劉琳琳，李玉薇，鄒勇，張雪梅，盧佳，劉小可，王澤鋆，劉玉林，劉景會(huì)

1.長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長(zhǎng)春 130012；2.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430000

干擾素（interferon，IFN）作為廣譜抗病毒藥物，是目前用于臨床治療最重要的細(xì)胞因子之一。IFN在宿主細(xì)胞受到刺激（如病毒、細(xì)菌等各種病原體感染）時(shí)產(chǎn)生，并最終啟動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的防御機(jī)制［1］。IFN 作用于同一或鄰近細(xì)胞的IFN 受體，激活一系列抗病毒級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)上百種含IFN 刺激反應(yīng)元件的基因轉(zhuǎn)錄［2］。這些IFN 激活大量抗病毒相關(guān)基因的表達(dá)，如2′，5′-寡腺苷酸合成酶、蛋白激酶、抗黏液病毒蛋白等［3］。嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）Omicron 株在感染早期可能傳染性較高，但當(dāng)其試圖擴(kuò)散至上呼吸道以外或遇IFN 抑制時(shí)，病毒數(shù)量及感染能力會(huì)迅速下降。IFN作為天然免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子，是防御病毒入侵的第一道防線。研究表明，使用IFN 后，雖然其自身在人體內(nèi)代謝較快，但其激發(fā)的抗病毒蛋白可在人體內(nèi)穩(wěn)定存在多日［4］。感染前或感染早期，IFN 會(huì)有效刺激上皮細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制或清除Omicron株病毒，但如果細(xì)胞已被病毒破壞，IFN 則無法修復(fù)被感染細(xì)胞。因此，感染初期，IFNα 對(duì)SARS-CoV-2 的抑制是有效的。

免疫力低下人群不能及時(shí)產(chǎn)生足量?jī)?nèi)源性IFNα，使病毒獲得復(fù)制機(jī)會(huì)，這是部分人群易感并逐步趨向重癥化的原因。因此，提前補(bǔ)充外源IFNα 可快速提高人體免疫力，達(dá)到預(yù)防病毒及抗病毒的目的。IFN 具有廣譜抗病毒效果，對(duì)呼吸道合胞病毒、皰疹病毒、流感病毒、副流感病毒、冠狀病毒等呼吸道病毒均具有抑制作用［5］。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)連續(xù)印發(fā)的第一至第八版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》，均推薦成人每日2 次霧化吸入500 萬(wàn)IU 或相當(dāng)劑量IFNα［6］。眼部、鼻腔、咽部、呼吸道黏膜系統(tǒng)缺少角質(zhì)層保護(hù)，且有病毒受體，是病毒感染初期主要途徑。而呼吸道黏膜系統(tǒng)有IFNα受體，通過使用人IFNα1b滴眼（眼部黏膜、鼻淚管）、滴鼻、噴鼻（鼻腔和咽部）也可使上呼吸道黏膜系統(tǒng)在IFN 作用下產(chǎn)生大量抗病毒蛋白，使機(jī)體處于抗病毒狀態(tài)，有效阻止病毒吸附、脫殼、核酸復(fù)制、組裝、釋放等，從而抑制病毒感染、增殖，起到應(yīng)急預(yù)防和早期治療的作用。

本研究在體外細(xì)胞水平上，采用qPCR 法檢測(cè)人IFNα1b 對(duì) SARS-CoV-2 Omicron 株（BA.5／BA.2／BA.1）的抑制效果，探索低活性／濃度人IFNα1b 的抗病毒作用，對(duì)評(píng)價(jià)人IFNα1b 在應(yīng)急預(yù)防和治療SARS-CoV-2感染上的有效性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒及細(xì)胞 SARS-CoV-2 Omicron 株（BA.5／BA.2／BA.1）由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司提供，常規(guī)傳代，-80 ℃保存，Vero 細(xì)胞也由該公司提供。

1.2 IFN及陽(yáng)性對(duì)照藥 人IFNα1b原液（批號(hào)：SCF1-B202201，蛋白含量：3.8 mg／mL，生物學(xué)活性：5.1 ×107IU／mL）、人IFNα1b滴眼液（批號(hào)：20220502，生物學(xué)活性：1.0×105IU／mL，比活性1.5×107IU／mg，分子量：19 382 kD）、人IFNα1b 噴霧劑（批號(hào)：2022-1106，生物學(xué)活性：5.0 × 105IU／mL）均由長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司提供；瑞德西韋（Remde-sivir）購(gòu)自美國(guó)吉利德科技公司。

