陳通，程謙偉，韋紫玉，莫斯敏，楊奕鵬，祁興普*

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院食品科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

稻谷作為主要糧食作物，廣泛種植于世界各地[1]。中國(guó)稻作歷史悠久且產(chǎn)量逐年增加，為提高稻谷的食用品質(zhì)，需要對(duì)其進(jìn)行一系列加工處理從而保證大米產(chǎn)品質(zhì)量，加工后的大米因失去谷殼保護(hù)，導(dǎo)致其所含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物等）外露，一旦溫濕度適宜，會(huì)形成天然的微生物培養(yǎng)基，使得大米在儲(chǔ)藏過程中極易出現(xiàn)質(zhì)量安全問題，其中以霉菌侵染最為突出，尤其是在南方高溫高濕區(qū)域[2-3]。廣西地區(qū)作為我國(guó)傳統(tǒng)的稻米生產(chǎn)及儲(chǔ)備區(qū)，該區(qū)域氣候具有終年高濕、冬季短、夏季長(zhǎng)等特點(diǎn)，為霉菌的自然生長(zhǎng)繁殖提供了適宜的條件。這不僅嚴(yán)重影響廣大消費(fèi)者的身體健康，同時(shí)也給國(guó)家糧食貯藏企業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，甚至可能破壞國(guó)家糧食供給平衡[4]。因此，針對(duì)大米霉變問題尤其是大米早期霉變的預(yù)警研究很有必要。

微生物在生長(zhǎng)繁殖代謝過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物（microbial volatile organic compounds，mVOCs）多數(shù)屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些特征物質(zhì)被認(rèn)為能夠表征其生理活動(dòng)狀態(tài)，因而在臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)中被廣泛應(yīng)用，作為揭示微生物污染食品狀況的新型有效手段。大米霉變過程中自身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，霉菌通過生理代謝產(chǎn)生了真菌毒素、抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物，同時(shí)伴隨產(chǎn)生醇、醛、酮等復(fù)雜的揮發(fā)性氣味物質(zhì)，這使得通過氣味物質(zhì)變化快速判別大米是否霉變成為可能[5-6]。

當(dāng)前，由霉變引起的大米品質(zhì)劣變?nèi)晕吹玫接行Э刂?。傳統(tǒng)霉變的評(píng)判方法主要采用感官評(píng)定法（如視覺、嗅覺等）[7]，但該方法難以判斷霉菌變化的具體情況，導(dǎo)致評(píng)判結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性不佳。理化指標(biāo)檢測(cè)法主要依賴于測(cè)定微生物菌落數(shù)、霉菌毒素等指標(biāo)，常采用色譜及其聯(lián)用技術(shù)（如薄層色譜、高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用等）進(jìn)行檢測(cè)，但該類方法需要進(jìn)行樣品前處理、操作步驟繁雜耗時(shí)，且分析人員需要具備相應(yīng)的專業(yè)知識(shí)背景，難以滿足實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)大米霉變情況的需求。

目前，針對(duì)mVOCs的常用分析檢測(cè)方法主要包括色譜法[8]、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[9-10]、電子鼻技術(shù)[11]以及光譜技術(shù)等[12-14]，但是該類研究針對(duì)檢測(cè)范圍內(nèi)的全部氣味物質(zhì)進(jìn)行解析，僅僅適用于霉變后期樣品的判別，且未能找出mVOCs表征霉變過程的標(biāo)志性關(guān)鍵物質(zhì)成分。此外，電子鼻技術(shù)中氣體傳感器的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、抗干擾性等指標(biāo)還有待進(jìn)一步提高；氣質(zhì)聯(lián)用法仍面臨前述同樣問題。因此，有必要開發(fā)一種能夠快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確判斷大米霉變的新方法。

目前，氣相-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS） 技術(shù)在 mVOCs研究領(lǐng)域已展現(xiàn)出相當(dāng)大的潛力，尤其在食品產(chǎn)地鑒別[15-16]、欺詐識(shí)別[17-18]、新鮮度檢測(cè)、品質(zhì)評(píng)價(jià)與等級(jí)判別[19-20]等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用，而基于GC-IMS技術(shù)涉及微生物研究與食品霉變分析雖已有相關(guān)報(bào)道[21-22]，但在微生物霉變氣味特征選取方法方面還有進(jìn)一步開發(fā)。因此，本文以廣西特色香米為研究對(duì)象，研究引起霉變微生物生理活動(dòng)產(chǎn)生的mVOCs信息，旨在為GCIMS檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于大米早期霉變預(yù)警分析提供一種新思路，為大米及其相關(guān)食品、農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)分析、貯藏保鮮等研究領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)思路。

1 材料與方法

1.1 材料處理

香米樣品（31份）：市售，產(chǎn)自廣西；馬鈴薯（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g（切片，沸水煮30 min，8 層紗布過濾），葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，補(bǔ)水至體積1 L，121℃下滅菌20 min備用?；谇捌谝延醒芯縖23]，從自然霉變大米中分離篩選出6種主要霉菌，分別為黑曲霉、微紫青霉、變換青霉、繩狀青霉、黃曲霉、寄生曲霉（分別用字母A～F表示），分篩后的霉菌分別保存于PDA培養(yǎng)基斜面上，并于4℃條件下儲(chǔ)藏備用。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1112C型超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司；E124S型電子分析天平：寧波萊福科技有限公司；ZXSD-R1430型生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；1H1-00053型FlavourSpec?GCIMS分析儀（配備CTC CombiPAL自動(dòng)頂空進(jìn)樣器）：德國(guó)G.A.S公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

