張露新，孟璐，張虹*

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

2.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院），河南 洛陽(yáng) 471002

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨骼微結(jié)構(gòu)破壞、骨量和骨質(zhì)量下降為特點(diǎn)的全身代謝性骨病，多見(jiàn)于絕經(jīng)后女性和老年人，主要表現(xiàn)為骨強(qiáng)度下降、骨密度降低、骨脆性增加、在輕微外力作用下極易發(fā)生骨折[1]。我國(guó)骨質(zhì)疏松癥的患病率高，是老年患者致殘和致死的主要原因之一。目前臨床上用于骨質(zhì)疏松癥防治的藥物主要包括骨健康基本補(bǔ)充劑（鈣劑、維生素D）、骨形成促進(jìn)劑、骨吸收抑制劑等[2]。臨床上沒(méi)有根治骨質(zhì)疏松癥的藥物，并且常用的化學(xué)藥的治療存在療效不確切、依從性欠佳、不良反應(yīng)多、患者不耐受等問(wèn)題，因此篩選出更多安全有效的抗骨質(zhì)疏松癥藥物成為當(dāng)務(wù)之急。葛根素提取自豆科植物野葛、粉葛，是葛根中主要活性成分，也是葛根中特有的一種異黃酮類(lèi)化合物，且含量最高，《中國(guó)藥典》2020 年版一部規(guī)定干燥葛根中葛根素為98.0%～102.0%[3]。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間持續(xù)性的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治起到積極作用[4-5]。葛根素可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化、抑制骨吸收和破骨細(xì)胞的分化形成、促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化、發(fā)揮雌激素樣作用。因此本文綜述了葛根素防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制研究進(jìn)展，為深入開(kāi)展葛根素治療骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)研究和新藥開(kāi)發(fā)提供參考。

1 促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化

成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化是骨形成和重建的關(guān)鍵因素，來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在維持骨代謝平衡、促進(jìn)骨骼發(fā)育中發(fā)揮著重要的功能[6]。研究表明，葛根素通過(guò)增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)成骨增殖分化，是有效治療骨質(zhì)疏松癥的重要途徑之一[7]。馬茜等[8]進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，將100、10、1、0.1 μmol/L 葛根素用于MC3T3-E1 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)葛根素能夠通過(guò)激活p38、ERK1/2 信號(hào)通路不同程度地增強(qiáng)MC3T3-E1 細(xì)胞的增殖分化、細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）的活性和細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白分泌水平，尤其1 μmol/L 時(shí)作用48 h 效果最佳，這可能是葛根素防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制。Runx2 是骨骼發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它的表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的開(kāi)始。曾祥偉[9]研究表明葛根素可以下調(diào)靶向Runx2 的miR-204的表達(dá)水平，降低miR-204 宿主基因TRPM3 的mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)量，促進(jìn)Runx2 的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠MC3T3-E1 成骨細(xì)胞的增殖和分化。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)葛根素能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞內(nèi)、外鈣離子的濃度，當(dāng)葛根素短時(shí)間（2 h）作用于細(xì)胞，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化；當(dāng)葛根素作用時(shí)間延長(zhǎng)至48 h 時(shí)，趨勢(shì)被逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞外鈣離子濃度增加，提升與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的結(jié)合率，為MC3T3-E1 細(xì)胞礦化做準(zhǔn)備。楊一秋等[10]研究證實(shí)經(jīng)葛根素干預(yù)后的去卵巢小鼠骨小梁數(shù)量增加、連續(xù)性良好、骨髓腔擴(kuò)大，表明葛根素對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有良好的治療作用。在進(jìn)一步的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)張力蛋白同源物基因PTEN 的mRNA 和蛋白的表達(dá)水平上調(diào)。PTEN可對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用，而PI3K/Akt 信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的細(xì)胞信息傳導(dǎo)過(guò)程中扮演了重要角色，此通路可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而緩解骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展[11]。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種代謝過(guò)程，能夠去除受損和長(zhǎng)壽的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，適當(dāng)?shù)淖允稍诖龠M(jìn)成骨分化的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12]。參與自噬的主要介質(zhì)包括自噬效應(yīng)蛋白（Beclin-1）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3），當(dāng)激活自噬時(shí)，Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)水平上升。于冬冬等[13]發(fā)現(xiàn)葛根素在增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化的同時(shí)也可促進(jìn)自噬小體的生成，上調(diào)LC3-Ⅱ、Beclin-1 的表達(dá)。反之，在加入自噬抑制劑3-甲基嘌呤（3-MA），上述現(xiàn)象均被抑制，進(jìn)一步說(shuō)明了在葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖中，自噬發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。以上研究表明，葛根素能夠通過(guò)激活不同信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化、激活細(xì)胞自噬，發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松癥的作用。

