楊 弋,朱 軍,李小洪

小于胎齡兒(small for gestational age, SGA)指出生體重和(或)身長(zhǎng)低于同性別同胎齡第10個(gè)百分位以下的嬰兒[1],是常見的產(chǎn)科并發(fā)癥;亦稱胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation, IUGR)。IUGR是小于胎齡兒(small for gestational age infant,SGA)的宮內(nèi)階段,由于IUGR在子宮內(nèi)的識(shí)別困難,因此很多文獻(xiàn)中兩者無(wú)明顯區(qū)分,二者的結(jié)果常常相互替代。2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)對(duì)國(guó)內(nèi)22個(gè)省(區(qū)、市)的 86 所醫(yī)院調(diào)查顯示:我國(guó)SGA發(fā)生率為6.61%[2]。2010年《柳葉刀》雜志發(fā)布的一項(xiàng)全球薈萃分析顯示,在138個(gè)低-中收入國(guó)家SGA發(fā)生率高達(dá)27%,在SGA出生數(shù)量前10位的國(guó)家中,中國(guó)居全球第五[3]。SGA往往合并諸多健康問(wèn)題以及不良圍產(chǎn)結(jié)局,如胎兒宮內(nèi)窘迫、新生兒窒息、新生兒重癥監(jiān)護(hù)室治療的發(fā)生率和死亡率均高于適于胎齡兒(appropriateforgestationalage,AGA)[4]。SGA還會(huì)增加神經(jīng)功能受損以及心血管風(fēng)險(xiǎn)[5]。從疾病預(yù)后看,SGA 也是生長(zhǎng)遲緩、神經(jīng)心理發(fā)育障礙及成年期代謝綜合征的高危人群[6]?？梢奡GA是一個(gè)全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

有學(xué)者指出[7],如能早期識(shí)別和預(yù)警SGA 的發(fā)生,早期參與高危孕母及胎兒管理,可有效降低SGA發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),改善其預(yù)后結(jié)局。然而SGA發(fā)病機(jī)制尚未闡明,約40%的SGA未找到明確的病理因素[8]。SGA的發(fā)生與多種因素有關(guān),包括母親因素、胎兒因素、胎盤臍帶因素、環(huán)境因素等[9]。盡管已經(jīng)有大量關(guān)于足月SGA的危險(xiǎn)因素研究,但仍然缺乏有關(guān)母體遺傳與環(huán)境因素對(duì)SGA影響的研究,且母體因素在SGA發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制未明。因此需要更多新的研究來(lái)了解SGA的病因機(jī)制[10],以便精準(zhǔn)構(gòu)建SGA的檢測(cè)方法,建立基于生物標(biāo)志物的SGA預(yù)測(cè)模型。近年來(lái)“精準(zhǔn)醫(yī)療”概念的提出,有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病和患者進(jìn)行個(gè)性化的精準(zhǔn)治療。其本質(zhì)是通過(guò)基因組、蛋白質(zhì)組與代謝組等先進(jìn)醫(yī)療技術(shù),對(duì)大樣本人群和特定疾病類型進(jìn)行生物標(biāo)志物的分析、驗(yàn)證與應(yīng)用。其中代謝組學(xué)作為一種高通量、高靈敏度的精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù),廣泛應(yīng)用于疾病潛在病理生理機(jī)制的研究中?，F(xiàn)就代謝組學(xué)在小于胎齡兒發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用現(xiàn)狀予以綜述。

1 代謝組學(xué)研究概述

1.1 代謝組學(xué)的概念代謝組學(xué)一詞來(lái)源于代謝組。代謝組是指某一生物或細(xì)胞、組織在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有的低分子量代謝產(chǎn)物的集合,主要是指分子量小于1000 Da的內(nèi)源性小分子[11]。代謝產(chǎn)物是基因和蛋白調(diào)控的下游產(chǎn)物也是最終產(chǎn)物,主要是一些參與生物體新陳代謝、維持生物體正常功能和生長(zhǎng)發(fā)育的小分子化合物。代謝組學(xué)技術(shù)是后基因時(shí)代發(fā)展起來(lái)的系統(tǒng)生物學(xué)檢測(cè)新技術(shù),以生物體內(nèi)所有代謝產(chǎn)物為研究對(duì)象,其主要目標(biāo)是定性定量研究代謝物與機(jī)體生理病理變化之間的關(guān)系,從整體水平揭示疾病的發(fā)病機(jī)制。代謝組檢測(cè)的是基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的可變性下游表型,從而可以提供高度整合的生物學(xué)狀態(tài)概況;同時(shí)放大了基因和蛋白表達(dá)的微小變化,從而使檢測(cè)更容易[12]。因此,代謝組學(xué)的變化可以直接或間接反映外界刺激或遺傳修飾對(duì)生物體代謝應(yīng)答的改變,將遺傳、環(huán)境和生理因素與特定的病理狀態(tài)聯(lián)系起來(lái),已經(jīng)在疾病的診斷、分型和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮重要作用。

