劉 媛

(西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川 成都 610083)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是急性和慢性肝病的常見原因。世界衛(wèi)生組織估計(jì),2019年有150萬人感染HBV,296億人患有慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)[1]。HBV是肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最常見的病因,與未感染的患者相比,HBV感染者發(fā)生HCC的相對風(fēng)險(xiǎn)增加15～20倍,全球約50%的HCC病例都是由HBV引起的[2]。盡管核酸類似物(nucleotide analogues,NAs)或干擾素可以有效地抑制HBV復(fù)制,但無法清除共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。目前抗HBV治療的目的主要是抑制與進(jìn)展性炎癥和纖維化相關(guān)的并發(fā)癥,即肝功能衰竭和失代償性肝硬化[3,4]。除了永久抑制病毒滴度外,乙型肝炎治療的最終目標(biāo)是在出現(xiàn)或不出現(xiàn)乙型肝炎表面抗體的情況下實(shí)現(xiàn)乙型肝炎表面抗原的消失,即功能性治愈[5]。一些國際肝病學(xué)會及中國慢性乙肝防治指南建議,某些患者可以停止NAs治療,特別是那些沒有肝硬化和谷丙轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)正常和無法檢測到HBV DNA的患者[3,6]。停用NAs的優(yōu)點(diǎn)包括增加HBsAg消失率,提高患者依從性,減少長期使用藥物的副作用及降低治療費(fèi)用。但也存在一些風(fēng)險(xiǎn),比如嚴(yán)重的臨床復(fù)發(fā)可導(dǎo)致肝臟失代償或死亡[7]。選擇可以停止治療的標(biāo)志物具有挑戰(zhàn)性,需要平衡風(fēng)險(xiǎn)和收益,最好的標(biāo)志物是那些能夠預(yù)測較低的臨床復(fù)發(fā)和較高的HBsAg消失率的分子。最近的研究報(bào)道了一些HBV生物標(biāo)志物用于預(yù)測停藥后的預(yù)后情況,其中包括定量乙型肝炎表面抗原(qHBsAg)[8],乙型肝炎核心相關(guān)抗原(HBcrAg)[9],HBV RNA[10]以及一些預(yù)測模型[11]。本文針對上述HBV治療效果評估生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 乙型肝炎表面抗原定量檢測(quantitative hepatitis B surface antigen,qHBsAg)

HBsAg是HBV的外殼蛋白,從HBV的生命周期來看,HBsAg起源于cccDNA和整合型HBV DNA,反映了它們的轉(zhuǎn)錄活性。HBsAg的定性檢測可用于篩查和診斷HBV感染,其定量檢測可提示治療反應(yīng)、病毒學(xué)應(yīng)答預(yù)測和疾病進(jìn)展等信息。HBsAg消失被認(rèn)為是HBV功能性治愈的標(biāo)志[12]。血液中大約99.99%的HBsAg存在于SVPs中[13]。對于完全病毒學(xué)應(yīng)答或HBeAg陰性的CHB患者,大多數(shù)血清HBsAg來自整合型HBV DNA,而不是cccDNA[14]。整合型HBV DNA存在于整個(gè)肝臟中,并形成大量的HBsAg,獨(dú)立于HBV的復(fù)制[15]。

1.1 血清HBsAg水平與其他標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)在抗病毒治療期間,HBsAg水平與血清HBV DNA相關(guān),HBsAg定量檢測可以反映HBeAg陽性患者的HBV DNA水平,但不能替代HBeAg陰性患者的HBV DNA水平[16]。在一項(xiàng)回顧性研究中,HBsAg水平和血清HBV pgRNA中度相關(guān)[17]。血清HBsAg水平被證明可以反映肝臟中的cccDNA水平。無論是基線水平還是治療期間的降低水平,HBsAg與cccDNA和肝內(nèi)HBV DNA水平均有良好相關(guān)性[18]。然而,在HBeAg陽性患者中,基線HBsAg和cccDNA水平的相關(guān)性仍存在爭議[19]。

