劉 芳,劉小娟

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041)

結(jié)核病(tuberculosis,TB)是嚴(yán)重危害人民群眾健康的呼吸道傳染病,是我國(guó)重點(diǎn)防控的法定重大傳染病之一,它是威脅人類身體健康和生命安全的重要?dú)⑹帧?018年,世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球新發(fā)結(jié)核病患者約1000萬,死亡157萬[1],全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示我國(guó)活動(dòng)性、涂陽(yáng)和菌陽(yáng)肺結(jié)核的患病率分別為459/10萬、66/10萬和119/10萬,地區(qū)、人群分布差異明顯,西部傳染性肺結(jié)核患病率約為中部的1.7倍,東部的2.4倍,農(nóng)村患病率為城市的1.6倍[2]。結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB) 于1882年由Robert Koch首次提出并認(rèn)定為結(jié)核病的病因[3]。早診斷、早隔離、早治療是減少肺結(jié)核發(fā)病和死亡的關(guān)鍵。但目前大部分結(jié)核病臨床表現(xiàn)不典型,病原標(biāo)本采集困難,大部分患者無法通過傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查獲得病原學(xué)確診[4]。加強(qiáng)結(jié)核感染的實(shí)驗(yàn)室診斷,及早篩查出潛伏性結(jié)核感染者和活動(dòng)性結(jié)核病,已成為當(dāng)前控制結(jié)核菌感染的重中之重。近年來,分子生物學(xué)診斷技術(shù)的迅速發(fā)展讓更多的MTB分子診斷技術(shù)應(yīng)用于臨床,極大提高了MTB的檢出率。本文就分子診斷技術(shù)應(yīng)用于MTB的應(yīng)用作一綜述。

1 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)

1.1 傳統(tǒng)熒光PCR技術(shù)傳統(tǒng)PCR技術(shù)以只存在于MTB復(fù)合群(包括MTB、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌等)種的特異序列IS 6110為檢測(cè)靶點(diǎn),目前可用于鑒別診斷MTB與非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria,NTM)[5]。Wang 等[6]研究顯示,常規(guī)實(shí)時(shí)熒光定量PCR在不同來源標(biāo)本中的靈敏度均顯著高于涂片及培養(yǎng),即使在涂片陰性的情況下其靈敏度及特異度仍較高,分子診斷技術(shù)用于MTB診斷的早期,此方法曾普遍應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,一方面其具有靈敏度高,速度快的特點(diǎn),另一方面由于IS 6110并非存在于所有MTB中,部分樣本中MTB載量較低,甚至缺失,可能導(dǎo)致檢出率低,假陰性等情況。

1.2Xpert? MTB/RIFXpert是以結(jié)核分枝桿菌的RNA聚合酶活性位點(diǎn)編碼區(qū)(81bp rpoB 核心序列)為靶標(biāo),采用半巢式實(shí)時(shí)半定量PCR進(jìn)行MTB及利福平耐藥基因檢測(cè)的方法。無需單獨(dú)的核酸提取步驟,檢測(cè)試劑集成了提取和擴(kuò)增過程,通過擴(kuò)增判讀樣本中是否含有MTB,并對(duì)檢出的MTB序列中rpoB 基因進(jìn)行檢測(cè)來判斷有無利福平耐藥。因?yàn)?5%～90%的利福平耐藥菌株同時(shí)對(duì)異煙肼耐藥,因此Xpert試劑對(duì)rpoB基因的檢測(cè)結(jié)果又可在一定程度上判斷是否為耐多藥結(jié)核菌株。WHO推薦Xpert可作為檢測(cè)疑似結(jié)核、疑似耐多藥結(jié)核或HIV感染的首選方法。研究顯示,對(duì)于結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM),GeneXpert檢測(cè)的靈敏度為23%～52%; 對(duì)于結(jié)核病并發(fā)HIV感染者的腦脊液,GeneXpert檢測(cè)的靈敏度為62%,特異度為87.5 %～98 %[7～14]; 也可以通過腦脊液樣本進(jìn)行離心富集,或提高樣本量至6 ml以上,還可再提高檢測(cè)的靈敏度[9～11]。對(duì)于有TBM癥狀的患者腦脊液,WHO建議優(yōu)先使用GeneXpert檢測(cè)[15]。

2 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是將特定設(shè)計(jì)的DNA探針規(guī)律地固化于芯片表面,形成DNA探針陣列,與熒光標(biāo)記的靶分子進(jìn)行PCR雜交, 通過熒光掃描儀自動(dòng)檢測(cè)雜交熒光信號(hào),能夠在同一時(shí)間內(nèi)對(duì)MTB進(jìn)行檢測(cè)并分型。其具有靈敏度高、通量大、可分型等優(yōu)勢(shì);但也存在芯片制備復(fù)雜、樣品標(biāo)記繁瑣、檢測(cè)成本高、容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增等缺點(diǎn)[16]。 值得一提的是,該方法可以檢測(cè)耐藥一線抗結(jié)核藥物相關(guān)耐藥基因,據(jù)Pang等[17]研究顯示,基因芯片法對(duì)利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為87.56%和97.95%,對(duì)異煙肼耐藥的靈敏度和特異度分別為80.34%和95. 82%。Eiu等[18]對(duì)基因芯片、Xpert和GenoType MTBDR plus三種方法檢測(cè)培養(yǎng)陽(yáng)性痰標(biāo)本MTB及耐藥情況,檢出率分別為78%、92%、49%,提示基因芯片法是一種既能檢測(cè)出結(jié)核菌DNA,也可判斷多重耐藥結(jié)核菌感染的方法。

