李強(qiáng)，程艷芹，崔曉博，劉楊，劉旭

(中國人民解放軍海軍九七一醫(yī)院，山東 青島 266071)

延胡索(Corydalisyanhusuo)，又稱延胡、元胡、元胡索，是罌粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)干燥塊莖。延胡索性質(zhì)溫和，味辛且苦，歸肝及脾經(jīng)，具有活血、行氣、止痛的功效[1-2]。近代醫(yī)藥學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，延胡索中包含60余種生物堿和20余種非生物堿類化合物，成分非常復(fù)雜，其中的生物堿是其主要的活性成分，具有鎮(zhèn)痛、抗心律失常、抗?jié)儭⒖咕共《镜人幚碜饔肹3-4]，是現(xiàn)代中藥制劑的常用藥材，在中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。該藥材原產(chǎn)于浙江，近年來在河南、江蘇等地大量種植，也有多種同屬植物的塊莖在部分地區(qū)作元胡藥用，種類繁雜。文獻(xiàn)資料中延胡索藥材的相關(guān)研究多以標(biāo)志性成分延胡索乙素單一指標(biāo)為考察對象，不足以全面地反映藥材的質(zhì)量[5-6]。因此，建立有效的延胡索藥材質(zhì)量評價方法，確保延胡索藥材質(zhì)量穩(wěn)定，直接關(guān)系到延胡索相關(guān)藥品和臨床處方的療效。本試驗采用高效液相色譜(HPLC)法建立延胡索的指紋圖譜，同時對原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索甲素、延胡索乙素6種生物堿含量進(jìn)行研究分析，為進(jìn)一步考察6種不同產(chǎn)地延胡索藥材的質(zhì)量狀況提供了更為全面的圖譜信息，為延胡索藥材整體的質(zhì)量評價提供了新的借鑒和參考。

1 材料和設(shè)備

1.1 藥品和試劑 乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20200731)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20200924)；磷酸(分析純，萊陽市康德化工有限公司，批號：2019081)；三乙胺(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20200827)；濃氨水(分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號：20190920)；滅菌注射用水(山東齊都藥業(yè)有限公司，批號：2019062002)；延胡索甲素(上海源葉生物科技有限公司，批號：Z25N8B49010)；延胡索乙素(成都化夏化學(xué)試劑有限公司，批號：P550201)；鹽酸巴馬汀(北京索萊寶科技有限公司，批號：SP8050)；原阿片堿(上海源葉生物科技有限公司，批號：Y12J10L90499)；脫氫紫堇堿(上海源葉生物科技有限公司，批號：W13M8Z31183)；鹽酸小檗堿(北京索萊寶科技有限公司,批號：SP8140)；延胡索藥材來源見表1。

表1 延胡索藥材來源

1.2 儀器和設(shè)備 液相色譜儀LC-2030型(日本島津制作所)；超聲波儀SY2200-SB2200型(上海必能信超聲有限公司)；電子天平Y(jié)P202N型(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；電子天平DV215CD型(美國奧豪斯公司)；循環(huán)水真空泵SHZ-DⅢ型(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；電熱恒溫水箱HH-W21-420型(余姚市亞星儀器儀表有限公司)；酸度計PHS-3E型(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；紅外線干燥箱70-1型(龍口市電爐制造廠)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SP(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)(三乙胺調(diào)pH值至 6.1)；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃[4]，流動相梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫流動相變化時間程序

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取已粉碎的藥材粉末1 g于圓底燒瓶中，精密加入濃氨-甲醇(1∶20)50 mL，稱重，冷浸1 h，超聲40 min，取出靜置冷卻，再次稱重，并用濃氨-甲醇(1∶20)補(bǔ)充損失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL于坩堝中，在水浴鍋中蒸干，取得的殘渣加甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，充分搖勻，微孔濾膜濾過即得。