1.2 代謝組學(xué)的研究方法目前常用的代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要有核磁共振 (nuclear magnetic reso-nance spectroscopy,NMR 、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS) 或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS) 。NMR幾乎不需要樣品預(yù)處理,檢測(cè)速度快,不破壞樣品,但其靈敏度低和分辨率差,可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)重疊,低豐度代謝物被高豐度代謝物所掩蓋[13]。GC-MS 具有較高的分辨率和檢測(cè)靈敏度,缺點(diǎn)是樣品前處理工作量大且難以進(jìn)行新的化合物鑒定[11]。LC-MS具有更高的靈敏度和較廣的檢測(cè)范圍,可用于分析相對(duì)分子質(zhì)量較高且熱穩(wěn)定性較差的化合物。因此,其更適合用于樣品中復(fù)雜代謝物的檢測(cè)[14]。

代謝組學(xué)研究主要有兩種策略,包括非靶向和靶向分析。研究人員既可采用針對(duì)特定代謝物的靶向分析,也可采用非靶向分析來(lái)檢測(cè)盡可能多的代謝物類別,包括代謝數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)注的未知代謝物。非靶向代謝組學(xué)具有較好的代謝物檢測(cè)覆蓋率,但對(duì)低豐度代謝物質(zhì)的檢測(cè)重現(xiàn)性較差,且靈敏度低,同時(shí)需要對(duì)樣品進(jìn)行分離,對(duì)樣品具有破壞性。而靶向代謝組學(xué)具有靈敏度高、動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍廣以及定量結(jié)果準(zhǔn)確率高等特點(diǎn),被視為代謝物定量分析的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。雖然以上技術(shù)均能同時(shí)定量樣本中共存的多種代謝物,但仍不能覆蓋整個(gè)代謝組,只有多個(gè)分析平臺(tái)聯(lián)合應(yīng)用,才能提高代謝組學(xué)研究的覆蓋率。

2 代謝組學(xué)在SGA中的應(yīng)用

目前,母親的血液、尿液和頭發(fā)已被用于代謝組學(xué)分析,也有研究采用羊水、臍帶靜脈血和新生兒尿液等進(jìn)行胎兒發(fā)育遲緩評(píng)估。代謝組學(xué)方法已經(jīng)確定了可能導(dǎo)致FGR或者SGA的幾種途徑和代謝過(guò)程,如DNA甲基化的破壞[15]、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[16, 17]、神經(jīng)遞質(zhì)前體[17, 18]和能量產(chǎn)生[16, 17]。

2.1 頭發(fā)代謝組學(xué)一項(xiàng)對(duì)母親頭發(fā)[10, 17, 19]的非靶向分析提供了可靠的預(yù)測(cè)精度,表明應(yīng)該在不同的情景下進(jìn)行驗(yàn)證。分娩時(shí),多普勒異常的孕婦母親/新生兒中鏈脂肪酸比例下調(diào),表明新生兒對(duì)能量和結(jié)構(gòu)代謝物的需求增加[20]。Thibaut[21]等采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas chromatography- mass spectrometry,GC-MS)對(duì)83名新加坡孕婦的頭發(fā)樣本進(jìn)行代謝物測(cè)定,發(fā)現(xiàn)頭發(fā)代謝物在妊娠過(guò)程中發(fā)生改變,并可反映氨基酸、三羧酸循環(huán)中間體、脂肪酸、輔助因子、維生素相關(guān)代謝物和外源性藥物水平的變化。