3 恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是在恒定的溫度下完成擴(kuò)增的一類分子生物學(xué)技術(shù),其特征為基因擴(kuò)增過程不需要溫度梯度的循環(huán)。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)儀器的要求不高,檢測(cè)成本相對(duì)低一些。近年來以該項(xiàng)技術(shù)為基本原理發(fā)展起來的分子診斷技術(shù)主要有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、交叉引物法檢測(cè)技術(shù)(crossing priming amplification,CPA)、實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(simultaneous amplification and testing,SAT)等。2016年,WHO發(fā)布的《TB-LAMP在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用》[19]中,對(duì)來自全球的感染數(shù)據(jù)進(jìn)行了總結(jié)分析,建議在診斷疑似肺結(jié)核患者時(shí)使用TB-LAMP技術(shù)作為補(bǔ)充方法,尤其是痰涂片鏡檢陰性時(shí)有必要使用此技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。Shete 等[20]曾報(bào)道與培養(yǎng)結(jié)果相比較TB-LAMP檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的靈敏度和特異度分別為77.7%和98.1%, 其中涂片陰性患者的樣本檢出靈敏度為42.1%,提示在結(jié)核病高發(fā)地區(qū)TB-LAMP具有較好的診斷能力。CPA是一種同時(shí)具備內(nèi)外部質(zhì)控的MTB核酸檢測(cè)技術(shù),該技術(shù)最主要的特點(diǎn)在于速度快,無需單獨(dú)步驟提取,結(jié)果判讀容易使用。該方法學(xué)雖最早應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)上,但真正大放異彩卻是在2020～2022年新型冠狀病毒疫情期間作為新冠病毒核酸快速檢測(cè)方法應(yīng)用與臨床。Wang等[21]報(bào)道國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究顯示CPA、Xpert檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果及臨床診斷結(jié)果相比靈敏度和特異度相似。CPA在樣本量不大時(shí)能明顯縮短檢測(cè)時(shí)間,具有較高的靈敏度和特異性,適用于發(fā)熱門診及急診。但CPA檢測(cè)只能單管檢測(cè),當(dāng)樣本量較大時(shí),批量檢測(cè)反而更慢。SAT是以MTB特異的16S核糖體RNA為靶點(diǎn)進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)合實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的方法,由于RNA只在活菌中存在,相比其它以DNA為檢測(cè)靶標(biāo)的技術(shù), SAT檢測(cè)結(jié)果與臨床病情發(fā)展實(shí)際情況更一致,可用于檢測(cè)疾病活動(dòng)性、監(jiān)測(cè)用藥療效和判斷治愈程度[22]。

4 高分辨率熔解曲線分析技術(shù)線(high resolution melting,HRM )

高分辨率熔解曲線技術(shù)是通過檢測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物與探針形成雙鏈的解鏈溫度,比較突變序列和野生型序列的溫度差異從而獲得靶基因序列信息[23]。該方法可同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和一線二線抗結(jié)核藥物(異煙肼、利福平、乙胺丁醇及氟喹諾酮類藥品)的耐藥基因。Sharma等[24]用高分辨率熔解曲線技術(shù)在200例肺外結(jié)核患者新鮮組織培養(yǎng)分離菌株中檢測(cè)到22例MDR-TB患者(11%),3例(1.5%)單耐RFP患者,8例(4%)單耐INH患者。同時(shí)HRM也直接從組織中鑒定出4例培養(yǎng)陰性的MDR-TB患者。HRM檢測(cè)結(jié)果和測(cè)序的結(jié)果具有100%的一致性。據(jù)吳劍等[25]報(bào)道,在170例腦脊液標(biāo)本中,探針熔解曲線技術(shù)的陽(yáng)性檢出率與BACTAC MGIT 960快速培養(yǎng)法一致。

5 線性探針(line probe assay, LPA)

LPA技術(shù)應(yīng)用生物素修飾的特異引物擴(kuò)增DNA,PCR產(chǎn)物變性后與固定在膜上的特異寡核苷酸探針雜交,通過雜交信號(hào)而獲得序列信息,酶免疫顯色法顯示檢測(cè)結(jié)果。LPA具有速度快、技術(shù)簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì),但其與基因芯片技術(shù)一樣受膜上探針的限制,不能檢測(cè)出所有的類型。WHO在2016年推薦MTBDRsl用于痰標(biāo)本檢測(cè)[19]。

6 宏基因組測(cè)序技術(shù)(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)

