黃 俊,吳夏楠,曹 炬

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,重慶 400016;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院檢驗(yàn)科,陜西 西安 710038)

艱難梭菌(clostridioides difficile, CD),最初被命名為艱難芽孢桿菌(bacillus difficile),是一種革蘭氏陽(yáng)性、有鞭毛且專性厭氧的芽孢桿菌[1]。CD主要以孢子的形式通過(guò)糞-口途徑傳播,廣泛分布于人和動(dòng)物的腸道以及環(huán)境中。CD存活能力強(qiáng),其芽孢可在自然環(huán)境中存活數(shù)月,普通消毒劑很難將其殺滅[2]。雖然這種細(xì)菌已確定為健康新生兒正常腸道菌群中的一部分,但Hall等[1]指出這種生物能夠在動(dòng)物中引起疾病,可能是通過(guò)產(chǎn)生可溶性外毒素所導(dǎo)致的。近年來(lái),抗生素、免疫抑制劑、激素類藥物和放化療藥物等使用日益增加及高毒力菌株ST-1(BI/NIP1/027)的暴發(fā)流行,艱難梭菌感染(clostridioides difficile infection, CDI)的發(fā)病率和嚴(yán)重程度在全球范圍內(nèi)一直呈上升趨勢(shì),目前已是院內(nèi)感染性腹瀉和抗生素相關(guān)性腹瀉的主要病原菌之一[3～8]。因此,艱難梭菌感染的診斷和治療面臨著巨大挑戰(zhàn),本文對(duì)CDI的診斷相關(guān)生物標(biāo)志物和治療的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,為臨床工作者們提供診療思路。

1 艱難梭菌的致病機(jī)制

在正常情況下,人體腸道中的微生物菌群維持著良好的穩(wěn)態(tài)平衡。然而,在長(zhǎng)期或不規(guī)范使用廣譜抗生素、免疫抑制劑、激素和放化療藥物以及高齡因素的影響下,腸道定植能力減弱,腸道菌紊亂,CD大量繁殖同時(shí)釋放毒素破壞腸黏膜細(xì)胞并損傷腸壁,從而引起以發(fā)熱、腹痛、腹瀉為主要臨床癥狀的艱難梭菌相關(guān)性腹瀉(clostridium difficile associated diarrhea,CDAD),其臨床表現(xiàn)可從輕度的自限性腹瀉到嚴(yán)重的偽膜性腸炎,甚至中毒性巨結(jié)腸,繼而誘發(fā)腸穿孔、腹腔感染、敗血癥等[6, 9]。

1.1 Tcd A和Tcd B在大多數(shù)CD菌株中,致病性位點(diǎn)通常編碼五種蛋白質(zhì),定位于染色體的特定位置[10]。由致病性位點(diǎn)編碼的主要毒素是TcdA(也稱為ToxA)和TcdB(也稱為ToxB),這是兩種分泌性蛋白[11, 12]。毒素與宿主細(xì)胞表面特定的受體形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞,核內(nèi)體的酸化使毒素蛋白肽鏈C端可結(jié)合的重復(fù)寡肽序列(CROPs)結(jié)構(gòu)域嵌入核內(nèi)體膜,并隨后將半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(CPD)和葡萄糖轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(GTD)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。肌醇六磷酸(IP6)激活半胱氨酸蛋白酶裂解并釋放具有毒性的糖轉(zhuǎn)移酶。GTD發(fā)揮催化作用使RHO或RAC GTPase家族糖基化,GTP結(jié)合蛋白失活,上皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白發(fā)生解聚,細(xì)胞骨架損壞,最終導(dǎo)致腸上皮緊密連接和上皮完整性的破壞[10, 13, 14]。多項(xiàng)研究表明[15～20],雖然TcdA和TcdB在大多數(shù)感染中都起一定作用,但TcdB在疾病的嚴(yán)重程度方面可能更重要。

1.2 Tcd R、Tcd C和Tcd E致病基因位點(diǎn)還編碼另外三種蛋白質(zhì),TcdR、TcdC和TcdE[13]。在艱難梭菌穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí), TcdR驅(qū)動(dòng)TcdA和TcdB的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)TcdA和TcdB的蛋白表達(dá)[21]。在指數(shù)生長(zhǎng)期間,艱難梭菌表達(dá)更高水平的TcdC,從而抑制TcdA和TcdB的轉(zhuǎn)錄,但艱難梭菌的超毒力與TcdC序列的缺失有關(guān)[22, 23]。TcdE編碼一種膽堿樣蛋白,有助于缺乏常規(guī)分泌信號(hào)序列的TcdA和TcdB的分泌[13]。最近的研究表明,在分泌大量毒素的艱難梭菌菌株中,TcdE參與了TcdA和TcdB的分泌[24]。

