馬源 綜述，宋磊，羅招慶 審校

吉林大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科與感染與免疫中心，吉林 長(zhǎng)春 130021

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種革蘭陰性菌，是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一［1-2］，主要感染肺等多種人體器官［3］，最終引起菌血癥、肺炎等疾病，嚴(yán)重威脅患者生命，免疫力較弱的人群，尤其患有嚴(yán)重呼吸道疾病需氣管插管及腫瘤化療的患者，更易感染該菌［4］。目前，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗生素已產(chǎn)生廣泛耐受性，普通抗生素難以清除臨床流行的菌株，迄今為止，全球僅有南極洲未分離出多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌。在已分離獲得的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株中，碳?xì)涿瓜╊愃幬锬褪芫晡涣惺澜缧l(wèi)生組織“新型抗生素研發(fā)重點(diǎn)病原體清單”的首位［5］，疫苗接種是預(yù)防該菌感染的主要措施。本文就鮑曼不動(dòng)桿菌的致病機(jī)制和相應(yīng)疫苗的研究現(xiàn)狀作一綜述，以期為該菌及新型疫苗的研究提供參考。

1 鮑曼不動(dòng)桿菌的致病機(jī)制

鮑曼不動(dòng)桿菌的致病過(guò)程主要包括菌體與宿主細(xì)胞黏附、生物膜的形成及菌體定殖。與許多病原體相似，鮑曼不動(dòng)桿菌能產(chǎn)生大量包圍外膜的莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）［6］，并形成黏液，對(duì)該菌的黏附起關(guān)鍵作用。有研究在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)，雙組分離調(diào)節(jié)系統(tǒng)BfmRS 可影響CPS 的形成［7-9］，還可控制 CPS 產(chǎn)生基因的 K 位點(diǎn)及菌毛產(chǎn)生csuA／BABCDE 操縱子的表達(dá)［10］。BfmRS 突變體（ΔbfmR）可過(guò)量產(chǎn)生CPS，具有更強(qiáng)毒性［11］。CPS 輸出蛋白（Wza）與耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動(dòng)桿菌的毒力及莢膜的形成密切相關(guān)。研究表明，wza基因敲除可影響莢膜聚合酶Wzy 依賴的CPS 合成途徑，導(dǎo)致CPS 的組裝、輸出和胞外固定受阻，從而產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，降低該菌的毒性［12-13］。

生物膜是微生物細(xì)胞在多種生理環(huán)境因素影響下黏附于生物或非生物表面形成的三維結(jié)構(gòu)［14］，其形成導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性、致病性升高，慢性感染、反復(fù)感染率增加［15］。臨床上65%～80%的細(xì)菌感染性疾病與生物膜形成有關(guān)，但形成生物膜的細(xì)菌對(duì)抗菌藥物耐藥性通常是游離菌的10～1 000倍，這也是抗菌藥物治療細(xì)菌感染失效的主要原因［16］。生物膜的形成和發(fā)展包括4 個(gè)主要步驟：細(xì)菌可逆性黏附定殖、細(xì)菌不可逆性黏附集聚、生物膜成熟及細(xì)菌的脫落與再定殖。當(dāng)浮游細(xì)菌與惰性物體表面或活性實(shí)體的表面接觸后，會(huì)黏附至物體表面，啟動(dòng)形成生物膜過(guò)程，在該階段，單個(gè)附著細(xì)胞僅由少量胞外聚合物包裹，未進(jìn)入生物膜的形成過(guò)程，多數(shù)菌體還可重新進(jìn)入浮游狀態(tài)，因此，此時(shí)細(xì)菌的黏附是可逆的。細(xì)菌經(jīng)過(guò)初步定殖黏附后，激活與形成生物膜相關(guān)的基因，細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)分泌大量胞外聚合物黏結(jié)細(xì)菌，在該階段，細(xì)菌對(duì)物體表面的黏附更牢固，是不可逆的。隨后生物膜的形成逐漸進(jìn)入成熟期，形成高度有組織的結(jié)構(gòu)，由類似蘑菇狀或堆狀的微菌落組成，在這些微菌落之間存在大量通道，可運(yùn)送養(yǎng)料、酶、代謝產(chǎn)物等。成熟的生物膜通過(guò)蔓延、部分脫落或釋放出浮游細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)展，脫落或釋放出來(lái)的細(xì)菌重新變?yōu)楦∮尉谖矬w表面形成新的生物膜［17］。