2.2 血清代謝組學(xué)有研究表明,胎兒的生長(zhǎng)在很大程度上取決于母體血流中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可獲得性以及胎盤中營(yíng)養(yǎng)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性[20]。在妊娠晚期,在胎兒組織和大腦中有大量的脂肪沉積,因此產(chǎn)生了對(duì)母體脂肪酸代謝的一些研究,并且指出在SGA妊娠的母體中存在著脂質(zhì)代謝紊亂[22]。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)長(zhǎng)鏈脂肪酸(Long chain fatty acids,LCFAs)的含量在母體血和臍帶血之間是不同的[23],LCFAs與IUGR或SGA之間存在相關(guān)性。在母體和胎兒血漿中檢測(cè)到的最豐富的脂肪酸是C16∶0和C18∶0,其次是相對(duì)不飽和的形式(C16∶1, C18∶1, C18∶2)[24, 25]。Bobiński等[26]比較了足月、早產(chǎn)和SGA新生兒的母親和臍血的脂肪酸譜,發(fā)現(xiàn)了早產(chǎn)兒和SGA新生兒月桂酸成分的變化。早產(chǎn)婦女的飲食結(jié)構(gòu)中短鏈和中鏈脂肪酸水平較低。結(jié)果顯示臍帶血C12∶0水平高于AGA組,在臍帶血中C12∶0的百分比和母體中中鏈脂肪(Medium chain fatty acids,MCFAs)的估計(jì)攝入量之間存在反比。表明胎盤在補(bǔ)償過(guò)程中發(fā)揮重要作用,對(duì)母親飲食組成的變化敏感,通過(guò)調(diào)節(jié)胎兒脂肪酸水平,以防止胎兒缺乏。即在SGA母體中,MCFAs從頭合成增加,并且很容易通過(guò)擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒。因此,MCFAs水平可能是妊娠期SGA早期診斷的一個(gè)指標(biāo)。Miranda等[27]使用孕婦和臍帶血血漿樣本進(jìn)行基于NMR的代謝指紋打印和擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)磷脂酰膽堿和糖蛋白在生長(zhǎng)受限胎兒中有顯著變化。生長(zhǎng)受限胎兒母親的IDL、甘油三酯-IDL和高密度脂蛋白(HDL)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,揭示了SGA母親的脂質(zhì)代謝物顯著減少,表明母親對(duì)妊娠的代謝適應(yīng)失敗。Favretto等[28]對(duì)宮內(nèi)生長(zhǎng)受限進(jìn)行了另一項(xiàng)代謝組學(xué)研究。臍帶血的 LC-MS分析顯示苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸水平升高。對(duì)宮內(nèi)生長(zhǎng)受限的代謝組學(xué)研究推動(dòng)了產(chǎn)前和產(chǎn)后檢測(cè)新診斷標(biāo)準(zhǔn)的出現(xiàn)[29]。大多數(shù)鑒別代謝物與三羧酸循環(huán)有關(guān),包括檸檬酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、亮氨酸。故通過(guò)對(duì)這些有意義的代謝物進(jìn)行定量分析,即可列出新的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。而Ivorra等[30]報(bào)道了FGR胎兒臍血中五種氨基酸濃度的顯著差異(脯氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸降低,而苯丙氨酸和瓜氨酸增加)。Bernard等[31]研究發(fā)現(xiàn),亞油酸水平與體重和腹部脂肪組織體積呈正相關(guān),而二十二碳六烯酸與生長(zhǎng)的比例(長(zhǎng)度/高度)相關(guān)。2010年,Horgan和他的同事們研究了來(lái)自生下健康單胎胎兒的婦女和疑似患有SGA(出生體重低于孕齡10%)的婦女的臍帶血。在此分析的同時(shí),對(duì)懷孕15周的婦女進(jìn)行了血漿樣本分析[16]。他們采用超高效液相檢測(cè)代謝組學(xué)色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)在三個(gè)獨(dú)立的研究中進(jìn)行驗(yàn)證,研究結(jié)果顯示,29種代謝物在對(duì)照組之間的濃度差異很大(足以滿足胎齡和SGA)。其中19種代謝物被確定為模型的預(yù)測(cè)因子,并應(yīng)用于臍帶血和母體外周血的分析。在后一種情況下,預(yù)測(cè)模型的曲線下面積(AUC)為0.9,這代表了癥狀前SGA的穩(wěn)健預(yù)測(cè)模型。同時(shí)在SGA發(fā)病前的妊娠早期血漿中也發(fā)現(xiàn)了一致的特異性代謝物特征,對(duì)SGA疾病發(fā)病機(jī)制的深入了解提供了途徑。Liu等[32]對(duì)宮內(nèi)生長(zhǎng)受限新生兒氨基酸變化提出可能機(jī)制:第一,氨基酸的利用率可能會(huì)降低[32]。宮內(nèi)生長(zhǎng)受限改變了蛋白表達(dá)譜,導(dǎo)致氨基酸利用率降低,進(jìn)而增加了體內(nèi)氨基酸濃度。第二,可能存在母體機(jī)制可以補(bǔ)償胎兒的氨基酸代謝。既往研究表明孕有宮內(nèi)生長(zhǎng)受限胎兒的母親體內(nèi)氨基酸濃度高于孕有適于胎齡胎兒的母親,并且大多數(shù)氨基酸通過(guò)胎盤從母體轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒,引起胎兒或新生兒體內(nèi)氨基酸濃度的增加。第三,胎盤中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體可能具有代償功能。胎盤有多個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),它可以同時(shí)運(yùn)輸一種或一族氨基酸,同樣的氨基酸可以通過(guò)多種轉(zhuǎn)運(yùn)體運(yùn)輸。體重低于第 3 百分位的宮內(nèi)生長(zhǎng)受限新生兒出現(xiàn)明顯的氨基酸濃度下降,可能與胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能受損有關(guān)。隨著出生體重的增加,氨基酸和?；鈮A呈代償性增加或減少,當(dāng)出生體重達(dá)到第10百分位時(shí),IUGR新生兒與AGA新生兒相似。Bahado-Singh等[21]首次采用質(zhì)子核磁共振(H-NMR)和直接注射-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(direct injection coupled with liquid chromatography tandem MS,DI-LS-MS)相結(jié)合的技術(shù)來(lái)檢測(cè)宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的生物標(biāo)記物。他們采用臍血,利用人工智能和多平臺(tái)代謝組學(xué)分析(核磁共振和質(zhì)譜)對(duì)胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限進(jìn)行了預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的代謝途徑,如肝功代謝和能量代謝。

