陳通，程謙偉，韋紫玉，莫斯敏，楊奕鵬，祁興普*

（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006；2.江蘇農牧科技職業(yè)學院食品科技學院，江蘇 泰州 225300）

稻谷作為主要糧食作物，廣泛種植于世界各地[1]。中國稻作歷史悠久且產量逐年增加，為提高稻谷的食用品質，需要對其進行一系列加工處理從而保證大米產品質量，加工后的大米因失去谷殼保護，導致其所含營養(yǎng)物質（如蛋白質、脂類、碳水化合物等）外露，一旦溫濕度適宜，會形成天然的微生物培養(yǎng)基，使得大米在儲藏過程中極易出現質量安全問題，其中以霉菌侵染最為突出，尤其是在南方高溫高濕區(qū)域[2-3]。廣西地區(qū)作為我國傳統的稻米生產及儲備區(qū)，該區(qū)域氣候具有終年高濕、冬季短、夏季長等特點，為霉菌的自然生長繁殖提供了適宜的條件。這不僅嚴重影響廣大消費者的身體健康，同時也給國家糧食貯藏企業(yè)造成重大經濟損失，甚至可能破壞國家糧食供給平衡[4]。因此，針對大米霉變問題尤其是大米早期霉變的預警研究很有必要。

微生物在生長繁殖代謝過程中產生的揮發(fā)性有機化合物（microbial volatile organic compounds，mVOCs）多數屬于次級代謝產物，這些特征物質被認為能夠表征其生理活動狀態(tài)，因而在臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測中被廣泛應用，作為揭示微生物污染食品狀況的新型有效手段。大米霉變過程中自身營養(yǎng)物質被消耗，霉菌通過生理代謝產生了真菌毒素、抗生素等次級代謝產物，同時伴隨產生醇、醛、酮等復雜的揮發(fā)性氣味物質，這使得通過氣味物質變化快速判別大米是否霉變成為可能[5-6]。

當前，由霉變引起的大米品質劣變仍未得到有效控制。傳統霉變的評判方法主要采用感官評定法（如視覺、嗅覺等）[7]，但該方法難以判斷霉菌變化的具體情況，導致評判結果的準確性與重復性不佳。理化指標檢測法主要依賴于測定微生物菌落數、霉菌毒素等指標，常采用色譜及其聯用技術（如薄層色譜、高效液相色譜、液質聯用等）進行檢測，但該類方法需要進行樣品前處理、操作步驟繁雜耗時，且分析人員需要具備相應的專業(yè)知識背景，難以滿足實際應用檢測大米霉變情況的需求。

目前，針對mVOCs的常用分析檢測方法主要包括色譜法[8]、氣質聯用技術[9-10]、電子鼻技術[11]以及光譜技術等[12-14]，但是該類研究針對檢測范圍內的全部氣味物質進行解析，僅僅適用于霉變后期樣品的判別，且未能找出mVOCs表征霉變過程的標志性關鍵物質成分。此外，電子鼻技術中氣體傳感器的穩(wěn)定性、準確性、抗干擾性等指標還有待進一步提高；氣質聯用法仍面臨前述同樣問題。因此，有必要開發(fā)一種能夠快速、簡便、準確判斷大米霉變的新方法。

目前，氣相-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS） 技術在 mVOCs研究領域已展現出相當大的潛力，尤其在食品產地鑒別[15-16]、欺詐識別[17-18]、新鮮度檢測、品質評價與等級判別[19-20]等領域均有廣泛的應用，而基于GC-IMS技術涉及微生物研究與食品霉變分析雖已有相關報道[21-22]，但在微生物霉變氣味特征選取方法方面還有進一步開發(fā)。因此，本文以廣西特色香米為研究對象，研究引起霉變微生物生理活動產生的mVOCs信息，旨在為GCIMS檢測技術應用于大米早期霉變預警分析提供一種新思路，為大米及其相關食品、農產品的品質分析、貯藏保鮮等研究領域提供理論基礎和科學思路。

