武海軍，李玉鳳，鐘強(qiáng)，張廣桃，馬春雷，謝紀(jì)珍

(1.山東省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250013；2.青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266033;3.山東華鉑凱盛生物科技有限公司，山東 濟(jì)南 250098)

瑞德西韋(Remdesivir，GS-5734)，又名倫地西韋，結(jié)構(gòu)式見圖1，這是一種具有廣譜抗病毒活性的核苷類似物。瑞德西韋作為一種前體藥物，其進(jìn)入宿主細(xì)胞后會(huì)代謝為具有藥理活性的三磷酸核苷(nucleoside triphos phate，NTP)[1],隨后被RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)識(shí)別，滲入病毒基因組的合成，使得磷酸二酯鍵無法形成，進(jìn)而終止 RNA 鏈的合成，抑制病毒復(fù)制。瑞德西韋阻斷病毒復(fù)制、發(fā)揮抑制病毒作用的方法有兩種，其一是與三磷腺苷(ATP)競爭 RdRp，其二為阻止校正作用的核糖核酸外切酶發(fā)揮正常功能[2-4]。作為單磷酸前藥，瑞德西韋結(jié)構(gòu)中的苯酚和氨基酸酯可以掩蓋單磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，使其很容易地被動(dòng)滲透到細(xì)胞中。在將單磷酸輸送到細(xì)胞中時(shí)，可以有效繞過限速第一磷酸化步驟，從而顯著提高母體核苷的效力。隨后，胞內(nèi)酯酶(如羧基酯酶-1和組織蛋白酶A)將酯分解為羧基結(jié)構(gòu)，然后繼續(xù)分解為單磷酸核苷，最后被磷酸化為三磷酸核苷發(fā)揮抗病毒效果[4]。瑞德西韋在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出對(duì)多種病毒的抑制作用，例如冠狀病毒、丙肝病毒、人類免疫缺陷病毒和埃博拉病毒等[2,5]。目前，瑞德西韋用于埃博拉病毒感染治療的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)已完成，未發(fā)現(xiàn)其有明顯不良反應(yīng)[4]；在 CN103052631B 和 CN105443098B 中瑞德西韋可以治療呼吸道合胞病毒感染和副流感病毒感染[6-7]；在 CN107073005A 中瑞德西韋可以治療絲狀病毒科病毒感染[8]；在 CN108348526A 中瑞德西韋可以治療拉沙病毒和胡寧病毒感染[9]；在 HAE 細(xì)胞中，瑞德西韋對(duì) SARS-CoV 和 MERS-CoV 的EC50值為 74 nmol·L-1，在延遲腦腫瘤細(xì)胞中，對(duì)鼠肝炎病毒的 EC50值為30 nmol·L-1[3]。在 Vero E6細(xì)胞中，瑞德西韋可有效抑制 SARS-CoV-2 的感染，EC50為 0.77 μmol·L-1，選擇指數(shù)(selection index，SI)>129[10]，這說明瑞德西韋在細(xì)胞水平上能對(duì)冠狀病毒感染起到抑制效果。

圖1 瑞德西韋分子結(jié)構(gòu)

然而，瑞德西韋溶解性較差，它在水中溶解度大約 0.03 mg·mL-1，且化學(xué)不穩(wěn)定，在pH約4～5之間的溶液最穩(wěn)定，在pH為4或以下時(shí)，溶解度增加，這在美國專利 US20190083525 中也有確證[11]。除此之外，瑞德西韋溶解在含有有機(jī)溶媒的水溶液中，會(huì)隨混合溶液中有機(jī)溶劑或增溶劑比例的下降而急劇下降，稀釋過程中極容易析出，從而帶來安全性問題。根據(jù) US20190083525 描述及我們研究顯示，采用吐溫80或PEG300溶解瑞德西韋需要大量的吐溫80或PEG300，且組成黏度大；采用無菌生產(chǎn)工藝樣品難以過濾，而采用終端滅菌工藝會(huì)導(dǎo)致樣品出現(xiàn)不穩(wěn)定的問題，且臨床應(yīng)用時(shí)如果稀釋10倍或者100倍，會(huì)導(dǎo)致瑞德西韋結(jié)晶析出、長期放置不穩(wěn)定，同時(shí)會(huì)在體內(nèi)造成溶血、超敏反應(yīng)等問題[11]，這也是吉利德公司的沒有選擇吐溫80作為增溶劑，而是選擇了磺丁基倍他環(huán)糊精的原因。

