劉倩，張琦，謝青貞

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

胚胎著床是人類和胎生動(dòng)物生殖生理過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，絕大多數(shù)的妊娠丟失被認(rèn)為發(fā)生于胚胎著床期間[1]。滋養(yǎng)層細(xì)胞在胚胎著床和整個(gè)妊娠過程中具有重要作用，其功能失調(diào)會導(dǎo)致胚胎著床失敗、自然流產(chǎn)、妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞疾病等妊娠相關(guān)性疾病的發(fā)生。然而滋養(yǎng)層細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制至今仍未完全明確。

microRNAs(miRNAs)是一類非編碼的小RNA，在蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。其中，microRNA125a-3p(miR-125a-3p)在抑制細(xì)胞增殖分化、侵襲等活動(dòng)方面具有重要作用，并在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)[2]。在生殖方面，miR-125a-3p被指出參與了卵母細(xì)胞的成熟過程[3]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)等信號傳導(dǎo)通路的活化也受到miR-125a-3p的調(diào)控[4]。我們的前期研究首次發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞中存在Fyn的表達(dá)，后者可調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能(未發(fā)表數(shù)據(jù))。miR-125a-3p被證實(shí)可通過與Fyn mRNA 3′端的非翻譯區(qū)相結(jié)合，直接抑制Fyn的表達(dá)和活性，其對細(xì)胞活動(dòng)的影響至少部分依賴于Fyn的作用[5]。因此，本研究擬進(jìn)一步檢測miR-125a-3p在不同滋養(yǎng)層細(xì)胞系中的表達(dá)特點(diǎn)，并從滋養(yǎng)層細(xì)胞行為角度探索miR-125a-3p的作用及相關(guān)機(jī)制，以進(jìn)一步了解胚胎著床過程及滋養(yǎng)層細(xì)胞功能調(diào)控，為相關(guān)妊娠并發(fā)癥的診治提供新依據(jù)。

材料和方法

一、細(xì)胞系

人滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo，絨癌細(xì)胞系JAR和JEG-3均購自ATCC(American Type Culture Collection)，培養(yǎng)在37℃、5%CO2條件下。

二、主要試劑和儀器

RPMI 1640、MEM、胎牛血清、胰酶-EDTA溶液(0.25%)、青霉素-鏈霉素混合液、Opti-MEMI均購自美國GIBCO公司，Trizol購自美國Ambion公司，HiScript Reverse Transcriptase(RNase H)、5×HiScript Buffer、50×ROX Reference Dye Ⅱ、SYBR Green Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，miR-125a-3p inhibitor及陰性對照、miR-125a-3p引物、U6引物、GAPDH引物均來源于上海捷瑞生物工程有限公司，Lipofectamine 2000購自美國Thermo公司，CCK8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自美國MCE公司(MedChemExpress)，Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠均購自美國Corning公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白A/G-瓊脂糖均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗GAPDH兔多克隆抗體購自杭州賢至生物有限公司，抗Fyn兔單克隆抗體、抗信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)兔單克隆抗體、抗ERK鼠單克隆抗體、抗p-ERK兔單克隆抗體均購自英國Abcam公司，抗p-STAT3兔單克隆抗體購自美國CST公司，HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗和HRP標(biāo)記羊抗兔二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司，通用酪氨酸激酶測定試劑盒購自日本Takara公司。

