解亦航，郭宇微，孫渤軒，辛楊，于嘉敏，趙春艷

大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床生化檢驗(yàn)教研室，遼寧 大連 116044

抑癌基因p53具有調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和維持基因組穩(wěn)定性等多種重要功能，在保持遺傳完整性及避免生物細(xì)胞癌變等方面具有重要作用［1-3］。50%以上腫瘤細(xì)胞中存在p53的缺失、突變或功能失活［4-5］。正常細(xì)胞在缺氧、射線、癌基因激活等壓力下會(huì)激活p53途徑，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡或基因修復(fù)，而癌細(xì)胞（即使存在野生型p53）幾乎均缺乏激活p53途徑的能力［6］。因此，盡管癌細(xì)胞暴露于各種形式的致癌應(yīng)激環(huán)境中（如致癌基因激活、細(xì)胞缺氧和正常環(huán)境喪失），仍可繼續(xù)增殖和存活［7］。有研究表明，p53蛋白使細(xì)胞在壓力條件下通過(guò)凋亡避免細(xì)胞癌變［1，7］，激活宮頸癌細(xì)胞中休眠的p53可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［8-9］。因此，抑制野生型p53降解、恢復(fù)突變體p53結(jié)構(gòu)、促進(jìn)p53重新激活是癌癥治療藥物重要的研發(fā)方向?；罨模ǜ盍训模┌腚装彼崽於彼崽禺愋缘鞍酌?3（cleavedcysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved-caspase-3）是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子，其蛋白水平可反映細(xì)胞的凋亡情況［10-11］。在正常細(xì)胞中，主要通過(guò)鼠雙微體2（murine double minute 2，Mdm2）介導(dǎo)的泛素化降解途徑進(jìn)行p53蛋白的調(diào)控［12-13］。

高危人乳頭瘤病毒（high risk human papilloma virus，HR-HPV）入侵機(jī)體細(xì)胞后，病毒自身編碼的E6蛋白通過(guò)與E6相關(guān)蛋白（E6-associated protein，E6AP）結(jié)合介導(dǎo)p53泛素化降解，從而逃避由p53觸發(fā)的細(xì)胞凋亡［14-15］。但在非HPV 感染的宮頸癌細(xì)胞（C33A）中，E6AP對(duì)p53蛋白的調(diào)控作用尚未明確［16］。因此，本研究通過(guò)siRNA 技術(shù)沉默E6AP 表達(dá)，探討沉默E6AP 對(duì)C33A 細(xì)胞中p53 蛋白水平的影響，以期為后續(xù)宮頸癌治療藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 C33A細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清（11011-8611）購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；青-鏈霉素（SV30010）和MEM 培養(yǎng)基（SH30024.01）均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（11668-019）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RIPA（弱）裂解液（P0013D）及ECL 均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗p53 單克隆抗體（60283-2-lg）及兔抗E6AP 多克隆抗體（10344-1-AP）均購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；兔抗cleaved-caspase-3 多克隆抗體（WL02117）購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物技術(shù)有限公司；兔抗GAPDH 多克隆抗體（AP0063）購(gòu)自南京巴傲得（Bioworld）生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（ZB-2301）及山羊抗鼠IgG（ZB-2305）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PVDF膜（IPFL00010）購(gòu)自德國(guó)Merck Millipore公司。

1.3 E6AP的siRNA 沉默 參考文獻(xiàn)［8-9］方法，設(shè)計(jì)特異性沉默E6AP的siRNA序列（siE6AP：5′-CAACUCCUGCUCUGAGAUATT-3′）及沉默對(duì)照無(wú)序siRNA序列（siControl：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′），序列均由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將C33A 細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的MEM 培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C33A 細(xì)胞，接種至24 孔板，1.5 × 105個(gè)／孔，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)18 h；在LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下將 siE6AP 及 siControl 序列分別轉(zhuǎn)染 C33A 細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)6 h；更換含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基（不含抗生素）。轉(zhuǎn)染48 h 后，用4 ℃預(yù)冷的PBS 洗滌1次，RIPA（弱）裂解液冰上裂解細(xì)胞20 min；于 4 ℃，2 000×g離心10 min，取上清，BCA法蛋白定量。

1.6 沉默E6AP對(duì)C33A細(xì)胞中E6AP、p53和cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)水平影響的檢測(cè) 采用Western blot法。取siE6AP及siControl組C33A 細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)10%及15%SDS-PAGE（前者用于檢測(cè)E6AP、p53 和GAPDH，后者用于檢測(cè)cleaved-caspase-3）分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；加入兔抗E6AP多克隆抗體（1∶5 000稀釋）、鼠抗p53 單克隆抗體（1∶5 000稀釋）、兔抗caspase-3／cleaved-caspase-3 多克隆抗體（1∶500 稀釋）及兔抗GAPDH 多克隆抗體（1∶20 000稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 及山羊抗鼠IgG（均1∶5 000 稀釋），室溫作用1 h；TBST 洗滌3次，每次10 min，ECL法顯色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA 沉默 E6AP 的效果 siControl 和 siE6AP組C33A 細(xì)胞中E6AP 蛋白表達(dá)量分別為（0.506 4 ±0.185 99）和1，前者明顯低于后者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.597，P＜ 0.05），見(jiàn)圖1。表明siE6AP 可沉默C33A細(xì)胞中E6AP的表達(dá)。

圖1 Western blot 法檢測(cè)siE6AP對(duì)C33A細(xì)胞中E6AP的沉默作用Fig.1 Western blotting of silencing effect of siE6AP on E6AP in C33A cells

