張輝，毛群穎 綜述，梁爭(zhēng)論，徐苗 審校

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）嚴(yán)重威脅人類健康和公共衛(wèi)生安全。截至 2022 年 6 月，SARS-CoV-2 感染已造成全球超過(guò)600 萬(wàn)人死亡［1］。接種疫苗對(duì)有效控制疫情具有重要作用，全球已有150 多個(gè)SARS-CoV-2 疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，38 個(gè)獲批緊急使用或上市，我國(guó)有34個(gè)疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，5 個(gè)獲批附條件上市［2］。目前全球已接種SARS-CoV-2 疫苗118.5 億劑次，我國(guó)33.9億劑次［1，3］。隨著SARS-CoV-2值得關(guān)注變異株（variants of concern，VOC）不斷出現(xiàn)，其傳染性和免疫逃逸功能增強(qiáng)，導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗有效性均有不同程度下降，需研發(fā)新一代更有效的變異株疫苗或廣譜疫苗［4-5］。

中和抗體水平是評(píng)價(jià)疫苗免疫原性的主要指標(biāo)，但至今尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化的SARS-CoV-2 中和抗體檢測(cè)方法，不同實(shí)驗(yàn)室和不同產(chǎn)品之間的中和抗體水平難以進(jìn)行橫向比較，嚴(yán)重制約疫苗和抗體類治療藥物的研發(fā)和評(píng)價(jià)。因此，2020年9和12月，我國(guó)及世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）先后建立了第一代SARS-CoV-2 抗體中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品和WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（international standard，IS），為SARSCoV-2 疫苗研發(fā)和評(píng)價(jià)提供了關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［6-8］。但隨著兩個(gè)第一代標(biāo)準(zhǔn)品售罄及VOC 的不斷出現(xiàn)，2022年，WHO 與我國(guó)又同步開展了第二代標(biāo)準(zhǔn)品的研制工作。本文就WHO 和我國(guó)SARS-CoV-2 抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制及應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 指南文件

1.1 定義及分類 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一種確定了具有一個(gè)或多個(gè)足夠均勻特性值的物質(zhì)或材料［9］。作為分析測(cè)量行業(yè)中的“量具”，在校準(zhǔn)測(cè)量?jī)x器和裝置、評(píng)價(jià)測(cè)量分析方法、測(cè)量物質(zhì)或材料特性值、考核分析人員的操作技術(shù)水平及在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)品的質(zhì)量控制等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有特性量值的準(zhǔn)確性、均勻性、穩(wěn)定性和傳遞性的實(shí)物形式計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)。生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可分為一級(jí)（IS）、二級(jí)和三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［10-11］。其中，一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是由WHO 生物標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會(huì)指定國(guó)際單位（international unit，IU）的最高級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)品，用于次級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品的量值溯源；二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為全球區(qū)域性或國(guó)家級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于標(biāo)定三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和分析檢測(cè)；三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和儀器定標(biāo)等。WHO 建議應(yīng)建立二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，用于大量的SARS-CoV-2 抗體檢測(cè)或三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)定，以保證限量的WHO 標(biāo)準(zhǔn)品用于維持量值溯源的穩(wěn)定性和持續(xù)性。

1.2 WHO 指南 為規(guī)范生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制和分發(fā)，WHO 制訂了《WHO 國(guó)際和其他生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備、特性描述和建立的建議》《國(guó)家和其他二級(jí)疫苗標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立手冊(cè)》和《用于傳染病核酸或抗原檢測(cè)的體外診斷實(shí)驗(yàn)二級(jí)參考物質(zhì)的制備手冊(cè)：與 WHO 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)》［10，12-13］。由于 SARS-CoV-2 疫苗及抗體類治療制品研發(fā)和應(yīng)用的大量需求，2022年又頒布了《WHO 抗體檢測(cè)用二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品制備手冊(cè)》和《WHO 新冠病毒抗體二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品制備手冊(cè)》，指導(dǎo)全球抗體類二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品的研制和應(yīng)用［11，14］。