ABI QuantStudio6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司，奧利巴斯光學(xué)顯微鏡IX51購自日本OLYMPUS公司，多功能酶標(biāo)儀Flexstation 3購自美國Molecular Devices公司，CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，分光光度計(jì)檢測純度。按照HiScript Reverse Transcriptase試劑說明合成cDNA，采用20 μl的cDNA、引物、SYBR Green 和ROX reference dye Ⅱ混合物構(gòu)成PCR反應(yīng)體系，2-ΔΔCT計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。所用引物序列如下：miR-125a-3p正向引物：5′-TGCGCACAGGTGAGGTTCTTGG-3′，反向引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；莖環(huán)引物：5′-GTCGTATCCAGTG-CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-GGCTCCCA-3′；U6正向引物：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向引物：5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′；Fyn正向引物：5′-GCACGGACAGAAGATGAC-3′，F(xiàn)yn 反向引物：5′-CCAATCACGGATAGAAAGT-3′；GAPDH正向引物：5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′，GAPDH反向引物：5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：細(xì)胞培養(yǎng)于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，胰蛋白酶消化傳代。選取指數(shù)生長期的HTR-8/SVneo、JEG-3細(xì)胞，待細(xì)胞融合度約為70%時(shí)，利用Lipofectamine 2000進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染：(1)空白對照組(CK組)，未做任何處理；(2)陰性對照組(NC組)，轉(zhuǎn)染NC-inhibitor；(3)實(shí)驗(yàn)組(inhibitor組)，轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor。轉(zhuǎn)染6 h后換液，轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細(xì)胞以備檢測。

3.CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況：取指數(shù)生長期的細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板，轉(zhuǎn)染24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，37℃培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測定450 nm波長下各孔吸光值(OD450)。

4.Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力：分別收集各組細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至3×105/ml。無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠至終濃度1 mg/ml。24孔板中預(yù)先加入4℃預(yù)冷800 μl 10% FBS的培養(yǎng)基(含雙抗)，并放入Transwell小室，在Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μl Matrigel膠，37℃溫育4～5 h使其干成膠狀，后在Transwell上室分別加入200 μl各組細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。70%乙醇固定細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫染色。倒置光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選擇5個(gè)100倍視野，計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。

5.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況：用培養(yǎng)基調(diào)整指數(shù)生長期的細(xì)胞密度到5×105/ml，接種于6孔板，每孔1 ml細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)染24 h后按照AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行操作。同時(shí)設(shè)陰性對照，即正常細(xì)胞不加AnnexinV-APC和7-AAD；陽性對照1，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加5 μl AnnexinV-APC單標(biāo)；陽性對照2，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加5 μl 7-AAD單標(biāo)。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，以nnexinV-APC和7-AAD雙陽、AnnexinV-APC單陽細(xì)胞視為凋亡細(xì)胞。

6.Western blot檢測蛋白表達(dá)：細(xì)胞裂解后提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。通過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS/PAGE)分離蛋白，并通過電印跡轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。室溫下，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育，4℃過夜。漂洗后，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h。顯影，曝光，BandScan分析膠片灰度值。

7.免疫共沉淀法檢測Fyn活性：將總細(xì)胞裂解蛋白液與50 μl蛋白A/G-瓊脂糖珠混合，混合物4℃ 10 000g離心10 min，取上清液，加入5～30 μg靶向FYN特異性抗體，室溫孵育1 h，再加入30 μl蛋白A/G-瓊脂糖，室溫孵育20 min。使用通用酪氨酸激酶測定試劑盒，依照說明書測定Fyn激酶活性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、miR-125a-3p在3種不同細(xì)胞系中的表達(dá)水平

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HTR-8/SVneo、JAR和JEG-3細(xì)胞中miR-125a-3p的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-125a-3p mRNA相對表達(dá)水平在HTR-8/SVneo、JAR和JEG-3細(xì)胞中依次降低，以HTR-8/SVneo細(xì)胞為參照，分別為(1.000±0.012)、(0.664±0.022)和(0.322±0.019)，組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(圖1)。

與HTR-8/SVneo組比較，**P<0.01；與JAR組比較，##P<0.01。圖1 miR-125a-3p在不同細(xì)胞系中的表達(dá)

二、miR-125a-3p干預(yù)對其在滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)水平的影響

干預(yù)實(shí)驗(yàn)以miR-125a-3p表達(dá)最高的HTR-8/SVneo細(xì)胞系和miR-125a-3p表達(dá)最低的JEG-3細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)對象，轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-125a-3p表達(dá)水平。HTR-8/SVneo和JEG-3細(xì)胞中inhibitor組miR-125a-3p的相對表達(dá)水平顯著低于空白對照組(CK組)及陰性對照組(NC組)[分別為(0.406±0.038)vs.(1.000±0.029)vs.(1.031±0.098)，(0.415±0.035)vs.(1.000±0.093)vs.(1.060±0.092)，P<0.05](圖2)。