2.3 尿液代謝組學(xué)Dessi等[33]研究了FGR新生兒的尿液代謝特征,并將其與對(duì)照組進(jìn)行比較,報(bào)告了宮內(nèi)生長(zhǎng)受限嬰兒在三個(gè)生化途徑上的代謝受損。這些途徑包括精氨酸和脯氨酸代謝、尿素循環(huán)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。鑒別代謝產(chǎn)物為肌醇[34]、肌氨酸、肌酸和肌酐。在高分解代謝狀態(tài)下,尿液中這些代謝物的增加被觀察到,就像在禁食的情況下,有一個(gè)較低水平的蛋白質(zhì)合成[18]。血漿和尿液中肌醇含量的增加似乎與成人葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗有關(guān),因此可能成為胎兒發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)有效指標(biāo)。另一方面,Maitre等[35]采用質(zhì)子核磁共振(proton nuclear magnetic resonance,H-NMR)技術(shù)通過(guò)測(cè)量妊娠早期的尿代謝物,發(fā)現(xiàn)尿代謝譜與不良出生結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān),強(qiáng)調(diào)了尿代謝組學(xué)研究作為一種新型無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物在識(shí)別早產(chǎn)和SGA風(fēng)險(xiǎn)中的潛力,他們發(fā)現(xiàn)在妊娠晚期前三個(gè)月的孕婦尿液樣本中,酪氨酸、醋酸鹽、三甲胺和甲酸鹽的含量有所下降。這些分子可以在碳水化合物和脂肪代謝中發(fā)揮作用(醋酸鹽),作為神經(jīng)遞質(zhì)的前體(酪氨酸),作為活性氧水平提高導(dǎo)致細(xì)胞死亡的介質(zhì)(甲酸鹽),或者只是蔬菜攝入的標(biāo)記物(三甲胺)。這些發(fā)現(xiàn)突出了FGR發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性,并提供了一些線索。