1.3 研制基本要求 《WHO 抗體檢測(cè)用二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品制備手冊(cè)》和《WHO 新冠病毒抗體二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品制備手冊(cè)》中均明確提出，抗體類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一類用于檢測(cè)抗體樣本生物活性（如由抗體亞群所致的中和能力或結(jié)合能力）的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［11，14］。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的關(guān)鍵屬性包括可追溯性、不確定度（measurement uncertainty，MU）、賦值方法、穩(wěn)定性、可交換性和生物負(fù)荷（無(wú)菌）等。一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品通常采用國(guó)際認(rèn)可的指定值表示，因此，僅二級(jí)、三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定值具有可追溯性和MU?？山粨Q性是指標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是否適合于所檢測(cè)的樣品類型，應(yīng)在協(xié)作標(biāo)定時(shí)加入不同類型的樣品進(jìn)行評(píng)估?；跇?biāo)準(zhǔn)品原材料的同質(zhì)性、安全性的要求及對(duì)突變株的考慮，對(duì)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的制備、協(xié)作標(biāo)定、結(jié)果統(tǒng)計(jì)和賦值也提出了具體要求。WHO 提出應(yīng)依據(jù)領(lǐng)域內(nèi)有經(jīng)驗(yàn)的機(jī)構(gòu)（如WHO 協(xié)作中心）的建議組織協(xié)作標(biāo)定，并需獲得領(lǐng)域內(nèi)專家和統(tǒng)計(jì)學(xué)專家支持。應(yīng)盡量由多個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加，參加實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。檢測(cè)方法可采用不同檢測(cè)方法進(jìn)行協(xié)標(biāo)外，還應(yīng)盡可能提供一個(gè)統(tǒng)一的方法和標(biāo)準(zhǔn)操作程序（standard operation procedure，SOP），全部方法均應(yīng)經(jīng)驗(yàn)證，并預(yù)設(shè)實(shí)驗(yàn)成立的接受標(biāo)準(zhǔn)。

標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定的統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)盡量采用平行線法或曲線法，WHO、《歐洲藥典》（10. 0 版）和《美國(guó)藥典》（USP35-NF30）對(duì)此均有專項(xiàng)描述［15-17］，應(yīng)使用適宜的統(tǒng)計(jì)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并對(duì)每次獨(dú)立檢測(cè)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)模型有效性檢驗(yàn)。在二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品與IS 賦值時(shí)，應(yīng)首先評(píng)估兩者對(duì)數(shù)劑量-關(guān)系的線性和平行性，證明兩者具有相近的生物學(xué)特性。同時(shí)還提出二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定值應(yīng)包括MU，可用95%可信限表示，MU應(yīng)具有方法特異性等要求。

2 WHO對(duì)SARS-CoV-2抗體標(biāo)準(zhǔn)品的研制

2.1 第一代SARS-CoV-2抗體WHO IS的建立 SARSCoV-2 疫苗和抗體治療藥物的研發(fā)急需建立可靠的分析方法進(jìn)行抗體檢測(cè)和評(píng)估。IS 的建立可有效促進(jìn)SARS-CoV-2 抗體檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化，提高各實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的可比性和一致性，對(duì)確定疫苗和治療藥物所需的有效抗體水平開展流行病學(xué)調(diào)查及效果評(píng)價(jià)等具有重要意義。因此，WHO及時(shí)啟動(dòng)了SARSCoV-2抗體IS研究［7-8］。研究選取11位COVID-19患者恢復(fù)期血清制備候選標(biāo)準(zhǔn)品（NIBSC code：20／136），由高效價(jià)捐獻(xiàn)血漿制備候選參考品（NIBSC code：20／130）。來(lái)自15 個(gè)國(guó)家的51 個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加了本次協(xié)標(biāo)研究，共采用ELISA（總抗體、IgG、IgA 和IgM）、活病毒中和、假病毒中和、流式細(xì)胞術(shù)、免疫層析、抑制試驗(yàn)和雙抗原結(jié)合等共125 個(gè)檢測(cè)方法進(jìn)行了協(xié)作標(biāo)定。協(xié)作標(biāo)定樣品包括候選標(biāo)準(zhǔn)品1 份，高、中、低效價(jià)、低S／高N（S 蛋白低應(yīng)答／N 蛋白高應(yīng)答）和陰性候選參考品各1 份、4 份臨床樣本（即高、低滴度COVID-19 患者恢復(fù)期血漿和血清各2 份），共計(jì)10 份不同類型樣品用以評(píng)估20／136 作為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的適用性。協(xié)作標(biāo)定結(jié)果顯示，20／136是抗體效價(jià)最高的樣品之一；采用20／136 為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算樣品的相對(duì)效價(jià)，對(duì)于多數(shù)陽(yáng)性樣品可有效降低各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)合抗體與中和抗體檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)差異，收窄實(shí)驗(yàn)室間的四分位數(shù)范圍，提高檢測(cè)幾何均值／中位數(shù)＜2 的實(shí)驗(yàn)室比例；但對(duì)于2 份低效價(jià)樣品，相對(duì)效價(jià)未顯著改變各實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)差異，這可能是由于低效價(jià)樣品接近于各種方法的檢測(cè)閾值，實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)差異較小所致。對(duì)于中和抗體檢測(cè)，在ELISA 法中，20／136 降低實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)差異的作用更明顯。由于不同ELISA 法中采用的單位不同，實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果差異可達(dá)10 000 倍，當(dāng)采用統(tǒng)一單位時(shí)，可顯著提高各實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的可比性。對(duì)于全部檢測(cè)方法，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)5 份參考品的檢測(cè)結(jié)果均得到相同的高、中、低排序，表明該候選參考盤適用于所有檢測(cè)方法。