1.2 qHBsAg在抗病毒治療結(jié)果預(yù)測中的作用治療前較低的HBsAg水平以及治療早期HBsAg的大幅下降,與更高的peg-IFN 持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答以及HBsAg消失率相關(guān)[20]。治療誘導(dǎo)HBsAg消失的可能性可通過qHBsAg基線水平進(jìn)行預(yù)測,例如HBeAg陰性的CHB患者達(dá)到HBsAg血清清除的基線血清qHBsAg明顯較低,低于50 IU/ml的基線水平能夠準(zhǔn)確預(yù)測HBsAg消失[21]。Lim等評估了qHBsAg、HBV RNA和qHBcrAg在預(yù)測HBsAg消失方面的作用。發(fā)現(xiàn)治療第8周時(shí),qHBsAg<70 IU/ml是預(yù)測HBsAg消失的獨(dú)立因素指標(biāo)[22]。

大多數(shù)研究認(rèn)為,在HBsAg消失后,NAs可以停止使用。但只有少數(shù)CHB患者可以實(shí)現(xiàn)HBsAg消失。探究HBsAg基線水平或治療結(jié)束(end of treatment,EOT)HBsAg水平能否預(yù)測HBsAg消失前NAs停止至關(guān)重要。Liu等發(fā)現(xiàn),在停止NAs治療的乙型肝炎e抗原(HBeAg)陰性CHB患者中,基線和EOT HBsAg水平可作為預(yù)測HBV復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物[23]。EOT HBsAg水平與臨床復(fù)發(fā)或病毒學(xué)復(fù)發(fā)有很強(qiáng)的相關(guān)性,較低的EOT HBsAg可能是指導(dǎo)NAs停止的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。但EOT HBsAg預(yù)測NAs停止的最佳臨界值仍存在爭議。Sonneveld等[24]分析了1216例NAs治療HBeAg陰性并停藥的CHB患者,發(fā)現(xiàn)停藥時(shí)HBsAg<100 IU/ml是預(yù)測停藥后HBsAg持續(xù)陰轉(zhuǎn)的指標(biāo)之一。

1.3 HBsAg的定量檢測研究從血清或血漿樣本中定量HBsAg通常使用高通量自動(dòng)免疫分析儀進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECLIA)測試。雅培Architect HBsAg QT檢測儀可在不稀釋樣本的情況下動(dòng)態(tài)測定0.05～250 IU/ml。羅氏Elecsys HBsAg II測定法和索林LIAISON-XL Murex HBsAg定量法測定法的動(dòng)態(tài)范圍分別為0.05～130 IU/ml和0.03～150 IU/ml。最近,也開發(fā)了超靈敏的定量HBsAg檢測方法,將檢測限降低為0.2～5 mIU/ml[25]。不同檢測設(shè)備及特點(diǎn)見表1。

2 乙型肝炎病毒核心抗原相關(guān)抗原(hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)

HBcrAg由前核/核心區(qū)域編碼的三種蛋白質(zhì)組成,包括HBeAg、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和22-kDa前核蛋白(p22cr)[27]。HBeAg是肝細(xì)胞分泌的一種循環(huán)肽,由前核蛋白經(jīng)蛋白水解而來。HBcAg是病毒粒子的組成部分,在病毒DNA周圍形成核衣殼。p22cr是一種22 kda的前核蛋白,存在于HBV DNA陰性的空Dane樣顆粒中。這三種蛋白質(zhì)共享149個(gè)氨基酸序列。通過血清學(xué)檢測方法,HBcAg、p22cr和HBeAg均可作為HBcrAg檢測[28]。

2.1 HBcrAg與其他生物標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)血清HBcrAg水平在HBV感染的不同階段有所差異,與肝內(nèi)cccDNA水平以及血清HBV DNA水平密切相關(guān)。Testoni等[29]證實(shí)HBeAg陽性患者的血清HBcrAg水平明顯高于未接受抗病毒治療的HBeAg陰性患者。除了轉(zhuǎn)錄活性外,它們還與血清HBV DNA、肝內(nèi)HBV DNA、pgRNA和cccDNA水平相關(guān)。HBcrAg陰性(<3 log U/ml)患者肝內(nèi)cccDNA數(shù)量和cccDNA活性均低于HBcrAg陽性患者。Hasegawa等[30]建立了CHB患者肝內(nèi)cccDNA水平的預(yù)測模型。該方法基于所使用的變量(FBS、HBcrAg、HBeAg和HBsAg)命名為FBS-cres評分,發(fā)現(xiàn)HBcrAg和FBS-cres評分均與cccDNA水平顯著相關(guān)。HBcrAg與HBV DNA的相關(guān)性在HBV感染的不同階段有所不同,而HBcrAg與HBsAg在所有階段均呈中度相關(guān)[31]。