根據(jù)美國專利 US20190083525 及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，瑞德西韋凍干制劑除活性成分外，還包含以下非活性成分：注射用水，磺丁基-β-環(huán)糊精鈉(SBECD),使用鹽酸和/或氫氧化鈉將制劑的pH調(diào)節(jié)至3.0至4.0，而后凍干[11]。瑞德西韋臨床給藥方式為：首日靜脈給藥200 mg，之后每天一次100 mg，30 min內(nèi)完成，根據(jù)病毒載荷持續(xù)給藥9～13 d[12]，這樣的給藥方式和瑞德西韋的藥物代謝方式有關(guān)。在靜脈給藥后，瑞德西韋會(huì)進(jìn)入細(xì)胞代謝成活性的GS-443902(見圖2)。外周血單核細(xì)胞(PBMC)中研究表明，GS-443902的半衰期長達(dá)35 h以上[13]。根據(jù)WHO的報(bào)告[14]，瑞德西韋在3～225 mg范圍內(nèi)單次靜脈注射給藥2 h的情況下，其體內(nèi)濃度具有線性的劑量相關(guān)性。早期研究顯示在30 min內(nèi)靜脈內(nèi)給予瑞德西韋75 mg提供與2 h內(nèi)相同劑量相似的母體暴露水平，但GS-443902的PBMC暴露高于2 h內(nèi)靜脈給予瑞德西韋150 mg。該數(shù)據(jù)支持在30 min的較短時(shí)間間隔內(nèi)給藥，這是使活性代謝物GS-443902的細(xì)胞內(nèi)水平最大化的更有效給藥方式。外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的GS-443902觀察到細(xì)胞內(nèi)半衰期超過35 h，這支持了每天一次的瑞德西韋給藥。此外，細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的累積比為2.7～3.5倍，首劑量瑞德西韋200 mg，每天重復(fù)瑞德西韋100 mg 維持劑量，保證了隨后的GS-443902穩(wěn)態(tài)PBMC水平的實(shí)現(xiàn)，對(duì)急性感染患者的治療至關(guān)重要[15-16]。

圖2 GS-443902化學(xué)結(jié)構(gòu)式

截至目前，除了吉利德所報(bào)道的瑞德西韋環(huán)糊精凍干制劑，再無其他劑型報(bào)道，雖然現(xiàn)有劑型解決了瑞德西韋水溶性問題，并用于臨床，但現(xiàn)有瑞德西韋劑型仍存在如下問題：①磺丁基-β-環(huán)糊精鈉主要通過腎小球?yàn)V過作用在腎臟中排泄，總體上體內(nèi)安全，但在肌酐清除率<50 mL·min-1或長期多劑量給藥的情況下會(huì)出現(xiàn)腎小管空泡化的組織病理學(xué)改變，甚至出現(xiàn)肺泡沫細(xì)胞灶，肝壞死和腎小管堵塞[17]；②瑞德西韋療效有劑量依賴性，應(yīng)提高單核細(xì)胞對(duì)其吞噬效率、速率，以更好提高GS-443902穩(wěn)態(tài)PBMC水平[13]；③COVID-19 病理特征CT影像顯示大部分COVID-19 患者肺部出現(xiàn)病變，病灶部位多不規(guī)則。輕癥患者肺部病變以磨玻璃密度影為主；重癥患者肺部病變以磨玻璃密度影合并彌漫性實(shí)變影為主[18],多伴條索狀陰影，部分為雙肺病變，少數(shù)呈“白肺”狀。經(jīng)肺部活檢，患者肺部均發(fā)生病理變化，包括：①肺部存在蛋白質(zhì)滲出物；②氣腔內(nèi)存在大量免疫細(xì)胞；③肺部可見纖維蛋白；④肺泡上皮細(xì)胞增生，COVID-19對(duì)肺部損傷很重；此外COVID-19對(duì)肝、脾、腎都有影響。然而由于血漿中存在大量的水解酶，瑞德西韋在血漿中很不穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)表明，瑞德西韋靜脈注射后，在小鼠體內(nèi)的血漿半衰期小于 5 min，恒河猴體內(nèi)的血漿半衰期僅為 0.39 h[1,3]，在人體血漿中的半衰期為 1 h[19]。基于瑞德西韋的物理化學(xué)性質(zhì)及其在組織血漿中的不穩(wěn)定性，可以預(yù)計(jì)靜脈注射后瑞德西韋在肺部組織中的分布和滲透率較低。在多項(xiàng)動(dòng)物模型中，肺部均未檢測到瑞德西韋，其活性代謝物的濃度也較低。因此應(yīng)盡可能提高其病灶部位濃度，從而提高療效。