1 材料與方法

1.1 材料處理

香米樣品（31份）：市售，產自廣西；馬鈴薯（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g（切片，沸水煮30 min，8 層紗布過濾），葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，補水至體積1 L，121℃下滅菌20 min備用?；谇捌谝延醒芯縖23]，從自然霉變大米中分離篩選出6種主要霉菌，分別為黑曲霉、微紫青霉、變換青霉、繩狀青霉、黃曲霉、寄生曲霉（分別用字母A～F表示），分篩后的霉菌分別保存于PDA培養(yǎng)基斜面上，并于4℃條件下儲藏備用。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1112C型超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；E124S型電子分析天平：寧波萊福科技有限公司；ZXSD-R1430型生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；1H1-00053型FlavourSpec?GCIMS分析儀（配備CTC CombiPAL自動頂空進樣器）：德國G.A.S公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

培養(yǎng)基制備：將6種霉菌分別轉移至PDA培養(yǎng)基表面，并將其放置恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行活化，培養(yǎng)溫度 28℃，相對濕度（relative humidity，RH）80%，培養(yǎng)時間8 d，待霉菌活化完成后備用。

樣品制備：稱取10 g香米于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（35℃、90%RH）進行培養(yǎng)，每天觀察香米感官表象變化，當香米表面失去光澤、變黃，出現“起眼”、“起筋”現象并伴有明顯霉味時即停止培養(yǎng)，作為自然霉變香米備用。同時，以新鮮香米樣品作為對照，按相同條件測定其自身風味成分，用以后期對照篩選霉變微生物的特征氣味物質。

1.3.2 GC-IMS條件

待測樣品制備完畢后，準確量取5g樣品置于20mL頂空進樣瓶中，進行進樣檢測，頂空GC-IMS具體檢測條件見表1。

表1 霉菌GC-IMS檢測條件Table 1 Detection parameters of moulds using GC-IMS

1.4 數據處理

使用 GC-IMS Library Search（Version 1.0.3）軟件對圖譜中特征峰對應的mVOCs物質進行定性分析；采用LAV（Version 2.0.1）軟件進行二維數據可視化分析；采用MATLAB（Version R2009b）軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA） 以及 k 近鄰（k nearest neighbor，kNN）判別分析。

2 結果與分析

2.1 特征峰選取

圖1為6種霉菌接種PDA培養(yǎng)基的GC-IMS二維圖譜，圖2為所有香米樣品對應的GC-IMS圖譜按像素點位置計算得到的標準差圖譜，圖3為依據香米樣品標準差圖譜篩選得到的19個特征峰位置信息。

圖1 不同霉菌的GC-IMS圖譜Fig.1 GC-IMS map of different molds

圖2 香米樣品GC-IMS圖譜標準差Fig.2 Standard deviation of GC-IMS map of fragrant rice samples

圖3 19個特征峰選取位置Fig.3 19 Characteristic peak selection

由圖1可知，不同霉菌有共同的mVOCs物質產生，見圖1A中矩形標記區(qū)域；不同菌種產生的mVOCs圖譜存在一定的差異，如變幻青霉圖譜中矩陣標記區(qū)域（見圖1C），該位置對應的氣味物質成分在其他霉菌樣品中未出現；以所有樣本的GC-IMS二維圖譜為對象，計算二維圖譜每個像素點對應的標準差，以標準差值作為表征圖譜中特征峰的有無或強度差異變化。由圖2可知，標準差圖譜中的特征區(qū)域即可作為二維圖譜特征峰選擇的依據[24]；結合視覺觀察方法分析、篩選原始圖譜中霉變微生物產生的差異性或共有性mVOCs物質。由圖3可知，最終共篩選出19個特征峰區(qū)域用以表征霉變微生物的氣味特征。

2.2 霉變mVOCs分析

使用GC-IMS Library Search軟件對篩選出的特征峰進行mVOCs化合物信息檢索，去除已篩選特征峰中部分單體與二聚體對應同一種化合物外，19個特征峰最終共識別出16種揮發(fā)性氣味物質，其中1-辛烯-3-醇（標記編號 1、15）、正丁醇（標記編號 13、19）和 2-丁酮（標記編號17、18）3種物質均存在二聚體，其中前者編號為單體（Sp），后者為二聚體（Dp），具體識別出的mVOCs物質信息見表2。