A：HTR-8/SVneo細(xì)胞；B：JEG-3細(xì)胞。與其他兩組比較，*P<0.05。圖2 HTR-8/SVneo細(xì)胞和JEG-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor后的表達(dá)抑制

三、miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor后滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)(圖3)。HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖率，CK組為(100.000±3.808)%，NC組為(99.408±0.854)%，inhibitor組則升高至(142.190±3.297)%，inhibitor組與其他兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。JEG-3細(xì)胞的增殖率，CK組為(100.000±1.762)%，NC組為(98.821±3.064)%，inhibitor組則升高至(120.917±2.239)%，inhibitor組與其他兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

與其他兩組比較，*P<0.05。圖3 miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖能力的影響

四、miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲作用的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HTR-8/SVneo細(xì)胞系中miR-125a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲數(shù)量較CK組和NC組顯著增加[(1.422±0.062)vs.(1.000±0.025)vs.(1.006±0.027)，P<0.05]；JEG-3細(xì)胞系中inhibitor組的細(xì)胞侵襲數(shù)量較CK組和NC組顯著增加[(1.286±0.026)vs.(1.000±0.022)vs.(1.010±0.033)，P<0.01](圖4)。

五、miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，miR-125a-3p抑制后，滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡數(shù)量減少(圖5)。HTR-8/SVneo細(xì)胞的凋亡率，CK組為(6.137±0.159)%，NC組為(6.437±0.266)%，inhibitor組則下降至(2.290±0.223)%，inhibitor組與其他兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。JEG-3細(xì)胞的凋亡率，CK組為(6.793±0.134)%，NC組為(7.547±0.273)%，inhibitor組則為(4.287±0.333)%，inhibitor組與其他兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

A：不同處理下滋養(yǎng)層細(xì)胞相對侵襲數(shù)量：與其他兩組比較，*P<0.05，**P<0.01。B：各組Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖中藍(lán)紫色顯示為遷移到下層的細(xì)胞。圖4 miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的影響

A：不同條件下滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡情況的流式細(xì)胞散點(diǎn)圖；B：各組細(xì)胞的凋亡率：與其他兩組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的影響

六、miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細(xì)胞中Fyn的表達(dá)和活性的影響

HTR-8/SVneo和JEG-3細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后，檢測Fyn的mRNA和蛋白表達(dá)，以及活性變化。結(jié)果顯示，miR-125a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組中Fyn的mRNA和蛋白表達(dá)量明顯增加，活性水平亦明顯升高(圖6)。HTR-8/SVneo細(xì)胞中Fyn mRNA相對表達(dá)水平：CK組為(1.000±0.108)，NC組為(0.990±0.082)，inhibitor組上升至(3.590±0.184)，inhibitor組與其他兩組相比有顯著性差異(P<0.01)；HTR-8/SVneo細(xì)胞中Fyn蛋白相對表達(dá)量：inhibitor組(2.851±0.205)顯著高于CK組(1.018±0.204)和NC組(1.000±0.241)(P<0.05)；HTR-8/SVneo細(xì)胞中Fyn的活性水平：inhibitor組[(73.311±3.090)U/5×106細(xì)胞]顯著高于CK組[(25.322±2.025)U/5×106細(xì)胞]和NC組[(32.000±1.732)U/5×106細(xì)胞](P<0.01)。JEG-3細(xì)胞呈現(xiàn)出類似的改變，inhibitor組Fyn mRNA相對表達(dá)水平(2.070±0.130)顯著高于CK組(1.000±0.089)和NC組(1.080±0.102)(P<0.01)；Fyn蛋白相對表達(dá)量(2.797±0.047)顯著高于CK組(1.125±0.020)和NC組(1.000±0.047)(P<0.01)；Fyn活性水平[(154.200±2.810)U/5×106細(xì)胞]顯著高于CK組[(108.684±3.888)U/5×106細(xì)胞]和NC組[(103.242±2.755)U/5×106細(xì)胞](P<0.01)。