1.3 二元毒素(CDT)某些CD菌株,尤其是高毒力菌株ST-1(BI/NIP1/027)可以產(chǎn)生第三種毒素,稱為艱難梭菌轉(zhuǎn)移酶或者二元毒素 (Binary toxin,CDT),其可能增強(qiáng)CD菌株的毒力[13]。盡管CDT的存在與患者較高的死亡率之間存在關(guān)聯(lián),但CDT在毒力中的作用尚未得到證實(shí)[7]。CDT由CdtA和CdtB兩種蛋白質(zhì)組成,CdtB亞基與細(xì)胞受體(LSR)結(jié)合,酸化的核內(nèi)體上形成孔,CdtA亞基被釋放到細(xì)胞質(zhì)中[25～27]。CdtA的ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活化后可抑制細(xì)胞膜附近的肌動(dòng)蛋白聚合[13]。目前有研究表明[28～30],在小鼠感染模型中CDT還可以通過(guò)抑制宿主保護(hù)性的嗜酸性粒細(xì)胞反應(yīng)或促進(jìn)細(xì)菌的粘附和定植來(lái)增強(qiáng)艱難梭菌的毒性。

1.4 其他毒力因素鞭毛能控制細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和粘附,對(duì)艱難梭菌的定殖效率和毒力極為重要,腸上皮粘附受損與鞭毛有關(guān),同時(shí)也有研究表明鞭毛蛋白的表達(dá)和毒素調(diào)節(jié)之間存在聯(lián)系[31～34]。此外,有粘附力的纖連結(jié)合蛋白A,細(xì)胞壁蛋白如Cwp66, S層蛋白A及其修飾蛋白酶Cwp84,甚至Spo0A(產(chǎn)孢的主要調(diào)節(jié)因子)都有助于艱難梭菌粘附,并在生物膜形成中發(fā)揮作用[35～37]。

2 CDI的分子診斷相關(guān)標(biāo)志物

2.1 毒素發(fā)生CDI時(shí),機(jī)體結(jié)腸炎癥損傷主要是CD產(chǎn)毒株釋放的毒素所引起的。同時(shí)有研究表明,CDI所導(dǎo)致的疾病嚴(yán)重程度與機(jī)體內(nèi)的CD毒素水平密切有關(guān)。因此,TcdA和TcdB常作為臨床輔助診斷艱難梭菌感染的生物標(biāo)志物,檢測(cè)體內(nèi)是否存在毒素及其水平尤為重要。目前毒素的檢測(cè)可通過(guò)細(xì)胞毒性中和試驗(yàn)、產(chǎn)毒株素培養(yǎng)、毒素免疫檢測(cè)、艱難梭菌毒素基因檢測(cè)等方法。毒素的檢測(cè)在CDI臨床診斷中特異性高,細(xì)胞毒性中和試驗(yàn)被認(rèn)為是CDI實(shí)驗(yàn)室診斷的參考方法。

2.2 谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)GDH是一種高度保守的代謝酶,其屬于抗原性酶蛋白,在所有艱難梭菌表面表達(dá)高且穩(wěn)定性好,常用酶免疫法直接檢測(cè)糞便中的GDH[38]。GDH檢測(cè)成本低,簡(jiǎn)單快速且敏感度高,可作為常規(guī)檢測(cè)CDI的診斷工具之一[39]。因所有艱難梭菌菌株都能表達(dá)高水平的GDH,所以檢測(cè)GDH不能區(qū)分產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒株[40]。GDH陽(yáng)性僅表明存在艱難梭菌,GDH檢測(cè)陰性則可排除艱難梭菌感染[41]。因此,GDH可作為糞便標(biāo)本中艱難梭菌存在的相關(guān)生物標(biāo)志物,但其不作為快速診斷CDI的首選方法[9]。

2.3 乳鐵蛋白和鈣衛(wèi)蛋白乳鐵蛋白和鈣衛(wèi)蛋白主要是來(lái)自中性粒細(xì)胞的兩種蛋白質(zhì),由胃腸道在感染和粘膜炎癥反應(yīng)時(shí)釋放,可被常規(guī)用于監(jiān)測(cè)腸道疾病患者的炎癥水平[42]。艱難梭菌感染發(fā)生后,宿主的腸組織學(xué)特征為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),糞便乳鐵蛋白或鈣衛(wèi)蛋白可能是診斷疾病活動(dòng)程度的潛在生物標(biāo)志物[41]。一些研究顯示,CDI患者的乳鐵蛋白和鈣衛(wèi)蛋白水平高于CD檢測(cè)陰性的腹瀉患者和非腹瀉對(duì)照組[43～45]。然而,糞便中乳鐵蛋白和鈣衛(wèi)蛋白水平存在巨大變異性,CDI患者與對(duì)照組之間存在重疊[46, 47]。這兩種檢測(cè)的敏感度和特異度低,因此,不推薦將這兩種蛋白用于常規(guī)篩查。