1.3 主要試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、無菌PBS 緩沖液（pH 7.2 ～7.4）購(gòu)自邁晨科技（北京）有限公司；CCK-8 試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMSO 購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸提取或純化試劑（批號(hào)：2021108）、新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：2021208）、全自動(dòng)核酸提取儀（Stream SP96）購(gòu)自廣州達(dá)安基因股份有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96 孔培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（QuantStudio5）購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.4 細(xì)胞毒性檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)人IFNα1b原液、人IFNα1b滴眼液、人IFNα1b噴霧劑、瑞德西韋共4種藥物的細(xì)胞毒性。將Vero細(xì)胞按2×104個(gè)／mL接種 96 孔板，0.1 mL／孔，37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)18 ～24 h 至細(xì)胞長(zhǎng)成單層；棄培養(yǎng)基，加入不同濃度工作液［人IFNα1b 原液：稀釋至1 × 107IU／mL 后，進(jìn)行 3 倍系列稀釋，共 8 個(gè)稀釋度；人 IFNα1b 滴眼液：稀釋至1 × 105IU／mL 后，進(jìn)行3 倍系列稀釋，共8 個(gè)稀釋度；人IFNα1b噴霧劑：稀釋至1×105IU／mL后，進(jìn)行3 倍系列稀釋，共8 個(gè)稀釋度；陽(yáng)性對(duì)照藥：瑞德西韋稀釋至 150 μmol／L 后，進(jìn)行 3 倍系列稀釋，共8 個(gè)稀釋度］，100 μL／孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)6孔，37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng) 72 h；加入 CCK-8 試劑，20 μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)1 ～ 4 h；檢測(cè)各孔450 nm 波長(zhǎng)處的A值，按下式計(jì)算受試物對(duì)細(xì)胞存活率的影響，將數(shù)據(jù)輸入GraphPad Prism 計(jì)算半數(shù)毒性濃度（CC50）。

細(xì)胞存活率（%）=［（A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔）／（A對(duì)照孔-A空白孔）］×100%

1.5 抗SARS-CoV-2 Omicron株活性檢測(cè)

采用qPCR法［7-15］。將Vero細(xì)胞按2 × 104個(gè)／mL接種96 孔板，37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層，備用。

1.5.1 人IFNα1b預(yù)孵育2 h后攻毒 將人IFNα1b原液稀釋至5×103IU／mL，進(jìn)行3 倍系列稀釋，共8 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，作為IFN 抑制組；將50 μmol／L瑞德西韋進(jìn)行3倍系列稀釋，共8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)2 個(gè)復(fù)孔，作為瑞德西韋抑制組。將各組藥品接種96孔板，100 μL／孔，37 ℃，5%CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h；棄培養(yǎng)基，PBS洗板2次，100 μL／孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組（正常細(xì)胞培養(yǎng)）和病毒對(duì)照組（僅在細(xì)胞中加入病毒）；將Omicron株（BA.5／BA.2／BA.1）按MOI=0.01 加入相應(yīng)細(xì)胞孔，100 μL／孔，37 ℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)2 h；棄病毒液，PBS洗板2次，100 μL／孔，加入細(xì)胞維持液，200 μL／孔，37 ℃，5%CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 ～72 h。顯微鏡下觀察細(xì)胞病變形態(tài)，病毒對(duì)照組細(xì)胞病變程度超過75%以上時(shí)進(jìn)行qPCR檢測(cè)。

1.5.2 人IFNα1b 與病毒同孵育 IFNα1b 原液和瑞德西韋稀釋以及Omicron 株（BA.5／BA.2／BA.1）攻毒劑量同1.5.1 項(xiàng)。將藥品與病毒同時(shí)加入Vero細(xì)胞，37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)2 h；棄混合液，PBS 洗板2 次，100 μL／孔，加入細(xì)胞維持液，200 μL／孔，37 ℃，5%CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞病變形態(tài)，在病毒對(duì)照組病變程度超過75%以上時(shí)進(jìn)行qPCR檢測(cè)。

1.6 qPCR 法 培養(yǎng)結(jié)束后，每孔取上清液0.2 mL，依次加入0.5 mL 裂解液和0.02 mL 蛋白酶K，混勻，70 ℃加熱15 min，收集樣品，全自動(dòng)核酸提取儀提取核酸，采用新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測(cè)試劑盒，于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測(cè)SARS-CoV-2 RNA水平。按下式計(jì)算不同稀釋倍數(shù)下供試品對(duì)SARSCoV-2 的抑制率，將數(shù)據(jù)輸入GraphPad Prism 計(jì)算半數(shù)有效濃度（EC50）。