與其他菌種比較，鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜形成率為80%～91%，其他菌種為5%～24%［18］。生物膜保護(hù)鮑曼不動(dòng)桿菌免受抗生素、噬菌體的作用，協(xié)助其在惡劣條件下存活［19-20］，該菌借助生物膜黏附于醫(yī)療設(shè)施上，使其在醫(yī)院環(huán)境中持續(xù)存在，導(dǎo)致院內(nèi)感染［21］。鮑曼不動(dòng)桿菌分離株的生物膜由菌體、細(xì)菌分泌的黏性物質(zhì)和CPS 組成，其形成通常與金屬離子、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子和外膜蛋白等表達(dá)基因的上調(diào)有關(guān)［22］，相關(guān)基因作用見表1［23-31］。黏附性是形成生物膜的第一步，菌毛有助于鮑曼不動(dòng)桿菌在任何非生物表面形成生物膜［32］，有研究表明，鮑曼不動(dòng)桿菌相關(guān)的多聚β-1，6-乙酰葡萄糖胺（polymerization β-1，6-acetylglucosamine，PNAG）、分子伴侶／分子引導(dǎo)分泌（molecular chaperone system,CUS）系統(tǒng)和群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）等也與生物膜的形成密切相關(guān)［33-35］。

表1 生物膜相關(guān)基因及其功能Tab.1 Biofilm related genes and their functions

由于多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌不斷增多［36］，抗生素的有效性越來(lái)越差，更加凸顯開發(fā)新型防治手段的重要性。接種疫苗在防治鮑曼不動(dòng)感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在該菌致病過(guò)程中涉及多種物質(zhì)（如CPS、蛋白質(zhì)及相關(guān)基因）的參與，以這些組分為靶點(diǎn)制備相應(yīng)疫苗（如OmpA、Bap 疫苗），通過(guò)降低細(xì)菌黏附和生物膜的形成，進(jìn)而阻斷或減弱鮑曼不動(dòng)桿菌的感染，以達(dá)到預(yù)防和治療的目的。

2 鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗的研發(fā)現(xiàn)狀

疫苗是預(yù)防病原體感染的重要手段，可分為滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗、植物疫苗等。目前，鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗集中于滅活全菌體疫苗、DNA疫苗、重組亞單位疫苗及莢膜多糖疫苗等研究，尚無(wú)疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。且現(xiàn)有疫苗存在周期長(zhǎng)、免疫原性弱、安全性低等缺點(diǎn)，急需開發(fā)新型疫苗用于防治鮑曼不動(dòng)桿菌感染。

2.1 滅活全菌體疫苗 鮑曼不動(dòng)桿菌滅活全菌體（inactivated whole cell，IWC）疫苗是指將培養(yǎng)的鮑曼不動(dòng)桿菌滅活后，保留具有抗原性的菌體作為主要成分的疫苗，滅活方式主要有加熱、輻射、暴露于抗生素等。加熱滅菌操作簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜；輻射滅菌更徹底，可提高疫苗安全性；暴露于抗生素法更傾向于清除多重耐藥菌。IWC 疫苗可預(yù)防由不同鮑曼不動(dòng)桿菌菌株引起的致命膿毒癥，如擴(kuò)展耐藥率（extended drug resistance rate，XDR）菌株，其7 d存活率為80%～100%，且IgG、IgG1、IgG2a和IgM水平顯著升高，刺激了Th1／Th2 介導(dǎo)的混合反應(yīng)［37-41］。這些蛋白具有中和、清除病原微生物的作用，從而減少對(duì)機(jī)體的損傷，增強(qiáng)抵抗作用。滴鼻免疫、皮下注射、腹腔注射同樣能起到以上效果，滴鼻免疫起效更快；腹腔注射免疫操作簡(jiǎn)便；皮下注射免疫機(jī)體吸收較快且產(chǎn)生抗體含量高。但I(xiàn)WC 疫苗免疫原性較弱，且滅菌不完全時(shí)可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成危害，與其他類型疫苗比較，該疫苗免疫效果較差。