A：Western blot檢測Fyn蛋白水平；B：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Fyn mRNA水平；C：免疫共沉淀檢測Fyn活性水平。與其他兩組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 抑制miR-125a-3p后Fyn mRNA和蛋白表達(dá)及活性變化

七、miR125a-3p對滋養(yǎng)層細(xì)胞中相關(guān)信號通路的影響

采用Western blot檢測抑制miR-125a-3p后滋養(yǎng)層細(xì)胞中相關(guān)信號通路ERK1/2和STAT3的磷酸化水平，以評估m(xù)iR-125a-3p是否可通過ERK1/2-STAT3通路對滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能發(fā)揮調(diào)控作用。如圖7顯示，轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor后，ERK1/2及STAT3的磷酸化水平均不同程度增加。HTR-8/SVneo細(xì)胞中miR-125a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組中的ERK1/2和STAT3磷酸化比值為(0.904±0.071)、(0.903±0.018)，分別顯著高于CK組的(0.322±0.024)和(0.308±0.052)以及NC組的(0.338±0.024)和(0.332±0.054)(P<0.05)；JEG-3細(xì)胞中miR-125a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組中的ERK1/2和STAT3的磷酸化比值為(0.913±0.090)、(0.893±0.113)，分別顯著高于CK組的(0.271±0.020)和(0.348±0.091)以及NC組的(0.298±0.006)和(0.341±0.096)(P<0.05)。

A：不同條件下各蛋白的代表性Western blot條帶；B：不同條件下ERK1/2的磷酸化水平；C：不同條件下STAT3的磷酸化水平；與其他兩組比較，*P<0.05。圖7 miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細(xì)胞中ERK1/2-STAT3信號通路的影響

討 論

滋養(yǎng)層細(xì)胞是一類特殊的上皮細(xì)胞，具有強(qiáng)大的侵襲能力。妊娠過程中，滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮的侵襲過程類似腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移，但與腫瘤細(xì)胞不同，滋養(yǎng)層細(xì)胞的活動(dòng)同時(shí)受到刺激因子和抑制因子的調(diào)控而具有時(shí)空特異性和自限性。滋養(yǎng)層細(xì)胞自身、子宮上皮和基質(zhì)細(xì)胞、子宮自然殺傷細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生的各類因子均可調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的行為及功能，酪氨酸激酶JAK-STAT3、ERK1/2、Wnt等多條信號通路參與其中。各因素維持動(dòng)態(tài)平衡是保證滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)揮正常功能的關(guān)鍵[6-7]。滋養(yǎng)層細(xì)胞功能異常與胚胎著床失敗、自然流產(chǎn)、妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞疾病、子癇、胎兒宮內(nèi)生長受限等妊娠并發(fā)癥的發(fā)生相關(guān)。

人胎盤可不同程度地表達(dá)大量miRNAs，滋養(yǎng)層細(xì)胞是其主要來源[8-9]。使用miRNA陣列等高通量測序方法已在正常人類胎盤中鑒定出600多種miRNAs[10]。同樣，從胎盤分離的滋養(yǎng)層細(xì)胞中也檢測到762種miRNAs，其中大約一半明顯表達(dá)，部分特異性表達(dá)于人胎盤，且這些miRNAs的表達(dá)隨著妊娠時(shí)期的變化而改變[9]。miRNA在胎盤中的時(shí)間表達(dá)模式提示其在不同妊娠時(shí)期可能具有特定功能，并在妊娠的建立和維持中發(fā)揮重要作用。而正常妊娠和病理妊娠胎盤組織中miRNA的表達(dá)也不同。Hromadnikova等[11]的研究顯示，與正常妊娠胎盤相比，子癇前期和胎兒宮內(nèi)生長受限患者胎盤中miR-515-5p、miR-517-5p和miR-520a-5p等多種miRNA表達(dá)改變，提示miRNA可通過某些靶向基因調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞行為和功能，包括凋亡、遷移和侵襲等。例如子癇前期胎盤中高表達(dá)的miR-24-3p靶向作用于視黃醇結(jié)合蛋白4，抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲[12]。而另一些miRNAs則可能促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的活動(dòng)，在相關(guān)疾病中發(fā)揮相反作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-18b通過下調(diào)Notch2依賴的T細(xì)胞免疫球蛋白粘液素3/雷帕霉素復(fù)合物1通路，促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲，進(jìn)而有利于改善子癇前期狀態(tài)[13]。