2 抑制骨吸收和破骨細(xì)胞的分化形成

破骨細(xì)胞是具有蝕骨作用的多核巨細(xì)胞，直接參與并影響骨骼發(fā)育和重塑過(guò)程。既往研究發(fā)現(xiàn)，在骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的進(jìn)程中，破骨細(xì)胞過(guò)度活化或分化，致使骨吸收能力增強(qiáng)、骨量降低、骨結(jié)構(gòu)受損，最終骨組織代謝異常[14]。因此，抑制破骨細(xì)胞分化、骨吸收是骨質(zhì)疏松癥的治療策略之一。劉春麗等[15]通過(guò)對(duì)單核巨噬細(xì)胞RAW264.7向破骨細(xì)胞分化進(jìn)行體外誘導(dǎo)的方法來(lái)觀察10、25、50 μmol/L葛根素對(duì)破骨細(xì)胞形成能力、破骨細(xì)胞骨架、破骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響，分析葛根素在破骨細(xì)胞分化成熟中的作用。CCK8 檢測(cè)結(jié)果顯示葛根素安全給藥濃度為50 μmol/L 及以下，經(jīng)抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）和F-actin 染色發(fā)現(xiàn)，與破骨誘導(dǎo)組相比，各濃度葛根素組破骨細(xì)胞的形成能力顯著降低，且細(xì)胞F-actin 環(huán)變小，從而減弱骨吸收能力。同時(shí)采用RT-PCR 檢測(cè)和Western blotting 檢測(cè)進(jìn)行分析，葛根素可以抑制Notch 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量，證實(shí)了Notch 信號(hào)通路在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中起激動(dòng)作用，而葛根素抑制破骨細(xì)胞成熟分化就是通過(guò)阻斷Notch 信號(hào)通路的激活實(shí)現(xiàn)的。李蘭[16]通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討葛根素對(duì)破骨細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄水平的影響，分析該通路抑制骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可以有效延緩骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展進(jìn)程，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制可溶性卷曲蛋白2（sFRP2）的表達(dá)，從而升高骨組織內(nèi)Wnt4、β-catenin、TCF1、Cyclin D1、C-myc基因表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)小劑量葛根素可以通過(guò)促進(jìn)Wnt4 的表達(dá)來(lái)降低破骨細(xì)胞TRAP 的表達(dá)量，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的?；谏鲜鲅芯勘砻?，葛根素可調(diào)控破骨細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路，減弱其分化和骨吸收能力，這對(duì)臨床治療骨質(zhì)疏松癥、骨缺損相關(guān)疾病有重要的意義。

3 促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是從骨髓中分離出的非造血干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的能力，在一定條件的刺激和誘導(dǎo)下，可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等[17]。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，葛根素可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，并向成骨細(xì)胞分化，在平衡骨代謝和維持骨結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中發(fā)揮重要的作用[18-19]。宋明甲等[20]研究發(fā)現(xiàn)1 μmol/L 葛根素最能增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和鈣化能力，提高ALP 活性和骨鈣素含量，促進(jìn)成骨相關(guān)因子Runx-2、OSX、BMP-2、Collagen-I mRNA的表達(dá)水平。此外該研究使用NO 合成酶抑制劑（LNMA）預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)一步證明了葛根素促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化是通過(guò)激活NO 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。安晉陽(yáng)等[21]體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)葛根素通過(guò)核因子E2 相關(guān)因子2（NRF2）信號(hào)通路可顯著升高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核內(nèi)NRF2 及其下游HO1、NQO1 的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)葛根素組中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 降低，抗氧化劑GSH 升高，證實(shí)葛根素可以減輕骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的氧化損傷和凋亡數(shù)量，提高其存活率，有效改善因氧化損傷所致的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力下降。含PR 結(jié)構(gòu)域的蛋白（PRDM16）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）可調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，在正常的生理狀態(tài)下，多分化為成骨細(xì)胞。當(dāng)骨骼內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)量高于一般水平時(shí)，其通過(guò)釋放異常細(xì)胞因子對(duì)骨代謝產(chǎn)生一定影響，加快骨量流失，降低骨密度，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，因此抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，可有效減少骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞的堆積，進(jìn)而促進(jìn)骨形成[22]。齊振熙等[23]研究了葛根素抑制激素誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)葛根素是通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt 信號(hào)途徑相關(guān)基因和關(guān)鍵蛋白β-catenin 表達(dá)的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)的，與激素誘導(dǎo)組相比，葛根素組顯著上調(diào)Wnt10bmRNA、β-cateninmRNA 和β-catenin 蛋白的表達(dá)水平，降低了GSK3βmRNA 的表達(dá)水平。已有學(xué)者實(shí)驗(yàn)證明激活Wnt 信號(hào)途徑既可以抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化，又可以促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化[24-25]。因此葛根素可能通過(guò)不同信號(hào)通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，并對(duì)其氧化損傷起到保護(hù)作用，達(dá)到了治療骨質(zhì)疏松癥的目的。