2.2 減毒活疫苗 減毒活疫苗是人工誘變或從自然界篩選出毒力降低或無(wú)毒的活病原微生物制成的疫苗。免疫力較弱的人群是大多數(shù)鮑曼不動(dòng)桿菌的易感人群，因此使用減毒活疫苗存在潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。目前，已研發(fā)出一種具有TrxA黏附素缺陷的減毒多重耐藥菌株疫苗，經(jīng)小鼠腹腔或皮下免疫4周后，存活率≥90%［42］。與滅活疫苗比較，減毒活疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)強(qiáng)，但有可能發(fā)生逆行突變，在人體內(nèi)恢復(fù)毒力［43］，其安全性有待探索。

2.3 外膜蛋白疫苗 鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白疫苗主要有外膜復(fù)合物（outer membrane complex，OMC）疫苗和外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）疫苗。從鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606 中提取的OMC 可有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫，小鼠感染后的生存率≥80%，可對(duì)抗不同鮑曼不動(dòng)桿菌分離株的感染，且用OMC疫苗免疫的血清可清除鮑曼不動(dòng)桿菌（恢復(fù)率為70%～100%）［44］，但血清制劑成分復(fù)雜且不明確，安全性較低。自B群腦膜炎球菌疫苗Bexsero?（一種基于OMVs的產(chǎn)品）獲得批準(zhǔn)以來(lái)，OMVs疫苗引起人們的重視［45］，其提供了更廣泛的抗原，包括OMC和其他膜相關(guān)蛋白。通過(guò)優(yōu)化生物工程設(shè)計(jì)、分離、脂寡糖脫毒，OMVs可發(fā)展成安全有效、成本效益高的細(xì)菌疫 苗［46-47］。鮑曼不動(dòng)桿菌 ATCC 19606 產(chǎn)生的天然OMVs免疫小鼠非常有效，在異種菌株感染后，免疫小鼠的存活率為90%，基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption／ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）分析確定了OMVs 中具有高免疫原性蛋白質(zhì)，包括OmpA、OmpW、CarO［45］。HUANG 等［48］將大腸埃希菌衍生的OMVs 包裝融合了外源性鮑曼不動(dòng)桿菌Omp22 蛋白和成孔溶血蛋白ClyA，用其免疫小鼠的存活率≥60%，且無(wú)需佐劑；接種未經(jīng)修飾大腸埃希菌OMVs的小鼠存活率僅為35.0%～63.6%，表明大腸埃希菌衍生的OMVs對(duì)鮑曼桿菌感染具有交叉免疫作用。

2.4 重組亞單位疫苗 大分子抗原攜帶多種特異性抗原決定簇中，僅有少量抗原部位對(duì)保護(hù)性免疫應(yīng)答起作用。亞單位疫苗是將致病菌主要保護(hù)性免疫原組分進(jìn)行提純、組裝，篩選出具有免疫活性片段制成的，因此也叫組分疫苗［49］。2010年以來(lái)，發(fā)現(xiàn)了多種鮑曼不動(dòng)桿菌新型毒力因子及其分子相互作用，作為黏附素或侵入素的外膜免疫原蛋白是亞單位疫苗開發(fā)的主要目標(biāo)，可阻斷細(xì)菌與宿主細(xì)胞受體的黏附和定植，達(dá)到有效預(yù)防細(xì)菌感染的目的。該疫苗最可能的候選亞單位是OmpA，OmpA 參與了鮑曼不動(dòng)桿菌黏附、細(xì)胞毒性和生物膜形成等過(guò)程，在動(dòng)物模型中具有高度免疫原性。OmpA的氨基酸序列與人類蛋白質(zhì)組無(wú)同源性，但變異較?。ā?9%保守），表明鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA不可能與其他含有OmpA的共生細(xì)菌相互干擾，從而將潛在副作用降至最低［24］。研究表明，用OmpA疫苗進(jìn)行主動(dòng)免疫可對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生預(yù)防作用。小鼠經(jīng)鼻內(nèi)免疫與霍亂毒素結(jié)合的重組OmpA（rOmpA）15 d后，存活率為40%～100%，對(duì)照組在2 d內(nèi)全部死亡［50］。LUO等［51］研究發(fā)現(xiàn)，抗原劑量會(huì)影響免疫應(yīng)答水平，低劑量（3 μg）rOmpA免疫小鼠表現(xiàn)出平衡的IFNγ和IL-4免疫應(yīng)答，而接受高劑量（100 μg）免疫的小鼠表現(xiàn)出Th2極化反應(yīng)。