表2 篩選出的特征峰對應的化合物信息Table 2 Compound information corresponding to the selected characteristic features

由表2可知，霉菌在生長代謝過程中主要產生醇類、酮類、醛類以及酯類等物質，其中6種霉菌產生的共有mVOCs物質有1-辛烯-3-醇、正戊醇、糠醇、苯乙醇、正丁醇、2，3-二丁酮、苯甲醛、2-甲基吡嗪以及葉醇，對應編號分別為 1、2、4、14、18、16、6、7、9；從特征離子峰響應信號數量級差異角度觀察發(fā)現，苯甲醛、2-甲基吡嗪和葉醇3種物質為微紫青霉和變幻青霉所產生；2，6-二甲基吡嗪則是變幻青霉所特有的氣味物質；結合mVOCs 2.0在線數據庫對比分析可知[25]，1-辛烯-3-醇和苯乙醇與譜庫檢索結果一致，為6種霉菌產生的共有代謝產物，其均通過游離氨基酸代謝而形成；其他mVOCs物質與譜庫檢索結果有所差異，如3種曲霉通過游離氨基酸代謝等途徑均可形成正戊醇、葉醇和丙醇等物質，但在黃曲霉樣品中葉醇物質對應的特征離子峰強度值為0.014，小于3倍的儀器噪聲值[26]，因此認定該物質并未被檢測出，同時，部分物質成分雖被檢測出，但未在mVOCs 2.0數據庫檢索到，這可能是由于數據庫建設所用設備的檢測限差異所導致。

2.3 判別分析

2.3.1 主成分判別分析

為驗證提取香米霉變mVOCs特征變量的有效性，以正常香米樣品與自然霉變樣品為研究對象進行GC-IMS檢測，并提取表2中篩選出的特征峰對應位置mVOCs的峰強度，并進行PCA分析，結果如圖4所示。

圖4 主成分得分圖分析Fig.4 Diagram of principal component score analysis

由圖4可知，經過PCA處理后，PC1和PC2的貢獻率分別為81.52%、11.75%，前2個主成分的累積貢獻率為93.27%，表明轉換后的數據能夠表征原始數據的絕大部分信息[27]；正常香米和自然霉變香米樣品在主成分得分圖中可明顯分為2個簇類，且其均有各自歸屬區(qū)域，這表明基于選取的特征變量區(qū)分霉變香米具有一定的可行性。

2.3.2 k近鄰判別分析

進一步采用kNN算法對其進行判別分析，并采用五次五折交叉驗證方法對判別模型的準確性進行評價，即將62個樣本數據分為5個樣本子集，每次取出其中1個子集作為驗證集，其余4個子集作為訓練集，以最終5個測試子集的平均識別率作為指標評判樣本的識別率，結果如表3所示。

表3 kNN模型的五次五折交叉驗證分類結果Table 3 Classification results of a five-repeated 5-fold cross validation of the kNN model

由表3可知，kNN在霉變香米判別中表現出優(yōu)秀的判別性能，五次五折交叉驗證中測試集識別率均高于90%以上，測試集樣品識別率平均值為95.25%，表明kNN判別模型的穩(wěn)定性和適用性。

3 結論

本研究借助GC-IMS技術對導致廣西香米霉變的主要霉菌的mVOCs成分進行了分析檢測，通過數理統計結合視覺觀察方法確定霉變香米微生物生理代謝過程中mVOCs的特征性成分，結合化學計量學方法實現了對正常大米和霉變大米的判別，并驗證了判別模型的穩(wěn)定性和適用性，證明了GC-IMS檢測分析技術結合化學計量學方法在大米霉變監(jiān)測中的可行性，后期可進一步結合其他分析方法研究香米霉變過程不同階段的關鍵性mVOCs，為大米早期霉變預警提供具有可行性新方法。