3 動(dòng)物模型

Selak等[36]通過(guò)孕鼠半饑餓法造成SGA的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SGA仔鼠在成年后會(huì)出現(xiàn)胰島素敏感性降低,糖耐受不良。通過(guò)鉗夾子宮動(dòng)脈引起胎盤缺血缺氧、胎兒營(yíng)養(yǎng)不良產(chǎn)生小鼠SGA,小鼠自幼年時(shí)就表現(xiàn)為血糖異常,成年后表現(xiàn)出明顯糖尿病癥狀,特點(diǎn)是空腹血糖升高和高胰島素血征。Chen等[37]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)孕期酒精造成的SGA鼠模型,血漿和肝臟中甘油三酯水平均升高,脂聯(lián)素和抵抗素水平升高通過(guò)抑制β腎上腺素能受體激動(dòng)劑,cAMP活化劑和腫瘤壞死因子α從而導(dǎo)致胰島素抵抗。Boloker等[38]通過(guò)正常血糖-高胰島素鉗夾技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)SGA鼠自出生1周起胰島素敏感性開始降低且不斷惡化。肝臟和肝外組織對(duì)胰島素的敏感性降低,骨骼肌對(duì)外周血糖的攝取率明顯降低。三種經(jīng)典的SGA動(dòng)物模型都可以證實(shí)SGA鼠的胰島素敏感性受損,成年后可發(fā)展為糖尿病。

4 代謝組學(xué)在SGA相關(guān)研究中存在問(wèn)題及展望

通過(guò)以上研究發(fā)現(xiàn),大部分SGA的代謝組學(xué)研究結(jié)果,其生物標(biāo)志物都集中在脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、肝臟代謝及能量代謝途徑。但目前有關(guān)小于胎齡兒與孕期代謝的研究仍然存在以下問(wèn)題:①研究設(shè)計(jì)缺陷:多為單個(gè)孕期的橫斷面研究,缺乏整個(gè)孕期多時(shí)段的動(dòng)態(tài)分析。而胎兒生長(zhǎng)發(fā)育是個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程,要研究SGA的發(fā)病機(jī)制需要從動(dòng)態(tài)的角度綜合考慮,不能局限于某一單次隨機(jī)樣本。②結(jié)局指標(biāo)未細(xì)化:未對(duì)SGA進(jìn)行不同分界點(diǎn)的對(duì)比研究,比如未將體質(zhì)量小于第三百分位(重度)和小于第十百分位(輕度)的SGA進(jìn)行比較[39],分析輕重度SGA母體代謝是否存在差異,因?yàn)橹囟萐GA胎兒預(yù)后更差,更應(yīng)該盡早識(shí)別并進(jìn)行干預(yù),提高存活率和生存質(zhì)量;③代謝組學(xué)檢測(cè)方法缺陷:多為非靶向代謝組學(xué)檢測(cè),采用的是數(shù)據(jù)依賴性采集技術(shù)(data-dependent acquisition,DDA),DDA的檢測(cè)具有隨機(jī)性,定量不準(zhǔn)確。而廣泛靶向是一種整合了非靶向和靶向代謝物檢測(cè)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的新型代謝組檢測(cè)技術(shù),采用不同的LC-MS/MS檢測(cè)平臺(tái)和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)技術(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)定量,實(shí)現(xiàn)了高通量、高靈敏、廣覆蓋的靶向代謝物檢測(cè),目前應(yīng)用較少,可在未來(lái)推廣使用。④計(jì)分析方法單一:多采用代謝組學(xué)常規(guī)分析方法及回歸分析,當(dāng)病例較少時(shí)可能存在高維困擾及共線性問(wèn)題,對(duì)于大量數(shù)據(jù)的分析精確度有待提高;而機(jī)器學(xué)習(xí)的應(yīng)用可以最大限度的提高統(tǒng)計(jì)效能,精準(zhǔn)獲取差異性。

綜上,后續(xù)有關(guān)SGA的孕期代謝研究可采用廣泛靶向代謝組學(xué)的方法進(jìn)行動(dòng)態(tài)預(yù)測(cè),探索不同孕期血尿代謝譜的動(dòng)態(tài)變化,并利用機(jī)器學(xué)習(xí)方法識(shí)別對(duì)于足月SGA有臨床價(jià)值的代謝標(biāo)志物,為足月SGA發(fā)生機(jī)制的闡釋和早期預(yù)測(cè)提供新的方向及策略。