2.3 混合對照品溶液的制備 精密稱取6種生物堿對照品適量，加甲醇超聲(功率：500 W，頻率：59 kHz，下同)溶解，制成每1 mL含原阿片堿17.75 μg、鹽酸巴馬汀19.65 μg、鹽酸小檗堿10.10 μg、脫氫紫堇堿61.70 μg、延胡索乙素58.00 μg、延胡索甲素46.45 μg的混合對照品溶液，密封后放入冰箱內(nèi)冷凍保存，備用。

2.4 單個生物堿對照品溶液的制備 分別精密稱取原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素對照品藥物適量分別于不同的10 mL容量瓶中，分別加適量甲醇搖勻，超聲溶解，用甲醇分別定容，制得原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素質(zhì)量濃度分別為0.104 2、0.096 6、0.101 6、0.100 2、0.101 0、0.110 8 mg·mL-1的單個對照品溶液，密封后放入冰箱內(nèi)冷藏保存，備用。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 精密度試驗 取相同的延胡索供試品溶液，按照規(guī)定的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次并記錄所得色譜圖，比較脫氫紫堇堿的色譜峰的相對峰面積和相對保留時間，所得RSD值均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取相同的延胡索供試品溶液，按照規(guī)定的色譜條件，在0、3、6、9、12、24 h分別進(jìn)樣分析并記錄所得色譜圖，比較脫氫紫堇堿的色譜峰的相對峰面積和相對保留時間，所得RSD值均小于2%，表明延胡索供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取相同批次的延胡索樣品6份，分別配置供試品溶液后按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄所得色譜圖，比較脫氫紫堇堿的色譜峰的相對峰面積和相對保留時間，所得RSD值均小于2%，表明重復(fù)性良好。

2.5.4 指紋圖譜的生成 取6批不同產(chǎn)地的延胡索樣品按照“2.2.2”項下制成的供試品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄75 min色譜圖。取6種生物堿制成的混合對照品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄75 min色譜圖。取各生物堿對照品6種分別配置單個生物堿對照品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄75 min色譜圖。對比指紋圖譜除溶劑峰外共確定有12個共有峰，經(jīng)過進(jìn)樣剖析單個生物堿對照品后獲得的色譜圖，如圖1～3，確定其中6個色譜峰，按序號1、2、3、4、7、9分別為原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素。以脫氫紫堇堿為參照峰，各共有峰相對保留時間和相對峰面積見表3～4。

圖1 6批不同產(chǎn)地延胡索藥材指紋圖譜

1.原阿片堿；2.鹽酸巴馬??；3.鹽酸小檗堿；4.脫氫紫堇堿；7.延胡索乙素；9.延胡索甲素

表3 6批延胡索藥材樣品中共有峰相對保留時間

表4 6批延胡索藥材樣品中共有峰相對峰面積

2.5.5 指紋圖譜相似度分析 對6批不同產(chǎn)地藥材指紋圖譜利用“中國色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”進(jìn)行相似度分析，結(jié)果6批藥材(S1～S6)與對照圖譜(SR)相似度分別為0.976、0.922、0.953、0.981、0.943、0.992。提示6種不同產(chǎn)地的延胡索藥品指紋圖譜差異較小。

2.6 延胡索中6種生物堿的含量測定

2.6.1 系統(tǒng)適用性試驗 取延胡索供試品和混合對照品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄75 min色譜圖。分析結(jié)果表明，6種生物堿的分離度均大于1.5。

2.6.2 線性關(guān)系考察 取相同的延胡索混合對照品溶液，分別精密吸取2、5、10、15、20、25、30、35 μL進(jìn)樣分析并記錄75 min色譜圖，測出6種生物堿的峰面積，以對照品溶液進(jìn)樣量作自變量X，以生物堿相應(yīng)峰面積作因變量Y做線性回歸，結(jié)果顯示，6種生物堿均具有良好的線性關(guān)系。

2.6.3 精密度試驗 取相同的延胡索混合對照品溶液，按照規(guī)定的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣分析6次并記錄所得色譜圖，測出6種生物堿的峰面積RSD值均小于2%，表明儀器精密度良好。