4 發(fā)揮雌激素樣作用

雌激素水平降低是引發(fā)骨質(zhì)疏松癥的原因之一，雌激素缺乏會(huì)導(dǎo)致對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用減弱，減少破骨細(xì)胞凋亡，并增加其數(shù)量[26-27]。雌激素抑制骨吸收主要是與破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞上的雌激素受體結(jié)合，從而提升成骨細(xì)胞活力，降低破骨細(xì)胞的重吸收，減少鈣質(zhì)沉著。葛根素作為一種植物雌激素，可以刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性，改善骨代謝，有效防治骨量流失[28]。趙艷威等[29]研究證明葛根素可以發(fā)揮雌激素樣作用，提高人成骨樣MG-63 細(xì)胞中ALP 活性和I 型膠原蛋白的分泌，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟分化，除此之外，該研究應(yīng)用雌激素受體（ER）阻斷劑ICI 182、780 和小RNA 干擾技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)葛根素發(fā)揮該調(diào)節(jié)作用是通過(guò)ER 途徑，由ERα 和ERβ 共同介導(dǎo)的。呂海宏等[30]探討了葛根素和ERα甲基化之間的關(guān)系以及對(duì)大鼠成骨細(xì)胞代謝調(diào)控的具體機(jī)制，經(jīng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察，隨著葛根素濃度不斷升高，成骨細(xì)胞ERα 基因啟動(dòng)子A 區(qū)甲基化的程度則隨之減弱，細(xì)胞ERαmRNA 表達(dá)顯著增加，同時(shí)成骨細(xì)胞ALP 活性與成骨細(xì)胞分化促進(jìn)率也明顯提高，葛根素的適宜濃度為25 μmol/L。

5 結(jié)語(yǔ)

葛根素具有一定的抗骨質(zhì)疏松癥活性，這與其能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化、抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性、誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化、發(fā)揮雌激素樣作用有關(guān)，體現(xiàn)了中藥活性成分可以通過(guò)多途徑、作用于多個(gè)靶點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)骨代謝以對(duì)抗骨質(zhì)疏松癥[31-32]。同時(shí)葛根素可以與各種復(fù)合材料支架聯(lián)用，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得顯著的成果，不但為治療骨質(zhì)疏松、骨缺損相關(guān)疾病提供了科學(xué)依據(jù)，并且拓寬了葛根素的藥用價(jià)值和臨床適用范圍。目前關(guān)于葛根素抗骨質(zhì)疏松癥的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已有較多報(bào)道，但是臨床應(yīng)用才是研究葛根素防治骨質(zhì)疏松癥的最終目的，建議臨床上加強(qiáng)相互之間的協(xié)作，增加大樣本、多中心的臨床對(duì)照研究，有助于該藥深入的開(kāi)發(fā)、利用[33]。葛根素已經(jīng)在骨質(zhì)疏松癥防治領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的潛力和研究?jī)r(jià)值，隨著中藥材分子生物學(xué)、藥理學(xué)、人工智能技術(shù)的不斷發(fā)展，該藥能夠更加安全、高效的用于臨床。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突