基于上述問題，我們制備瑞德西韋(Remdesivir，GS-5734)聚合物納米膠束粉針形態(tài)，在不需要磺丁基-β-環(huán)糊精鈉(SBECD)及任何酸堿調(diào)節(jié)劑的情況下，就解決了瑞德西韋水溶性、物理、化學(xué)穩(wěn)定性問題，重要的是所制備的瑞德西韋聚合物納米膠束粉針劑復(fù)溶后，可自組裝成 8～100 nm大小的粒子，有利于藥物被動(dòng)聚集在肺部，提高瑞德西韋的最大耐受劑量。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 瑞德西韋原料(山東華鉑凱盛生物科技有限公司，批號(hào):200413，含量：99.0%)；瑞德西韋普通注射劑(山東華鉑凱盛生物科技有限公司，批號(hào):200501，100 mg/瓶)；瑞德西韋對(duì)照品(山東華鉑凱盛生物科技有限公司，批號(hào):200319，含量：99.0%)；mPEG-b-PDLLA(山東華鉑凱盛生物科技有限公司，批號(hào):191208)；無水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純)。

1.2 儀器 試驗(yàn)所用儀器有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(杭州庚雨儀器有限公司，N-1100)；冷凍干燥機(jī)(上海億倍實(shí)業(yè)有限公司，YB-FD-20D)；透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社，JEM-1200EX)；馬爾文粒度測定儀(英國馬爾文儀器有限公司，Nano S90)；X 射線衍射儀(德國布魯克公司，D8 ADVANCE)；液相色譜儀(安捷倫1200)；電子天平(上海精密電子天平，F(xiàn)A1204B)；高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-16G)；水浴恒溫振蕩器(國華企業(yè)，SHA-B)。

1.3 瑞德西韋聚合物膠束的制備及表征

1.3.1 瑞德西韋聚合物膠束制備 采用固體分散法制備瑞德西韋聚合物膠束[20]，先將瑞德西韋與mPEG-b-PDLLA按1∶9比例共溶于無水乙醇中，60 ℃水浴條件下減壓蒸餾至溶劑全部蒸出，得到分散均勻聚合物基質(zhì)，加入60 ℃預(yù)熱的注射用水溶解基質(zhì)即得瑞德西韋聚合物膠束溶液。將溶液用0.22 μm的微孔濾膜過濾，續(xù)濾液分裝后凍干，置于4 ℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 形態(tài)粒徑表征 瑞德西韋膠束凍干粉用水分散后，滴于Formvar膜，室溫下自然晾干后，用1%磷鎢酸負(fù)染，室溫晾干后，用透射電子顯微鏡(JEM-1200EX，JEOL)，于50 k倍下觀察形態(tài)。瑞德西韋膠束凍干粉用水分散后，用馬爾文激光粒度測定儀(Nano S90，Malvern)進(jìn)行粒徑測試，平行3次。

1.3.3 XRD單晶衍射測試 室溫下，分別取200 mg空白mPEG-b-PDLLA聚合物載體材料、瑞德西韋、瑞德西韋膠束凍干粉、瑞德西韋與材料物理混合粉(1∶9)，置于瑪瑙研缽適度研磨，取適量研磨細(xì)粉置于測試槽，并用干凈載玻片涂抹均勻，用XRD單晶衍射儀(D8 ADVANCE)進(jìn)行測試分析。射線為經(jīng)鎳濾過處理銅Kα輻射(λ =0.154 nm)，掃描范圍為5o～50o，記錄圖譜并分析。