2.2 HBcrAg在抗病毒治療終止點(diǎn)預(yù)測中的作用肝病學(xué)會HBV感染管理指南描述了停止NAs治療的三個(gè)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)[32]:①至少給藥2年;②采用PCR法檢測不到血清HBV DNA水平;③停止治療時(shí)血清HBeAg陰性。當(dāng)這些標(biāo)準(zhǔn)滿足時(shí),復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)可以通過EOT HBsAg和HBcrAg水平來確定。Matsumoto 等[33]也發(fā)現(xiàn)EOT HBcrAg水平>3.7 log U/ml預(yù)測停用NAs后1年內(nèi)病毒學(xué)復(fù)發(fā)。Huang等[34]發(fā)現(xiàn)EOT HBcrAg<4 log10 U/ml和HBsAb>2 log10 IU/L的組合對持久性功能性治愈的預(yù)測價(jià)值為100%。Sonneveld等[7]研究了EOT HBcrAg和HBsAg水平與治療停止后結(jié)局的關(guān)系。較低的HBcrAg水平與較高的病毒學(xué)應(yīng)答率及HBsAg消失顯著相關(guān)。HBcrAg水平未檢測到的患者(<2 log U/ml)有最高的病毒學(xué)應(yīng)答和HBsAg消失率。在HBcrAg水平較高的患者中,更易觀察到ALT反彈。Tseng等[35]發(fā)現(xiàn)恩替卡韋或富馬酸替諾福韋二吡酯治療的CHB患者,基線HBcrAg≤4 log U/ml和EOT HBsAg水平≤20 IU/ml聯(lián)合應(yīng)用可降低HBV復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn),增加HBsAg消失率,有助于停藥策略的制定。因此,血清HBcrAg作為替代標(biāo)志物,可能對計(jì)劃停用NAs的患者有較好的預(yù)測作用。

2.3 HBcrAg的檢測化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法的發(fā)展,HBcrAg的檢測取得了快速進(jìn)展。通過HBcrAg檢測反映HBV感染進(jìn)展不受血清中HBeAg清除或HBV基因組中存在前核突變的影響。目前HBcrAg定量檢測的下限為100 U/ml,但推薦的臨界值為1000 (3 log U/ml)[36]。Mak 等[37]使用日本FujirebioLumipulse G1200 CLEIA分析儀,HBcrAg檢測下限為2.0 logU/ml(即 100 U/ml),線性范圍為3.0～7.0 log U/ml。與僅測量HBcAg相比,最近也開發(fā)了p22cr(空顆粒)和HBeAg自動(dòng)檢測系統(tǒng),通過使測試樣品中的抗-HBc和抗-HBe失效而更加敏感和快速[37]。日本肝病學(xué)會指南將HBcrAg水平用于識別低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者,HBsAg和HBcrAg的臨界值分別為<1.9 log U/ml或<3.0 log U/ml[32]。但如何在CHB患者管理中更好地使用這種新的檢測方法仍然存在爭議[38]。

3 HBV RNA

血清HBV RNA有幾種存在形式,包括HBV前基因組 RNA(pregenomic RNA,pgRNA)、pgRNA剪接變異體和3’端截短型pgRNA以及HBx轉(zhuǎn)錄本[39]。HBV前基因組RNA可在培養(yǎng)的肝細(xì)胞、患者肝活檢和患者血清中檢測到。HBV pgRNA是cccDNA的轉(zhuǎn)錄本,用于基因組復(fù)制,是血清HBV RNA的主要成分。pgRNA已被檢測到其全長形式(flRNA),以及3’截?cái)嗪碗[聚腺苷化形式(trRNA),非多聚腺苷化3’截?cái)嘈问絒40]和flRNA的剪接變體[41]。此外,Stadelmayer等[42]使用5’RACE RT-PCR檢測了HBeAg陽性CHB患者血漿中HBx轉(zhuǎn)錄本的變異。

