陳長強,馬麗芳,王佳誼

(上海市胸科醫(yī)院檢驗科,上海 200030)

近年來,肺癌因其高發(fā)病率和高致死率而嚴重影響著人民群眾的生命健康[1]。據國家癌癥中心統計,2015年我國肺癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位,其中新發(fā)病例約78.7萬,死亡病例約 63.1萬[2]。早期肺癌多無明顯癥狀,臨床上多數患者出現癥狀就診時已屬晚期,約60% 的肺癌患者在初診時即有遠處轉移,晚期患者5年生存率整體不高[3]。目前,低劑量螺旋CT(low-dose spiral CT,LDCT)作為肺癌早期篩查和診斷的標準方法,可顯著提高肺癌患者的生存率[3]。然而,由于LDCT 假陽性率高、輻射暴露等缺點,一定程度上限制了其廣泛的應用。傳統的血液學腫瘤標志物在肺癌的早期診斷、精準治療、個體化治療及預后監(jiān)測等方面具有重要的作用,但受限于檢測靈敏度和特異度等因素,在臨床應用中仍難達到理想的效果。此外,肺癌的臨床診斷需依賴組織活檢,以明確腫瘤組織病理類型和分期等。然而,組織活檢手術有一定的局限性和風險,而常規(guī)生物標志物易受到腫瘤時空異質性的限制。液體活檢(liquid biopsy, LB)作為一種無創(chuàng)方法,相較于傳統的組織活檢,其樣本種類多,取材更易,且能克服腫瘤時空異質性的限制,實現對腫瘤的實時監(jiān)測。在肺癌的早期篩查和診斷、精準治療、療效監(jiān)測、耐藥機制研究及預后評估等方面具有重要作用[4]。

1 液體活檢概述

液體活檢,也稱液態(tài)活檢或液相活檢,是一個相對于組織活檢的概念,廣義上講是指以血液或體液為樣本獲得腫瘤生物學信息的檢測技術。血液是臨床應用中最多的樣本類型,其他樣本還包括尿液、唾液、腦脊液、胸水和腹水等[3]。組織活檢是肺癌診斷的金標準,但組織活檢可能引起患者出現氣胸、肺出血等并發(fā)癥。另外,大約25%的肺癌活檢由于獲取的組織樣品過少而影響患者診斷和病情評估,組織活檢難以重復,且獲取的腫瘤信息受樣本異質性影響較大,只能反映取材部位信息[5]。而液體活檢屬于無創(chuàng)檢測,具有檢測樣本種類多、取材容易、患者依從性高、重復性好等優(yōu)勢,在腫瘤的早期診斷與治療的動態(tài)監(jiān)測方面具有重要意義。另外,與傳統的血清學腫瘤標志物檢測相比,液體活檢的檢測更具靶向性,有利于促進腫瘤的精準化和個體化診治[5]。

2 肺癌液體活檢的標志物

2.1 循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)CTCs于1869年發(fā)現[3],是指從腫瘤病灶(原發(fā)灶或轉移灶)自動脫落或因手術、活檢等影響而被動脫落,并進入外周血的腫瘤細胞,其可以單個細胞存在或多個細胞聚集成細胞團,通過血液循環(huán)系統轉移播散。CTCs包含豐富的腫瘤相關信息[4]。CTCs在患者血液中的有無和數量的多少,一方面代表著原發(fā)惡性腫瘤浸潤入血液中的時間,另一方面也預示著在遠端器官形成轉移灶的可能性。CTCs檢測在肺癌早期診斷、療效判斷、預后評估、個體化治療等方面具有重要價值。

目前,CTCs富集的方法主要有免疫富集法和物理富集法[3]。免疫富集方法可分為免疫磁珠法和微流控芯片免疫吸附法。免疫磁珠法又包括依賴于CTCs細胞表面EpCAM抗原進行的正向富集法和依賴其表面CD45抗原缺失而進行的負向富集法[3]。CellSearch 系統是正向富集法的代表性產品[6],該系統可自動對染色細胞進行拍照、計數和分析。物理富集法主要利用CTCs和血細胞之間的差異(包括大小、相對密度和電特性)來富集 CTCs,主要有濾膜法、密度梯度離心法和二維電泳法等。目前,對于CTCs的檢測方法主要有免疫熒光標記、RNA原位雜交、熒光定量聚合酶鏈反應和流式細胞術等[3]。

理論上,CTCs檢測可提供更全面、更有代表性的腫瘤生物信息,但也有許多臨床局限性。由于外周血中 CTCs豐度非常低,需要高效的富集CTCs方法,以有效地減少背景細胞,并不斷提高CTCs檢測的靈敏度和特異度[7]。目前,CTCs的傳播規(guī)律尚不完全清楚,不同的采樣時間和治療方案可能會有不同的表型、基因型和功能的CTCs,這影響其臨床應用[8,9]。另外,使用單細胞基因組學和轉錄組學分析每個CTC可以更準確地獲得腫瘤相關信息[10],實時動態(tài)監(jiān)測腫瘤變化,分析腫瘤生長規(guī)律,為腫瘤的早期診斷提供更準確的依據,探討研究腫瘤復發(fā)、轉移和耐藥的作用機制,并指導個體化治療[11]。