1.3.4 瑞德西韋含量測定 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑C18(4.6 mm ×150 mm,5 μm)，以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀2.72 g，加水1 000 mL，攪拌溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行線性洗脫；流速為每分鐘1.0 mL；柱溫為30 ℃；檢測波長為240 nm；進(jìn)樣體積20 μL。精密稱定相當(dāng)于瑞德西韋10 mg的聚合物樣品，置10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。取20 μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。另精密稱定瑞德西韋對(duì)照品10 mg，置10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液，同法測定。

表1 洗脫梯度

1.3.5 載藥量與包封的測定 精密稱取相當(dāng)于含瑞德西韋10 mg的聚合物納米膠束凍干粉置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，超聲溶解，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液照色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)3次，按外標(biāo)法計(jì)算。通過公式(1)、(2)計(jì)算瑞德西韋的載藥量和包封率。

(1)

(2)

1.3.6 體外釋放曲線測定 分別取含瑞德西韋濃度為0.5 mg·mL-1膠束水溶液以及瑞德西韋普通注射液各5 mL，置于透析袋中進(jìn)行體外釋放，平行3組。釋放介質(zhì)為0.1% CTAB水溶液35 mL ，置于37 ℃，100 r·min-1水浴恒溫振蕩器振搖。分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取釋放介質(zhì)1 mL，同時(shí)補(bǔ)入新鮮介質(zhì) l mL，照“1.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，采用外標(biāo)法計(jì)算瑞德西韋累計(jì)釋放度，繪制體外釋放曲線。

2 結(jié)果

2.1 瑞德西韋聚合物膠束制備結(jié)果與形態(tài)表征 采用固體分散方法制備的瑞德西韋聚合物納米膠束包封率、收率均很理想，復(fù)溶前及復(fù)溶后水溶液有明顯藍(lán)色乳光，符合丁達(dá)爾現(xiàn)象。圖1A為瑞德西韋聚合物納米膠束的凍干粉針劑形態(tài)，復(fù)溶共聚物后形成的膠束溶液澄清且具有淺藍(lán)色乳光(見圖1B)。圖2馬爾文激光粒度儀測定瑞德西韋聚合物納米膠束復(fù)溶后的粒徑，平均結(jié)果為(12.97±1.33)nm(見圖2A)，多分散指數(shù)為(0.062±0.023)。經(jīng)染色后的瑞德西韋膠束在透射電鏡下粒子形態(tài)圓整，分散均勻，粒徑在10～100 nm (見圖2B)。但采用磺丁基-β-環(huán)糊精鈉包裹的瑞德西韋普通制劑，其水溶液通過馬爾文激光粒度儀測定，其粒徑非常不均勻(見圖3)。

A.瑞德西韋聚合物納米膠束的凍干粉針劑;B.瑞德西韋聚合物納米膠束水溶液圖1 瑞德西韋聚合物納米膠束

A.瑞德西韋聚合物納米膠束水溶液馬爾文測定粒徑;B.瑞德西韋聚合物納米膠束透射電鏡圖2 馬爾文激光粒度儀測定瑞德西韋聚合物納米膠束復(fù)溶后的粒徑

圖3 瑞德西韋普通注射劑(SBECD裝載)水溶液馬爾文測定粒徑

2.2 XRD單晶衍射測試結(jié)果 XRD單晶衍射圖譜如圖4所示，MPEG-b-PDLLA空白材料在19 °及23 °有明顯特征峰(見圖4A)，瑞德西韋聚合物納米膠束凍干粉(見圖4B)與瑞德西韋和載體材料的物理混合粉(見圖4C)在相同位置均存在明顯的載體輔料特征峰，而純?nèi)鸬挛黜f原料(見圖4D)此處并無吸收，由此表明19°及23°位置峰為材料特征峰。同理，瑞德西韋原料在8～18°及22.5°存在峰高不等的峰(見圖4D)，此為瑞德西韋特征峰，并且在瑞德西韋和載體材料的物理混合粉樣品圖中也有這些特征峰，相反，瑞德西韋聚合物納米膠束凍干粉卻沒有瑞德西韋特征峰，說明瑞德西韋完全包裹在載體的內(nèi)部，而不是吸附在外面，而采用物理混合的粉末(見圖4C)有明顯瑞德西韋特征峰(8～18°及22.5°)，這也驗(yàn)證瑞德西韋聚合物納米膠束中的瑞德西韋是包裹在納米膠束載體中。

