9號(hào)峰為鞣花酸、10號(hào)峰為槲皮苷、16號(hào)峰為山柰酚。丁香酸具有抗內(nèi)毒素、抗白內(nèi)障、抗氧化及抗腫瘤作用[17-20]。鞣花酸具有明顯的抗肝損傷、抗腫瘤血管生成、抗氧化、抗衰老等作用[21-23]。槲皮苷具有抗心腦血管疾病、抗白內(nèi)障、抗炎及抗肝損傷等作用[24-26]。山柰酚具有抗抑郁、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用，可以增強(qiáng)抗癌活性，減少心臟毒性[27-29]。

本研究根據(jù)HPLC圖譜數(shù)據(jù)計(jì)算出了4種單體成分含量，并按含量比例配伍，進(jìn)行體外藥效驗(yàn)證。結(jié)果顯示，4種單體成分均有一定的藥效，單體配伍組藥效占乙酸乙酯部位藥效的71.3%，明確了這4種成分為核桃楸皮治療肝癌的藥效物質(zhì)，初步揭示了核桃楸皮治療肝癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。