2.2 循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)游離DNA(Cell-free DNA, cfDNA)是血液中游離的DNA片段,在生理或病理情況下由凋亡或壞死的細胞釋放到血液中,可從血漿中分離出來[12]。血液循環(huán)中的 cfDNA 片段在釋放入血后1小時內即能被迅速清除,因此,在健康人的血漿中,來自正常細胞的 cfDNA 水平較低(平均10～15 ng/ml)。然而,在運動、炎癥、手術或組織損傷等應激條件下,cfDNA 的水平會顯著增加[13]。ctDNA 是一類由凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放的cfDNA,攜帶有腫瘤基因突變、甲基化修飾、拷貝數變異等基因組信息[14]。大多數 ctDNA長度為160～200 bp,與核小體大致相同[7]。ctDNA 進入血液的數量受多種因素的影響,如腫瘤的位置、大小、轉移、血管浸潤、腫瘤的狀態(tài)和分期等。其濃度的改變能夠更精準地表達腫瘤負荷,為癌癥檢測、微小殘留病灶預后研究、轉移控制等帶來關鍵數據[3]。在腫瘤的早期預警、預后判斷、耐藥監(jiān)測及伴隨診斷等多個方面具有良好發(fā)展?jié)撃?。目?ctDNA 檢測技術主要包括擴增受阻突變體系(amplification refractory mutation system , ARMS)、數字 PCR 和 二代測序(NGS)等,均能對ctDNA進行定性或定量分析[3]。

研究發(fā)現,非小細胞肺癌患者(NSCLC)的血漿ctDNA 水平顯著高于慢性呼吸道炎癥患者和健康人群[15]。ctDNA在NSCLC中的診斷靈敏度和特異度分別為90% 和80.5%。此外,II～IV期NSCLC患者血漿中ctDNA檢出率為100%,而在I 期NSCLC患者中檢出率為50%,且ctDNA 水平與腫瘤大小高度相關,并能區(qū)分殘留病灶和治療相關的影像學改變,表明ctDNA 水平能比影像學方法更早地評估療效[16]。應用NGS技術檢測血漿ctDNA中的ALK 基因重排和融合基因,具有良好的靈敏度和特異度,它不僅能檢測ALK 陽性非小細胞肺癌患者突變介導的耐藥性,而且對遠處轉移的非小細胞肺癌患者具有重要意義,可指導臨床的精準用藥[17,18]。血漿ctDNA中檢測EGFR突變狀態(tài)可用于肺癌患者的預后評估,如ctDNA中L858R突變位點可作為一個新的預后評估指標[19]。另外,ctDNA可作為NSCLC患者復發(fā)風險預測標志物,ctDNA高水平患者的總生存期和無進展生存期明顯短于ctDNA低水平患者[20]。

肺癌患者ctDNA中攜帶的生物信息學改變,如基因突變、雜合性缺失、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和基因甲基化等,使其在肺癌的早期診斷、預后評估、精準治療及耐藥監(jiān)測中具有重要價值。然而,與 CTCs一樣,腫瘤患者的 ctDNA 含量很低,半衰期短,易被正常 cfDNA干擾,對檢測技術的靈敏度要求較高[21]。隨著各種新興檢測技術的發(fā)展,檢測過程的標準化,同時結合大量的相關臨床試驗,ctDNA在肺癌的臨床應用潛能將進一步被挖掘。

2.3 外泌體(EVs)外泌體發(fā)現于1983年,是一種膜性囊泡結構[22],屬于胞外囊泡(EV),直徑為40～160 nm(平均直徑約100 nm),起源于內體系統,由不同類型的細胞釋放。根據大小、形態(tài)和起源可分為外泌體、內囊體、微泡體和凋亡小體[23]。外泌體廣泛存在于唾液、血液、支氣管肺泡灌洗、痰液及其他體液中。其攜帶多種蛋白質、脂質、DNA、RNA和其他的生物學信息。表面標志物主要包括CD63、CD81、CD9、TSG101和HSP27等[24]。外泌體在維持細胞內的動態(tài)平衡中有重要作用,作為細胞間信息傳輸的載體,以轉移信息分子如 DNA、非編碼 RNA(如miRNA 和長鏈非編碼 RNA,lncRNA),mRNA和蛋白質等。外泌體是自我調節(jié)的,也可通過自分泌或旁分泌機制調節(jié)相鄰細胞和遠處靶細胞,并介導細胞的生理和/或病理活動[25]。外泌體參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的血管生成、EMT、侵襲和轉移、免疫逃逸、耐藥性等,具有良好的臨床應用前景。