A.原阿片堿；B.鹽酸巴馬??；C.鹽酸小檗堿；D.脫氫紫堇堿；E.延胡索乙素；F.延胡索甲素

表5 6種生物堿線性關(guān)系考察表

2.6.4 穩(wěn)定性試驗 取相同的延胡索供試品溶液，按照規(guī)定的色譜條件，在0、3、6、9、12、24 h分別進(jìn)樣分析并記錄所得色譜圖，測出6種生物堿的峰面積所得RSD值均小于2%，表明延胡索供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 重復(fù)性試驗 取相同批次的延胡索樣品6份，分別配置供試品溶液后按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄所得色譜圖，測出6種生物堿的峰面積所得RSD值均小于2%，表明重復(fù)性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗 精密稱取同一批延胡索樣品(批號：20200511)6份各0.5 g，置于平底燒瓶中，精密加入6種生物堿對照品適量，分析測定。結(jié)果顯示，原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素的平均加樣回收率分別為：101.6%、99.9%、100.5%、99.0%、100.2%、102.2%，其RSD分別為：1.6%、1.3%、0.6%、1.5%、2.3%、1.7%(見表6)。

表6 延胡索6種組分加樣回收率試驗結(jié)果

2.6.7 樣品測定 取延胡索樣品制成的供試品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄75 min色譜圖并計算出樣品中各6種生物堿含量見表7(為6批不同產(chǎn)地藥材各生物堿的平均含量)。

表7 延胡索各組分含量測定結(jié)果(mg·g-1,n=6)

3 討論與結(jié)論

3.1 供試品溶液制備條件的篩選 采用單因素法，以原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素6種生物堿色譜峰為考察指標(biāo)，對超聲和加熱回流提取30 min兩種提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明超聲提取所得的生物堿含量較高，因此選用超聲提取方式對藥材進(jìn)行制備；此外，又分別選擇甲醇、70%甲醇、濃氨-甲醇(1∶20)對提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果表明濃氨-甲醇(1∶20)所得的生物堿含量較高，因此選用濃氨-甲醇(1∶20)作為溶劑進(jìn)行提?。徊捎脻獍?甲醇(1∶20)作提取溶劑分別超聲提取20、40、60 min，結(jié)果表明超聲提取40 min和60 min生物堿含量較超聲提取20 min高，且二者之間無明顯差別，因此選用超聲40 min作為供試品提取制備方式。

3.2 色譜條件的選擇 通過對比流動相[甲醇A-0.1%磷酸溶液B、乙腈A-0.1%磷酸溶液B、乙腈A-水B(每100 mL水中含有1 mL pH=6.0的醋酸-醋酸銨緩沖溶液)]、流動相pH(6.0、6.1、6.2)、檢測波長(230、250、280 nm)及柱溫(25、30、35 ℃)等色譜條件，經(jīng)過圖譜分析后篩選出流動相：乙腈A-0.1%磷酸溶液B(三乙胺調(diào)pH值至 6.1),檢測波長：280 nm，柱溫：30 ℃為最優(yōu)檢測條件，所得色譜峰分離度良好，無拖尾現(xiàn)象。

3.3 指紋圖譜方法學(xué)驗證及相似度分析 本試驗建立了延胡索藥材HPLC指紋圖譜，并考察比較了6批不同產(chǎn)地延胡索藥材的指紋圖譜相似度。經(jīng)過方法學(xué)驗證，該HPLC方法精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定準(zhǔn)確，特征突出，可行性好。

本試驗所采用的延胡索為我國南方地區(qū)的延胡索生品，試驗結(jié)果顯示，指紋圖譜共成功匹配12個共有峰，共有峰基本特征均一致，為延胡索藥材的鑒別及生物堿成分的含量測定提供了相對全面的參考信息，對延胡索藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定具有一定的借鑒意義[5]。圖譜比較后發(fā)現(xiàn)，6批不同產(chǎn)地的延胡索藥材指紋圖譜相似度較高，提示這幾個地區(qū)延胡索藥材質(zhì)量差異不大。這可能與延胡索藥材產(chǎn)地空間距離較近，產(chǎn)地之間土壤、光照、氣候等地理因素差異較小，藥材采集時間，采集方式和儲存條件相對一致等因素密切相關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步分析研究。