A.載體mPEG-PDLLA;B.瑞德西韋聚合物納米膠束凍干粉(RNM);C.瑞德西韋原料(Remdesivir);D.載體mPEG-PDLLA與瑞德西韋原料的物理混合粉(10∶90)的XRD衍射圖譜圖4 XRD單晶衍射圖

2.3 載藥量與包封率測試結(jié)果 圖5為瑞德西韋聚合物納米膠束的HPLC圖譜，其主峰保留時(shí)間20.25 min，與前后雜質(zhì)能夠有效分離，同時(shí)瑞德西韋聚合物納米膠束載藥量與包封率測試結(jié)果見表2，其載藥量平均值為(10.95%±0.33%)，瑞德西韋聚合物納米膠束的包封率為(99.25%±0.86%)，說明我們的制備工藝具有較好的載藥量與包封率。

圖5 瑞德西韋聚合物納米膠束的HPLC圖

表2 載藥量與包封率結(jié)果

2.4 體外釋放 通過HPLC檢測瑞德西韋從聚合物納米膠束與普通瑞德西韋注射液(SBECD包裹)在0.5%(W/V)吐溫-80的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)介質(zhì)中的釋放行為。如圖6所示，瑞德西韋聚合物納米膠束在24 h藥物只釋放了60%，而普通瑞德西韋注射液在3 h內(nèi)藥物釋放已達(dá)85%以上，表明瑞德西韋聚合物納米膠束具有明顯的緩釋效果。

圖6 (▲)普通瑞德西韋注射液和(■)瑞德西韋聚合物膠束體外釋放曲線(n=3)

3 討論

本文采用生物可降解mPEG-b-PDLLA聚合物材料，利用固體分散法制備瑞德西韋納米聚合物納米膠束，極大提高了瑞德西韋的水中溶解度。其載藥機(jī)理是由于系統(tǒng)自由能的降低即疏水作用引起聚合物材料自組裝，形成疏水部分-親水部分的“核-殼”結(jié)構(gòu)，組裝的同時(shí)藥物被包載于疏水內(nèi)核?；嵌』?β-環(huán)糊精鈉主要通過腎小球?yàn)V過作用在腎臟中排泄，劑量過大會(huì)出現(xiàn)腎小管空泡化的組織病理學(xué)改變，而瑞德西韋聚合物納米膠束粒徑8～100 nm且分布均勻，形態(tài)圓整，腎臟的清除閾值為5～6 nm，瑞德西韋聚合物納米膠束可以避免腎臟清除，消除了磺丁基-β-環(huán)糊精鈉在腎臟蓄積問題；同時(shí)平均粒徑為(12.97±1.33)nm的粒子在肺部會(huì)有大量聚集，這對(duì)提高肺部藥物聚集，提高藥效無疑是有意的。

瑞德西韋與載體材料構(gòu)成穩(wěn)定疏水內(nèi)核，載藥量高，包封性好，無藥物突釋現(xiàn)象，且通過載體減小藥物透過和擴(kuò)散系數(shù)，使藥物釋放達(dá)到緩釋效果。2020 年 10 月 FDA 批準(zhǔn)吉利德公司的瑞德瑞德西韋普通注射劑Veklury[21]，盡管在目前的臨床數(shù)據(jù)中顯示出了益處[22]，其療效仍然是有限的。2020 年 11 月 20 日，世界衛(wèi)生組織(WHO)于英國醫(yī)學(xué)雜志 BMJ 更新了關(guān)于新冠肺炎治療藥物指南[23]，指出無論病情輕重，指南均不推薦新冠肺炎住院患者使用瑞德西韋，確證瑞德西韋不是新冠肺炎最優(yōu)選藥物，但考慮其存在多種適應(yīng)證，構(gòu)建其新的遞送系統(tǒng)，對(duì)開發(fā)其新的適應(yīng)證提高療效仍然會(huì)有重要意義。