3.1 HBV RNA與其他標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)許多研究評估了HBV RNA與其他傳統(tǒng)或新型HBV生物標(biāo)志物之間的相關(guān)性,及其作為替代生物標(biāo)志物的效用。在初治患者中,HBeAg陽性CHB患者的血清HBV RNA水平高于HBeAg陰性患者[43]。此外,治療和未治療患者的血清HBV DNA和血清HBV RNA水平之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性[44]。在初治患者中,血清HBV RNA也被發(fā)現(xiàn)與HBcrAg相關(guān)[45],并與HBsAg和HBeAg中度相關(guān)[43]。對初治患者進(jìn)行單因素分析的研究表明,血清HBV RNA水平與年齡、HBeAg狀態(tài)、HBV基因型以及HBV DNA、HBsAg和HBcrAg水平顯著相關(guān)[17]。

理論上,血清HBV RNA是肝臟cccDNA水平的潛在預(yù)測因子,但似乎依賴于HBeAg狀態(tài)。Wang等調(diào)查了初治患者慢性感染階段之間的相關(guān)性,結(jié)果表明HBV復(fù)制中間產(chǎn)物與血清HBV RNA的比例因CHB階段而異。與HBeAg陰性相比,HBeAg陽性慢性感染期血清HBV RNA和肝臟HBV DNA的比值最高。血清HBV RNA和DNA之間的相關(guān)性在慢性感染的四個(gè)階段后仍然存在,但與其他標(biāo)志物的相關(guān)性減弱[17]。同樣,Liu等[46]發(fā)現(xiàn)HBeAg陰性慢性感染期血清HBV RNA水平明顯低于HBeAg陰性慢性肝炎期,表明HBV RNA可用于區(qū)分初治患者的這兩個(gè)感染階段。但必須指出的是,在識別HBeAg陰性患者的慢性感染和慢性肝炎階段時(shí),HBV DNA比血清HBV RNA更有效。

血清HBV RNA與HBeAg陽性感染期密切相關(guān),有潛力預(yù)測NAs和/或peg-IFN治療期間HBeAg血清轉(zhuǎn)化。van B?mmel等人的研究表明,與未實(shí)現(xiàn)血清轉(zhuǎn)化的患者相比,接受NAs治療的患者實(shí)現(xiàn)了HBeAg血清轉(zhuǎn)化,從基線到治療開始后6個(gè)月,flRNA和trRNA水平下降幅度更大[39]。血清HBV RNA陰性的NAs治療患者更多實(shí)現(xiàn)了HBeAg清除,并且時(shí)間更短[47]。

3.2 HBV RNA在抗病毒治療終止點(diǎn)預(yù)測中的作用由于血清HBV RNA在HBV病毒完全抑制的患者中仍可檢測到,其在預(yù)測治療停止后病毒反彈具有潛在價(jià)值。可用于識別肝內(nèi)cccDNA轉(zhuǎn)錄活性低的患者,這些患者治療停止后復(fù)發(fā)的可能性更高。研究人員對33例接受標(biāo)準(zhǔn)NAs治療3年且HBV DNA檢測不到的患者進(jìn)行了調(diào)查。治療結(jié)束時(shí)可檢測到HBV RNA的21例患者均發(fā)生了病毒學(xué)復(fù)發(fā),而12例檢測不到HBV RNA的患者中只有3例發(fā)生了病毒學(xué)復(fù)發(fā)[48]。Carey等在三個(gè)不同的臨床隊(duì)列中探索了HBV RNA的重要性,觀察到即使當(dāng)HBV DNA無法檢測到時(shí),HBV仍在繼續(xù)復(fù)制,停止治療時(shí)pgRNA的水平可以代表cccDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,并可以預(yù)測HBeAg陰性患者在NAs停用后HBV DNA的再激活和HBV感染加重[49]。對于HBeAg陽性患者,Tsuge等發(fā)現(xiàn)HBV DNA聯(lián)合RNA與ALT反彈略有關(guān)聯(lián)[50]。在一項(xiàng)來自2個(gè)獨(dú)立隊(duì)列的研究中,Fan等還證明,停止治療時(shí)HBV DNA和RNA均為陰性可以指示無肝硬化的HBeAg陽性患者停止NAs治療[51]。此外,Seto等還建議HBV RNA檢測不出且血清HBsAg<10 IU/ml可預(yù)測停止治療且反彈風(fēng)險(xiǎn)低,對于HBV RNA≥44.6 U/ml的患者不應(yīng)考慮停藥[10]。