將候選標(biāo)準(zhǔn)品賦值1 000 國(guó)際單位（IU）／mL 計(jì)算樣品的IU 值，結(jié)果表明，低效價(jià)樣品的結(jié)合抗體和中和抗體的IU 幾何均值相近，但高效價(jià)樣品結(jié)合抗體的IU 幾何平均值是中和抗體的2倍?？赡苁怯捎谂c其他樣本比較，20／136結(jié)合抗體含量高于中和抗體含量所致，表明雖然候選標(biāo)準(zhǔn)品適用于中和抗體和ELISA 結(jié)合抗體檢測(cè)，但中和活性與結(jié)合活性存在一定區(qū)別。在二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品溯源時(shí)，應(yīng)對(duì)不同檢測(cè)方法分別進(jìn)行溯源賦值。

2020 年 12 月，經(jīng)第 73 屆 WHO 生物標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會(huì)（The Expert Committee on Biological Standardization，ECBS）會(huì)議討論，批準(zhǔn) 20／136 為第一代SARS-CoV-2 抗體國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（250 IU／安瓿），批準(zhǔn)20／150（高效價(jià)）、20／148（中效價(jià)）、20／144（低S，高N）、20／140（低效價(jià)）和20／142（陰性）為第一代SARS-CoV-2抗體國(guó)際參考盤，不賦予國(guó)際單位。

2.2 第一代SARS-CoV-2 突變株抗體國(guó)際參考盤的建立 第一代SARS-CoV-2 抗體IS 和參考盤的建立對(duì)統(tǒng)一和協(xié)調(diào)全球范圍內(nèi)疫苗和治療產(chǎn)品的相關(guān)抗體檢測(cè)發(fā)揮了重要作用。自2020 年底，更具傳染性的SARS-CoV-2 VOC不斷出現(xiàn)，對(duì)現(xiàn)有疫苗和抗體類藥物的有效性提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。為促進(jìn)針對(duì)不同VOC 抗體檢測(cè)方法的發(fā)展，支持疫苗和藥物的持續(xù)開發(fā)，WHO計(jì)劃建立含有不同VOC的國(guó)際抗體參考盤［18］。經(jīng)第 74 屆 ECBS 討論確定開展新一代 SARSCoV-2 突變株抗體國(guó)際參考盤的研制項(xiàng)目。該項(xiàng)目采取WHO、流行病預(yù)防創(chuàng)新聯(lián)盟和英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所（The National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）合作的形式開展，以建立包含5個(gè)VOC抗體參考品為目標(biāo)，將主要用于活病毒中和抗體檢測(cè)，而不再應(yīng)用于以結(jié)合抗體類檢測(cè)為主的診斷試劑。目前該項(xiàng)目已獲得了3 個(gè)不同VOC（原型株、Alpha 和Delta 株）的恢復(fù)期血漿或血清原材料，其他兩個(gè)VOC 的恢復(fù)期血漿或血清尚在收集中，一旦新VOC出現(xiàn)，該參考盤將進(jìn)行靈活調(diào)整。

2.3 第二代SARS-CoV-2 抗體WHO IS 的建立 由于第一代SARS-CoV-2 抗體IS 的需求較大，至2021年8 月庫(kù)存已告罄，急需建立第二代WHO IS。因此在 2021 年 10 月 的 第 74 屆 ECBS 會(huì) 議 上 ，討 論 并通過(guò)了第二代WHO IS 的研制申請(qǐng)（WHO／BS／2021.2411）［19］。經(jīng)討論確定，基于當(dāng)前 SARS-CoV-2疫苗免疫的抗體效價(jià)較高，且VOC不斷出現(xiàn)，第二代WHO IS的原材料選擇首先應(yīng)采用更高滴度的SARSCoV-2疫苗免疫或恢復(fù)期血清及血漿進(jìn)行研制，理想情況是第二代IS 對(duì)現(xiàn)有的VOC 均呈現(xiàn)高滴度；其次，考慮到原材料變化可能帶來(lái)的影響，原材料應(yīng)盡可能與第一代WHO IS相似，并使用相同的中和抗體測(cè)量系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估；制備量至少應(yīng)達(dá)5 000 安瓿以上，以滿足SARS-CoV-2疫苗、治療藥物和流調(diào)需求。