隨著生物信息學(xué)發(fā)展，不斷發(fā)現(xiàn)一些新的蛋白亞單位，其理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)逐漸清晰，在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中能起到不同的免疫作用，成為研制蛋白亞單位疫苗的理想抗原。有研究表明，Bap、Ata、DcaP、BfnH、BauA、OmpK／Omp22 重組蛋白疫苗均能引起保護(hù)性免疫［52-56］。亞單位疫苗通常僅由幾種主要表面蛋白組成，避免產(chǎn)生不需要的抗體，減少疫苗的副反應(yīng)。與全病毒疫苗比較，亞單位疫苗安全性更高，穩(wěn)定性更好，免疫更具持久性［57］。亞單位疫苗可以大腸埃希菌、桿狀病毒、畢赤酵母為載體，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)［58］，但其免疫原性較低，需與佐劑聯(lián)合使用。

2.5 多糖疫苗 CPS在鮑曼不動(dòng)桿菌的黏附、致病過(guò)程中起著重要作用［59-60］。CPS 可通過(guò)提取、生物合成、化學(xué)合成等方法獲得。RUDENKO 等［61］通過(guò)高碘酸鹽氧化法合成了3 種惰性載體蛋白與鮑曼不動(dòng)桿菌K9 型CPS 片段的結(jié)合物，用不含佐劑的糖結(jié)合物免疫BALB／c 和ICR-1 小鼠，發(fā)現(xiàn)兩種小鼠免疫應(yīng)答情況有差異，前者激活了IFNγ 途徑，后者不產(chǎn)生IL-4，表明刺激產(chǎn)生了Th1 型適應(yīng)性免疫應(yīng)答。TNF-α是一種具有廣泛活性的促炎細(xì)胞因子，與IFNγ結(jié)合可顯著增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的殺菌能力。因此，該多糖復(fù)合物免疫ICR-1小鼠可誘導(dǎo)Th1型適應(yīng)性免疫應(yīng)答，而免疫BALB／c小鼠可能會(huì)增強(qiáng)其吞噬細(xì)胞的殺菌能力。在RUSSO 等［62］研究中發(fā)現(xiàn)，免疫小鼠的血清能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力。CPS 疫苗能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，但抗原性和保守性欠佳，僅適用于特定菌株，隨著耐藥菌株的增加，以CPS 為靶點(diǎn)的被動(dòng)免疫可用于治療耐藥菌株的感染［63］。