miR-125a-3是miR-125a家族的成員，起源于pre-miR-125a的3′端。既往報(bào)道指出，miR-125a-3p通常在癌細(xì)胞中異常表達(dá)，對各種類型癌癥的發(fā)展具有不同的影響，可作為腫瘤診斷的標(biāo)志因子及治療靶點(diǎn)[14-15]。例如，miR-125a-3p在人乳頭狀甲狀腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平分別低于正常甲狀腺組織和正常甲狀腺細(xì)胞系，對于乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移具有顯著抑制作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞可表達(dá)miR-125a-3p，并且在不同滋養(yǎng)層細(xì)胞系中表達(dá)水平亦存在差異，提示miR-125a-3p的表達(dá)與滋養(yǎng)層細(xì)胞狀態(tài)及功能有關(guān)。我們的進(jìn)一步研究證實(shí)，miR-125a-3p對于滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、侵襲同樣具有抑制作用，同時(shí)可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡。此為對miR-125a-3p在滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)及作用的首次研究。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)yn可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的活動(dòng)。Fyn為非受體酪氨酸激酶Src家族中的一員，可表達(dá)于多種細(xì)胞的質(zhì)膜上，通過調(diào)控各類信號傳導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的分化、凋亡、運(yùn)動(dòng)和侵襲等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和免疫細(xì)胞的增殖分化中具有重要作用。值得注意的是，miR-125a-3p被證實(shí)可通過與Fyn mRNA 3′端的非翻譯區(qū)相結(jié)合直接抑制Fyn的表達(dá)和活性，miR-125a-3p對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控作用至少部分依賴于Fyn[17]。本研究中，轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor后，滋養(yǎng)層細(xì)胞中Fyn蛋白、mRNA表達(dá)及活性均顯著升高，這也證實(shí)在滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-125a-3p同樣對Fyn發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

ERK1/2信號通路主要參與細(xì)胞增殖活化、形態(tài)維持、骨架重建等，與滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能密切相關(guān)。最近的一項(xiàng)研究指出，ERK1/2通路參與調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲遷移活動(dòng)[18]。另有研究表明，在不同的刺激因子下，ERK1/2通路活化，STAT3隨即發(fā)生磷酸化，促進(jìn)JEG-3細(xì)胞的侵襲[19]。ERK1/2通路被抑制后，人滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo的增殖、侵襲能力和IFN-γ的分泌水平均下降[20]。本研究轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor后，滋養(yǎng)層細(xì)胞中ERK1/2和STAT3的磷酸化水平均顯著升高，提示在滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-125a-3p可抑制ERK1/2-STAT3信號通路的活化。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞中存在miR-125a-3p的表達(dá)，且其在絨癌細(xì)胞系中低表達(dá)，表達(dá)水平與滋養(yǎng)層細(xì)胞功能相關(guān)。通過對Fyn和ERK1/2-STAT3信號通路的抑制作用，miR-125a-3p可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)其凋亡，進(jìn)而在胚胎著床中發(fā)揮重要作用。對于臨床樣本及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究將在后續(xù)進(jìn)一步開展，并更深入探討調(diào)控機(jī)制。本研究有利于進(jìn)一步理解胚胎著床過程及滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能調(diào)控，并為胚胎著床失敗、自然流產(chǎn)、妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞疾病的防治提供理論參考。