在第一代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在結(jié)合抗體類檢測(cè)方法的不恰當(dāng)應(yīng)用，可能會(huì)導(dǎo)致國(guó)際單位的混亂和誤解。因此，第二代IS 明確為基于中和抗體的IU，而對(duì)于針對(duì)不同抗原的結(jié)合抗體檢測(cè)，將被指定一個(gè)新結(jié)合抗體單位（BAU），以確保該國(guó)際單位的性質(zhì)和定量準(zhǔn)確；同樣，對(duì)于可能出現(xiàn)的VOC，將根據(jù)協(xié)作標(biāo)定結(jié)果為每個(gè)VOC 計(jì)算并指定數(shù)值。

3 中國(guó)國(guó)家SARS-CoV-2抗體標(biāo)準(zhǔn)品的研制

3.1 第一代國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的建立 我國(guó)是開展SARSCoV-2 疫苗研發(fā)最早的國(guó)家之一，具有研發(fā)類型多、企業(yè)多、臨床試驗(yàn)多等特點(diǎn)。為滿足我國(guó)SARS-CoV-2疫苗免疫原性評(píng)價(jià)的需求，在第一代IS建立之前，我國(guó)于2020 年9 月建立了第一代國(guó)家SARS-CoV-2 中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品［6］。該標(biāo)準(zhǔn)品采用我國(guó)COVID-19 患者恢復(fù)期血漿制成，由包括國(guó)家質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)的11 個(gè)實(shí)驗(yàn)室開展了協(xié)作標(biāo)定研究，研究采用活病毒和假病毒檢測(cè)方法對(duì)包括國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品在內(nèi)的5 份樣品進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定檢測(cè)，結(jié)果顯示，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算相對(duì)效力可有效降低各實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)差異，提升不同實(shí)驗(yàn)室和不同疫苗之間中和抗體檢測(cè)準(zhǔn)確性和可比性。2020年9月，該標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)了我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物制品標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)的批準(zhǔn)，成為我國(guó)第一代SARS-CoV-2中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品，賦值1 000 U／mL，用于SARS-CoV-2 假病毒中和抗體檢測(cè)。由于該標(biāo)準(zhǔn)品的建立早于第一代IS，未能將其溯源至國(guó)際單位（IU）。同期，我國(guó)還另建立了國(guó)家SARS-CoV-2血清參考盤（SARS-CoV-2 IgM 和IgG 抗體檢測(cè)試劑國(guó)家參考品：370096、370097），用于結(jié)合抗體類診斷試劑的質(zhì)量控制［20］。

3.2 第二代國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的研制 與WHO IS 相同，我國(guó)第一代國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品也得到了廣泛關(guān)注，需求量較大，于2021 年迅速售罄。為確保我國(guó)疫苗、治療藥物的研發(fā)，并與WHO IS 進(jìn)行量值溯源，我國(guó)于2021年底采用COVID-19 患者恢復(fù)期血漿和免疫球蛋白分別制備了2個(gè)候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，聯(lián)合國(guó)內(nèi)9家主要臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，目前已完成協(xié)作標(biāo)定和穩(wěn)定性研究。

4 小結(jié)及展望

WHO 和我國(guó)第一代SARS-CoV-2 抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)支撐全球范圍SARS-CoV-2 疫苗和抗體類藥物研發(fā)，對(duì)抑制疫情蔓延均發(fā)揮了重要作用，但具有高傳染性和免疫逃逸能力的SARS-CoV-2 VOC流行，對(duì)全球范圍疫情的控制造成了巨大挑戰(zhàn)。為滿足新一代疫苗、治療藥物研發(fā)的需求，WHO 正在積極收集不同VOC 感染者的血清樣本，以研究建立靈活組合的第二代標(biāo)準(zhǔn)參考血清盤。我國(guó)SARS-CoV-2 疫苗和治療性抗體藥物研發(fā)企業(yè)多，研究建立標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)滿足疫苗和藥物研發(fā)需求具有重要意義，需在進(jìn)一步收集篩選不同VOC感染者血清樣本的基礎(chǔ)上加強(qiáng)國(guó)際合作，加快我國(guó)新一代SARS-CoV-2抗體標(biāo)準(zhǔn)品的研制進(jìn)程。