以上技術(shù)是分子診斷技術(shù)發(fā)展過程中最常使用到的一些技術(shù),但這些技術(shù)都有一個(gè)共同點(diǎn),那就是必須預(yù)設(shè)引物,不能完全區(qū)別MTB型別及所有耐藥基因位點(diǎn)。最近幾年,伴隨著二代測(cè)序技術(shù)普遍應(yīng)用于臨床微生物檢測(cè)領(lǐng)域,其在MTB的檢測(cè)也發(fā)揮了重要作用。mNGS直接提取臨床標(biāo)本的全部微生物核酸進(jìn)行無差別和無選擇性的大規(guī)模測(cè)序。再將序列信息與已知微生物數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析,從而判斷樣本中微生物的種類和含量。

6.1 全基因組測(cè)序(wholegenome sequencing,WGS)技術(shù)WGS方法是利用DNA測(cè)序平臺(tái)重新構(gòu)建生物體基因組的完整DNA 序列。WGS對(duì)培養(yǎng)困難的病原體(如MTB)具有明顯優(yōu)勢(shì)。Stucki等[26]在一項(xiàng)研究中,對(duì)520例結(jié)核病患者分離出來 的標(biāo)本進(jìn)行了分型,結(jié)果顯示常規(guī)的基因分型方法可能會(huì)高估MTB在發(fā)病率較低國(guó)家內(nèi)的傳播,因?yàn)椴煌腗TB菌株SNPs發(fā)生相同突變的可能性很小,所以基于鑒定SNPs的WGS基因分型較其他分子分型方法具有更高的分辨率。在這種應(yīng)用場(chǎng)景中WGS在肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷中均具有較高的敏感度[27～30]。有報(bào)道對(duì)23例結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液使用mNGS方法檢測(cè)出陽(yáng)性18例,檢出率為78. 26%,同時(shí)結(jié)合傳統(tǒng)方法還可以將檢出率提高至95. 65%[31]。同時(shí)Xing等[32]在其研究指出,實(shí)驗(yàn)室技術(shù)檢測(cè)腦脊液中MTB的靈敏度依次為WGS(84. 44%)、GeneXpert ( 40% )、PCR (24. 44% )、培養(yǎng)(22. 22% )、涂片(0 % )。

6.2 病原靶向測(cè)序(tNGS)技術(shù)tNGS又稱為“小宏基因測(cè)序”,其結(jié)合多重PCR擴(kuò)增與高通量測(cè)序兩種技術(shù),能夠?qū)Υ郎y(cè)樣本中幾十種至幾百種已知病原微生物及其毒力和/或耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。與WGS相比,tNGS具有病原譜范圍明確、測(cè)序成本低等優(yōu)勢(shì),而在MTB的檢測(cè)中,tNGS的特異度較WGS更高,可同時(shí)進(jìn)行DNA及RNA測(cè)序,且能對(duì)MTB進(jìn)行具體分型。因此,tNGS在病原體檢測(cè)領(lǐng)域正被逐步接受并大范圍應(yīng)用。

7 數(shù)字PCR技術(shù)

數(shù)字PCR技術(shù)是介于高通量測(cè)序技術(shù)與實(shí)時(shí)PCR技術(shù)之間的新型PCR技術(shù),其在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用場(chǎng)景與其余分子診斷技術(shù)不沖突,主要用于絕對(duì)定量低豐度的MTB。有報(bào)道顯示使用dPCR檢測(cè)腦脊液診斷TBM,靈敏度為57.4%,特異性為97.0%,明顯高于GeneXpert和實(shí)時(shí)熒光定量PCR[33]。但其檢測(cè)成本相對(duì)較高、通量不大,也在一定程度上限制了在臨床病原體檢測(cè)中的應(yīng)用規(guī)模。

8 結(jié)語(yǔ)與展望

MTB的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)近年來越來越多的依賴于分子診斷技術(shù)在其中的應(yīng)用。大量分子診斷技術(shù)被研發(fā)并應(yīng)用于MTB的診斷治療中。每一種方法均具有自己的優(yōu)缺點(diǎn),很難有一種方法能覆蓋所有的應(yīng)用場(chǎng)景。盡管分子技術(shù)具有靈敏度高的明顯優(yōu)點(diǎn),但目前而言,MTB的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)率不高的主要原因仍然在于難以獲取含有足夠病原體的優(yōu)質(zhì)樣本及分子診斷技術(shù)中對(duì)MTB核酸提取和DNA富集的較高要求所致。筆者認(rèn)為未來分子診斷技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展及更多的分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn),必然可以進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室MTB檢出率。但并不能片面的一味追求超高的靈敏度,而應(yīng)該綜合考慮患者的病情發(fā)展、經(jīng)濟(jì)狀況、生活環(huán)境等情況,選擇經(jīng)濟(jì)、高效、準(zhǔn)確、精準(zhǔn)、個(gè)性化的檢測(cè)方案。達(dá)到快速檢測(cè)、早期診斷、精準(zhǔn)治療的目的。