2.4 免疫細(xì)胞因子發(fā)生CDI后,機(jī)體啟動(dòng)的固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答在疾病的發(fā)展及嚴(yán)重程度中至關(guān)重要[48, 49]。宿主對(duì)CDI的急性反應(yīng)是由毒素介導(dǎo)炎癥損傷及大量炎癥因子的釋放引起的。研究發(fā)現(xiàn),糞便或者血清中細(xì)胞因子或趨化因子的水平與艱難梭菌感染的嚴(yán)重程度有關(guān),從而可作為艱難梭菌感染時(shí)的輔助診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物[50, 51]。

3 CDI的治療

3.1 抗菌治療在臨床上可提供非達(dá)霉素和萬(wàn)古霉素的情況下,不再推薦甲硝唑作為CDI的一線治療藥物[52, 53]。非達(dá)霉素是治療首次發(fā)生CDI及復(fù)發(fā)的首選藥物。對(duì)于暴發(fā)性CDI通常采用大劑量口服萬(wàn)古霉素、靜脈注射甲硝唑、直腸萬(wàn)古霉素(對(duì)腸梗阻患者)和早期外科會(huì)診[53]。

3.2 抗毒素治療除常規(guī)使用抗生素外,貝洛托舒單抗(Bezlotoxumab)是治療CDI復(fù)發(fā)兩次及以上的首選藥物。Bezlotoxumab是全人源的單克隆抗體,靶向艱難梭菌的毒素B,可以阻斷毒素與宿主細(xì)胞結(jié)合的能力。對(duì)于復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高的患者,一次性靜脈注射Bezlotoxumab可作為復(fù)發(fā)預(yù)防策略[54]。研究顯示,刀豆素 A 、川楝素、腐敗菌素和抗瘧藥米帕林等藥物可抑制核內(nèi)體酸化;天然黃酮類化合物根皮素能非競(jìng)爭(zhēng)性直接抑制毒素 GTD 的活性;化合物依布硒可共價(jià)結(jié)合半胱氨酸殘基阻斷毒素B的自催化過(guò)程,以上多個(gè)小分子抑制劑可用于阻斷毒素作用,從而在不同程度抑制 TcdB 對(duì)細(xì)胞的毒害作用[55～57]。

3.3 糞便菌群移植(fecal microbiota transplanta-tion, FMT)與益生菌治療FMT是將健康人糞便中的微生物菌群移植到患者腸道內(nèi),為CDI患者恢復(fù)正常的腸道菌群。目前,FMT僅適用于反復(fù)感染艱難梭菌的患者。一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究顯示,FMT對(duì)治療復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染明顯比使用萬(wàn)古霉素更有效[58]。由于目前的檢測(cè)手段無(wú)法明確糞便的完整成分,FMT可能會(huì)帶來(lái)一些并發(fā)癥。益生菌可調(diào)節(jié)腸道菌群,抑制有害菌種在腸道內(nèi)過(guò)度繁殖。研究表明,益生菌在治療原發(fā)性CDI方面有良好的作用,但其使用劑量和種類及治療時(shí)間對(duì)CDI的治療效果有很大的影響,因此,目前不建議使用益生菌治療作為常規(guī)治療手段[4]。

3.4 光動(dòng)力治療(Photodynamic therapy,PDT)PDT是一種有前景的殺滅細(xì)菌的替代方法[59]?？刮⑸颬DT 方法基于PDT概念,涉及一種稱為光敏劑的光活性染料,該染料靶向微生物細(xì)胞,能夠在光照射下產(chǎn)生由單線態(tài)氧和/或自由基組成的活性氧,以根除細(xì)菌以及真菌、病毒和原生動(dòng)物[60]。

4 總結(jié)

目前,CDI的診斷和治療仍充滿了挑戰(zhàn)?？焖佟?zhǔn)確地診斷CDI對(duì)于指導(dǎo)臨床治療和預(yù)防醫(yī)院內(nèi)CD傳播至關(guān)重要。抗菌藥物治療是CDI的首選治療方式,但也是發(fā)生CDI的重要危險(xiǎn)因素,應(yīng)根據(jù)CDI患者臨床表現(xiàn),綜合多種治療手段。因此,深入研究特異度好和靈敏度高的分子診斷生物標(biāo)志物,開發(fā)針對(duì)CD的靶向治療,為臨床CDI治療提供新的策略仍然是目前亟待解決的科學(xué)問題。