抑制率（%）=［1-（藥品組病毒核酸拷貝數(shù)／病毒對(duì)照組病毒核酸拷貝數(shù)）］×100%

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性 結(jié)果顯示，人IFNα1b原液CC50無法計(jì)算，所有試驗(yàn)孔狀態(tài)良好，表明最高濃度（1×107IU／mL）人IFNα1b 原液對(duì)Vero 細(xì)胞未達(dá)到半數(shù)細(xì)胞毒性；瑞德西韋CC50無法計(jì)算，所有試驗(yàn)孔狀態(tài)良好，表明最高濃度（150 μmol／L）瑞德西韋對(duì) Vero 細(xì)胞未達(dá)到半數(shù)細(xì)胞毒性；人IFNα1b滴眼液的CC50為29 958 IU／mL，人 IFNα1b 噴霧劑的 CC50為 37 550 IU／mL，表明高濃度人IFNα1b 滴眼液和人IFNα1b 噴霧劑對(duì)Vero 細(xì)胞具有毒性。見圖1。

圖1 人IFNα1b原液（A）、人IFNα1b滴眼液（B）、人IFNα1b噴霧劑（C）、瑞德西韋（D）對(duì)Vero細(xì)胞毒性的檢測(cè)Fig.1 Determination of cytotoxicity of human IFNα1b bulk（A），human IFNα1b eye drops（B），human IFNα1b spray（C）and Redesivir（D）on Vero cells

2.2 人IFNα1b抗SARS-CoV-2 Omicron株活性

2.2.1 人 IFNα1b 預(yù)孵育 2 h 后攻毒 人 IFNα1b 對(duì)BA.1 株的 EC50為 9.30 IU／mL（32 pmol／L），瑞德西韋為 0.314 7 μmol／L；人 IFNα1b 對(duì) BA.2 株的EC50為 13.38 IU／mL（46 pmol／L），瑞德西韋為0.291 0 μmol／L；人 IFNα1b 對(duì) BA.5 株的 EC50為12.33IU／mL（42.4pmol／L），瑞德西韋為0.3003μmol／L。見圖2。

圖2 預(yù)防組人IFNα1b（A）和瑞德西韋（B）對(duì)SARS-CoV-2 Omicron株（BA.5／BA.2／BA.1）的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of human IFNα1b（A）and Remdesivir（B）against SARS-CoV-2 Omicron strain（BA.5／BA.2／BA.1）in prevention group

2.2.2 人IFNα1b 與病毒同孵育 人IFNα1b 對(duì)BA.1株的EC50為19.68 IU／mL（67.7 pmol／L），瑞德西韋為 0.320 5 μmol／L；人 IFNα1b 對(duì) BA.2 株的 EC50為10.91IU／mL（37.5pmol／L），瑞德西韋為0.2744μmol／L；人IFNα1b對(duì)BA.5株的EC50為18.84 IU／mL（64.8pmol／L），瑞德西韋為0.304 1 μmol／L。見圖3。

圖3 同時(shí)攻毒組人IFNα1b（A）和瑞德西韋（B）對(duì)SARSCoV-2 Omicron株（BA.5／BA.2／BA.1）的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of human IFNα1b（A）and Remdesivir（B）against SARS-CoV-2 Omicron strain（BA.5／BA.2／BA.1）in simultaneous challenge group

3 討論

目前由SARS-CoV-2 感染引起的新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）疫情仍在全球暴發(fā)流行［16-19］。2022年底，我國(guó)出現(xiàn)各種SARSCoV-2 Omicron 株大規(guī)模感染，具有傳播速度快、毒力強(qiáng)和容易免疫逃逸等特點(diǎn)［20-22］。SARS-CoV-2病原學(xué)復(fù)雜，易發(fā)生變異，給疫苗研究和有效接種帶來了巨大困難，目前仍缺乏針對(duì)性特效藥物［23-25］。

本研究結(jié)果顯示，在體外細(xì)胞水平上，極低活性／濃度的人IFNα1b對(duì)SARS-CoV-2 Omicron株（BA.5／BA.2／BA.1）均具有較好的抑制活性，且人IFNα1b原液的細(xì)胞毒性極低，治療指數(shù)高，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物。關(guān)于人IFNα1b在體內(nèi)是否具有相同的抑制效果，尚需進(jìn)一步確認(rèn)，因此后續(xù)將開展人IFNα1b 體內(nèi)抗SARS-CoV-2 Omicron 株感染的藥效評(píng)價(jià)。

研究表明，SARS-CoV-2 在鼻腔的內(nèi)皮細(xì)胞滴度相對(duì)較高，咽喉和支氣管逐漸降低，肺部相對(duì)較低，這種病毒的感染模式和分布提示，IFN通過滴鼻或噴霧遞送至鼻腔或喉嚨，可能在局部有效抑制SARSCoV-2 的感染［26］，起到類似疫苗的預(yù)防作用。因此，人IFNα1b 滴眼液和人IFNα1b 噴霧劑有希望成為臨床預(yù)防SARS-CoV-2 Omicron株感染的特效藥。