研究發(fā)現,外泌體中miRNA(mir-379,mir-378a,mir-139-5p 和 mir-200b-5p)可用于肺癌患者的鑒別診斷[8]。同時,外泌體中miRNA可作為NSCLC鑒別診斷的標志物,如含有 mir-30e-3p,mir-30a-3p,mir-181-5p 和 mir-361-5p 的外泌體是肺腺癌的特異性診斷標志物,而含有 mir-15b-5p,mir-10b-5p 和 mir320b 的外泌體可用作肺鱗癌的特異性診斷標志物[26]。另外,外泌體中miRNA在肺癌耐藥機制的研究中也有重要的應用價值。

提取和純化技術是目前外泌體液體活檢中的關鍵,盡管國內外學者在基于外泌體密度大小、尺寸大小、表面分子標志物和電荷親和力及微流控芯片等方法的研究中取得了一定的進展[27],但目前耗時費力且難以質控和標準化的分離純化步驟仍然是外泌體液體活檢臨床應用的主要限制因素[28,29]。

2.4 其他潛在標志物外周血循環(huán)RNA 是指細胞外RNA,包括mRNA,miRNA,lncRNA及其他類型的RNA,由細胞主動分泌和/或凋亡后釋放到血液或其他體液中。miRNA 是一種內源性非編碼 RNA,大小約為18～25個核苷酸,可調節(jié)各種癌基因和抑癌基因的表達[30]。研究發(fā)現,NSCLC患者血清中Let-7A[31]和miR-125[32]的表達水平均與健康對照組有顯著的差異,其中miR-125診斷NSCLC的靈敏度和特異度分別為82%和77%[32]。另外,隨著測序技術的發(fā)展,大量的LncRNAs被發(fā)現參與調控各種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展。如LncRNA H19在肺癌患者血漿中顯著增加,使其成為肺癌輔助診斷的潛在生物標志物[33]。LncRNA MIR22HG具有腫瘤抑制劑的功能,并有可能成為肺癌的新的治療靶點[34]。LncRNA p53誘導的轉錄本(LINC-PINT)是一種具有抑癌基因功能的LncRNA,與各種腫瘤的進展及惡化相關,其在肺癌中表達降低可提示預后不良或較晚的腫瘤臨床分期[35]。

循環(huán)腫瘤細胞導致血小板凝聚,產生血小板-腫瘤細胞復合體,以此幫助腫瘤細胞抵抗因血液剪切力造成的機械損傷和保護腫瘤細胞逃脫免疫系統的攻擊。循環(huán)血小板在其整個生命周期內一方面與腫瘤細胞相互作用,獲取腫瘤相關的生物分子;另一方面還可以不斷攝取并富集循環(huán)中游離的蛋白質、核酸以及囊泡、顆粒等。其蛋白質組和 RNA 表達譜發(fā)生顯著變化,因此被稱為“腫瘤誘導血小板(TEPs)”。得益于其封閉的膜結構,其獲得腫瘤相關的生物學信息得以完整保存,成為腫瘤來源的生物活性分子的生物儲存庫。因此,TEPs成為腫瘤液體活檢的新型檢測標志物。TEPs參與多種實體腫瘤的進展和擴散,TEPs檢測在早期和晚期NSCLC患者的診斷準確率分別為81%和88%。NSCLC患者中ITGA2B 水平明顯高于對照組,將ITGA2B與癌胚抗原和腫瘤分期聯合可作為預后評估指標。另外,ITGA2B可以改善 I 期NSCLC的鑒別診斷,并能有效區(qū)分良惡性結節(jié)[36]。

另外,血管生成是腫瘤惡性增殖和分化的前提,許多腫瘤來源的內皮細胞(TECs)進入血液并轉化為循環(huán)腫瘤內皮細胞(CTECs)[37]。CTECs 在肺癌的早期診斷、治療監(jiān)測和預后評估中具有較好的應用價值,但目前仍尚處于研究階段,還需要更多的臨床試驗進行驗證。

3 小結與展望

相較于傳統組織活檢,液體活檢受腫瘤異質性影響小,因無創(chuàng)、重復性高、實時監(jiān)測等特點,在肺癌的早期篩查和診斷、精準治療、治療監(jiān)測及預后評估等方面臨床應用前景良好[38]。作為肺癌液體活檢中三類應用最為常見的標志物,CTCs 、ctDNA和外泌體可從不同的角度為肺癌的早期診斷、治療監(jiān)測、預后評估及耐藥監(jiān)測等方面提供有用的信息。近年來,ctDNA檢測方法的靈敏度和準確度不斷提高;基因組、轉錄組以及蛋白質組學等在EVs檢測中廣泛發(fā)展;CTCs 從單純計數逐漸轉變至表型功能分析和單細胞測序分析[38]。然而目前各檢測技術的標準化和質量控制體系尚待建立與完善,一定程度上限制了液體活檢在臨床診療中的推廣應用。未來,在不斷提高各檢測技術靈敏度、準確度的同時,建立標準化的檢測方法,完善質量控制體系,同時擴大臨床試驗的規(guī)模和范圍,促進液體活檢在肺癌臨床診療中更廣泛和深入的應用。