2.2 沉默E6AP對(duì)C33A 細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)水平的影響 siE6AP 和 siControl 組 C33A 細(xì)胞中 p53 蛋白表達(dá)水平分別為（1.572 5±0.218 77）和1，前者明顯高于后者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.533，P＜ 0.05），見(jiàn)圖2。表明在C33A 細(xì)胞中沉默E6AP 可顯著提高p53蛋白水平。

圖2 Western blot 法檢測(cè)沉默E6AP 對(duì)C33A 細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Western blotting of effect of silencing E6AP on expression of p53 protein in C33A cells

2.3 沉默E6AP 對(duì)C33A 細(xì)胞中凋亡關(guān)鍵效應(yīng)分子cleaved-caspase-3表達(dá)水平的影響 siE6AP和siControl組C33A 細(xì)胞中cleaved-caspase-3 的蛋白水平分別為（1.817 8±0.199 55）和1，前者明顯高于后者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.099，P＜ 0.05），見(jiàn)圖3。表明在C33A 細(xì)胞中沉默E6AP 可顯著提高cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平。

圖3 Western blot法檢測(cè)沉默E6AP對(duì)C33A細(xì)胞中cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Western blotting of effect of silencing E6AP on expression of cleaved-caspase-3 protein in C33A cells

3 討論

泛素化蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑之一，該途徑主要由泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2 及泛素蛋白連接酶E3 完成，其中E3 決定了靶蛋白的特異性［16］。目前已知的 E3 酶多達(dá) 600 多種，Mdm2 和 E6AP 是兩種重要的 E3 酶［16］。Mdm2 是生理情況下介導(dǎo)p53 降解的主要E3 酶，Mdm2 通過(guò)與p53 蛋白結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄功能，并通過(guò)泛素化蛋白酶體途徑介導(dǎo)其降解［17］。同時(shí)，p53 又可正調(diào)節(jié)Mdm2表達(dá)，從而形成自動(dòng)反饋調(diào)節(jié)回路［18-19］。E6AP蛋白廣泛存在于幾乎所有細(xì)胞中，參與多種抑癌基因蛋白的泛素化降解，如早幼粒細(xì)胞白血病蛋白（promyelocytic leukemia protein，PML）及簇集蛋白（stress-induced chaperone clusterin，CLU）、p27Kip1等，與宮頸癌、白血病、非小細(xì)胞性肺癌、前列腺癌及乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16，20-21］。HR-HPV感染的宮頸癌細(xì)胞中，在E6 蛋白參與下，E6AP 可介導(dǎo)p53 泛素化降解，使p53 降解由自動(dòng)反饋調(diào)節(jié)Mdm2 途徑轉(zhuǎn)換為 E6 調(diào)控的 E6AP 途徑［14-15］，導(dǎo)致p53調(diào)控失控。有研究發(fā)現(xiàn)，在缺乏E6的情況下，E6AP可單獨(dú)通過(guò)泛素化途徑降解p53［15］。目前，對(duì)E6AP誘導(dǎo)p53 降解的研究多集中于HPV 感染的宮頸癌細(xì)胞或含有野生型p53的HPV 陰性宮頸癌細(xì)胞中（如RKO 和 MCF7）［15，22］，對(duì)突變型p53在 HPV 陰性宮頸癌細(xì)胞研究較少。p53突變是HPV 陰性宮頸癌細(xì)胞中p53失活的主要原因［23］，因此，本研究選擇HPV陰性的宮頸癌細(xì)胞系C33A（其含有Arg273Cys 突變型p53）進(jìn)行研究。結(jié)果表明，沉默E6AP C33A 細(xì)胞中的p53 表達(dá)水平顯著提高（P＜ 0.05），表明E6AP 介導(dǎo)的突變型p53泛素化降解可能存在不依賴E6的途徑或其他間接途徑，具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

caspase-3為caspase 家族成員之一，是參與凋亡途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子。正常狀況下，胞質(zhì)中的caspase-3以無(wú)活性Pro-caspase-3形式存在。p53可促使凋亡蛋白釋放至細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)凋亡小體進(jìn)行組裝，切割Pro-caspase-3，形成具有活性的cleaved-caspase-3，快速啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序［24］。本研究結(jié)果表明，沉默E6AP 提高p53 表達(dá)水平的同時(shí)，可顯著提高細(xì)胞中凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子cleaved-caspase-3 的含量（P＜0.05）。提示在C33A細(xì)胞中，可通過(guò)沉默E6AP恢復(fù)p53活性，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

恢復(fù)p53 活性是抗腫瘤治療的重要策略之一。在HPV 陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞中，p53 失活主要是由E6AP介導(dǎo)的泛素蛋白酶體途徑降解所致；而在HPV 陰性宮頸癌細(xì)胞中，p53失活多是由p53的突變所引起［23］。因此，對(duì)于野生型p53，可通過(guò)抑制蛋白酶體活性以降低p53 的泛素化降解，從而恢復(fù)p53 活性；對(duì)于突變體p53，治療策略可分為3類：恢復(fù)突變p53的野生型構(gòu)象和轉(zhuǎn)錄活性、靶向突變p53的降解、誘導(dǎo)合成殺傷力［25-26］。目前，針對(duì)恢復(fù)p53活性的藥物研發(fā)多集中于破壞 p53-Mdm2 相互作用方面［1］，而 C33A 細(xì)胞中p53的突變?yōu)闊狳c(diǎn)突變Arg273Cys，該突變使其失去與DNA 結(jié)合的能力，從而喪失其抑癌基因活性并獲得致癌活性［25-26］。本研究發(fā)現(xiàn)，在HPV 陰性宮頸癌細(xì)胞中，突變型p53有可能通過(guò)E6AP 途徑降解，這為靶向調(diào)控突變p53的降解提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為癌癥治療藥物的設(shè)計(jì)和研發(fā)提供了新靶點(diǎn)。