2.6 核酸疫苗 核酸疫苗又稱DNA 疫苗，是將一種或多種目的抗原的編碼基因克隆至真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，再將重組質(zhì)粒直接注入體內(nèi)，在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白，誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答。有研究將重組質(zhì)粒pBudCE4.1-ompA、pEGFP-C2-nlpA、pVAX1-ompA-pal 免疫小鼠后，其血清中的促炎因子和抗體水平均升高，表明該疫苗能有效觸發(fā)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。用不低于5 × 108CFU 感染劑量的細(xì)菌免疫小鼠后，各劑量組均有小鼠存活，即該疫苗能引起保護(hù)性免疫［64-66］。核酸疫苗構(gòu)建簡(jiǎn)單、生產(chǎn)方便、表達(dá)穩(wěn)定、可誘發(fā)全面的免疫應(yīng)答［67-68］，在抗感染、抗腫瘤免疫及疾病的預(yù)防中具有廣闊應(yīng)用前景。局部注射DNA疫苗可被周圍細(xì)胞攝取，進(jìn)入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞質(zhì)中翻譯成目的蛋白，再通過(guò)細(xì)胞分泌或細(xì)胞破裂的方式進(jìn)入組織間激活B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。傳統(tǒng)免疫所使用的抗原一般是滅活病原體、減毒活病原體或病原體的亞單位蛋白，核酸疫苗僅是病原體某種抗原的基因片段，可提供與天然構(gòu)象極為接近的目的蛋白給宿主免疫系統(tǒng)，與自然感染過(guò)程相似［69］。核酸疫苗兼有良好的安全性和高效力誘導(dǎo)全方位免疫應(yīng)答，其不僅能預(yù)防疾病，還可作為治療性疫苗治療病毒性肝炎、癌癥等［70］。針對(duì)流感、乙型肝炎、艾滋病、瘧疾和癌癥DNA 疫苗的試驗(yàn)結(jié)果表明，核酸疫苗在早期階段效果較好，在小鼠模型中可誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，但在人體內(nèi)效果不佳［71］。且該疫苗存在一定風(fēng)險(xiǎn)，質(zhì)粒DNA 可能整合至細(xì)胞DNA 中，打開原癌基因，關(guān)閉抑癌基因，或誘發(fā)染色體不穩(wěn)定。

鮑曼不動(dòng)桿菌候選疫苗的主動(dòng)免疫研究結(jié)果見表2和表3。

表2 鮑曼不動(dòng)桿菌候選疫苗的主動(dòng)免疫日程Tab.2 Active immunization schedule for candidate vaccine of Acinetobacter baumannii

表3 鮑曼不動(dòng)桿菌候選疫苗的免疫效果Tab.3 Effect of candidate vaccine of Acinetobacter baumannii

3 小結(jié)與展望

多重耐藥性菌株的不斷增多使抗生素的研制越發(fā)困難，疫苗研制顯得十分重要。疫苗研制主要側(cè)重于病原體致病機(jī)理的研究，目前，重組免疫策略針對(duì)單個(gè)或多個(gè)外膜蛋白，這些蛋白易于制備且安全性高，與其他形式的疫苗比較，病原體回復(fù)突變的風(fēng)險(xiǎn)較低。在設(shè)計(jì)重組亞單位疫苗時(shí)，只需選擇在特定菌株中的已知蛋白，采用PCR 法檢驗(yàn)臨床分離物中的蛋白，應(yīng)用在線軟件分析基因組和蛋白質(zhì)組信息。鮑曼不動(dòng)桿菌菌株經(jīng)完全和部分測(cè)序選出較多保守性蛋白，評(píng)估這些候選菌株疫苗的潛力，確定鮑曼不動(dòng)桿菌感染或免疫誘導(dǎo)的特定宿主免疫途徑，將有助于發(fā)現(xiàn)潛在的免疫保護(hù)候選蛋白。

目前，大多數(shù)鮑曼不動(dòng)桿菌候選疫苗的研制均基于蛋白質(zhì)技術(shù)?？紤]到鮑曼不動(dòng)桿菌是一種侵襲性病原體，Th2極化反應(yīng)可能不足以提供有效和長(zhǎng)期的保護(hù)，混合的Th1／Th2 或Th1／Th17 反應(yīng)可能更有益。佐劑的開發(fā)可針對(duì)多種抗原，最終將提供覆蓋面廣、臨床療效好的疫苗［72-74］。另外，反向疫苗接種是一種利用大量生物信息數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)潛在候選疫苗的便捷方法［75］。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性、多樣性、疫苗接種和動(dòng)物感染模型的研發(fā)這有助于提高各種鮑曼不動(dòng)菌疫苗的有效性。