值得關(guān)注的是,在一項(xiàng)接受NAs治療中位持續(xù)時(shí)間為13.4年的隊(duì)列研究中,血清HBV RNA、DNA和肝臟cccDNA水平未檢測到的患者,在治療停止后仍發(fā)生了病毒或ALT反彈[52]。推測延長NAs處理可能使cccDNA池減少到血清HBV RNA過低而無法檢測的程度。因此,血清HBV RNA用于預(yù)測病毒學(xué)復(fù)發(fā)的一個(gè)重要因素可能是檢測血清RNA的敏感性。國內(nèi)的一項(xiàng)專家共識建議,對于符合現(xiàn)行停藥標(biāo)準(zhǔn)的接受鞏固治療的CHB 患者,若血清 HBV RNA 檢測陽性,應(yīng)持續(xù)進(jìn)行抗病毒治療以避免停藥帶來的疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[53]。

3.3 HBVRNA的檢測血清HBV RNA檢測和定量的主要方法包括基于cDNA末端快速擴(kuò)增RT-qPCR(rapid amplification of cDNA ends RT-qPCR,RACE RT-qPCR)、標(biāo)準(zhǔn)RT-qPCR和液滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)。RACE RT-PCR檢測3’聚腺苷酸化RNA由K?ck等首次開發(fā),該方法已被廣泛用于檢測血清pgRNA[54]。van B?mmel等創(chuàng)建了在質(zhì)?；騌NA標(biāo)準(zhǔn)曲線存在的情況下通過實(shí)時(shí)PCR對血清HBV RNA相對定量,并設(shè)計(jì)了特異性引物檢測flRNA和trRNA[39]。一些研究小組也采用了RT-qPCR方法檢測血清總HBV RNA,其中反轉(zhuǎn)錄涉及一個(gè)引物結(jié)合到HBV RNA的5 ′端[42]。Wang等首次使用RT-ddPCR該方法擴(kuò)增preC/C和聚合酶編碼區(qū)域內(nèi)的引物[55]。也有研究采用RT-ddPCR報(bào)道了更高的檢測限。

總之,雖然已經(jīng)開發(fā)了幾種方法來檢測血清HBV RNA并確定這一生物標(biāo)志物的臨床相關(guān)性,但由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的方法和分析靶點(diǎn),很難對研究進(jìn)行比較。盡管如此,血清HBV RNA已被證明是一種有價(jià)值的生物標(biāo)志物。

4 展望

除上述生物標(biāo)志物外,也有一些報(bào)道發(fā)現(xiàn)抗-HBc以及免疫標(biāo)志物如CD38和Ki67等對HBV治療效果具有指導(dǎo)意義[57],但仍需要進(jìn)行大樣本、長期隨訪和多中心研究,以確定其效果。另外也有研究綜合各項(xiàng)指標(biāo)提出預(yù)測模型,多項(xiàng)研究指出SCALE-B評分是預(yù)測病毒學(xué)復(fù)發(fā)和HBsAg消失的一個(gè)有力工具。停藥時(shí)較高的SCALE-B評分與較低的病毒復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),SCALE-B評分<320的患者中更易觀察到HBsAg消失[9,11,58]。

世界衛(wèi)生組織提出了到2030年消除肝炎危害的目標(biāo),我國作為病毒性肝炎高發(fā)區(qū),對CHB患者的個(gè)性化治療和精細(xì)化管理更加重要。精確生物標(biāo)志物的開發(fā)有助于提高我們對HBV感染自然過程的理解和抗病毒治療過程的優(yōu)化。近些年的新型生物標(biāo)志物對風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測更加準(zhǔn)確,但也需看到理想的抗病毒治療程序和預(yù)測標(biāo)志物仍然是一個(gè)不斷發(fā)展的課題,在今后工作中仍需不斷優(yōu)化和改進(jìn)。