培養(yǎng)基制備：將6種霉菌分別轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基表面，并將其放置恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行活化，培養(yǎng)溫度 28℃，相對(duì)濕度（relative humidity，RH）80%，培養(yǎng)時(shí)間8 d，待霉菌活化完成后備用。

樣品制備：稱取10 g香米于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（35℃、90%RH）進(jìn)行培養(yǎng)，每天觀察香米感官表象變化，當(dāng)香米表面失去光澤、變黃，出現(xiàn)“起眼”、“起筋”現(xiàn)象并伴有明顯霉味時(shí)即停止培養(yǎng)，作為自然霉變香米備用。同時(shí)，以新鮮香米樣品作為對(duì)照，按相同條件測(cè)定其自身風(fēng)味成分，用以后期對(duì)照篩選霉變微生物的特征氣味物質(zhì)。

1.3.2 GC-IMS條件

待測(cè)樣品制備完畢后，準(zhǔn)確量取5g樣品置于20mL頂空進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，頂空GC-IMS具體檢測(cè)條件見表1。

表1 霉菌GC-IMS檢測(cè)條件Table 1 Detection parameters of moulds using GC-IMS

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用 GC-IMS Library Search（Version 1.0.3）軟件對(duì)圖譜中特征峰對(duì)應(yīng)的mVOCs物質(zhì)進(jìn)行定性分析；采用LAV（Version 2.0.1）軟件進(jìn)行二維數(shù)據(jù)可視化分析；采用MATLAB（Version R2009b）軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA） 以及 k 近鄰（k nearest neighbor，kNN）判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征峰選取

圖1為6種霉菌接種PDA培養(yǎng)基的GC-IMS二維圖譜，圖2為所有香米樣品對(duì)應(yīng)的GC-IMS圖譜按像素點(diǎn)位置計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)差圖譜，圖3為依據(jù)香米樣品標(biāo)準(zhǔn)差圖譜篩選得到的19個(gè)特征峰位置信息。

圖1 不同霉菌的GC-IMS圖譜Fig.1 GC-IMS map of different molds

圖2 香米樣品GC-IMS圖譜標(biāo)準(zhǔn)差Fig.2 Standard deviation of GC-IMS map of fragrant rice samples

圖3 19個(gè)特征峰選取位置Fig.3 19 Characteristic peak selection

由圖1可知，不同霉菌有共同的mVOCs物質(zhì)產(chǎn)生，見圖1A中矩形標(biāo)記區(qū)域；不同菌種產(chǎn)生的mVOCs圖譜存在一定的差異，如變幻青霉圖譜中矩陣標(biāo)記區(qū)域（見圖1C），該位置對(duì)應(yīng)的氣味物質(zhì)成分在其他霉菌樣品中未出現(xiàn)；以所有樣本的GC-IMS二維圖譜為對(duì)象，計(jì)算二維圖譜每個(gè)像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差，以標(biāo)準(zhǔn)差值作為表征圖譜中特征峰的有無或強(qiáng)度差異變化。由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)差圖譜中的特征區(qū)域即可作為二維圖譜特征峰選擇的依據(jù)[24]；結(jié)合視覺觀察方法分析、篩選原始圖譜中霉變微生物產(chǎn)生的差異性或共有性mVOCs物質(zhì)。由圖3可知，最終共篩選出19個(gè)特征峰區(qū)域用以表征霉變微生物的氣味特征。

2.2 霉變mVOCs分析

使用GC-IMS Library Search軟件對(duì)篩選出的特征峰進(jìn)行mVOCs化合物信息檢索，去除已篩選特征峰中部分單體與二聚體對(duì)應(yīng)同一種化合物外，19個(gè)特征峰最終共識(shí)別出16種揮發(fā)性氣味物質(zhì)，其中1-辛烯-3-醇（標(biāo)記編號(hào) 1、15）、正丁醇（標(biāo)記編號(hào) 13、19）和 2-丁酮（標(biāo)記編號(hào)17、18）3種物質(zhì)均存在二聚體，其中前者編號(hào)為單體（Sp），后者為二聚體（Dp），具體識(shí)別出的mVOCs物質(zhì)信息見表2。

表2 篩選出的特征峰對(duì)應(yīng)的化合物信息Table 2 Compound information corresponding to the selected characteristic features

由表2可知，霉菌在生長(zhǎng)代謝過程中主要產(chǎn)生醇類、酮類、醛類以及酯類等物質(zhì)，其中6種霉菌產(chǎn)生的共有mVOCs物質(zhì)有1-辛烯-3-醇、正戊醇、糠醇、苯乙醇、正丁醇、2，3-二丁酮、苯甲醛、2-甲基吡嗪以及葉醇，對(duì)應(yīng)編號(hào)分別為 1、2、4、14、18、16、6、7、9；從特征離子峰響應(yīng)信號(hào)數(shù)量級(jí)差異角度觀察發(fā)現(xiàn)，苯甲醛、2-甲基吡嗪和葉醇3種物質(zhì)為微紫青霉和變幻青霉所產(chǎn)生；2，6-二甲基吡嗪則是變幻青霉所特有的氣味物質(zhì)；結(jié)合mVOCs 2.0在線數(shù)據(jù)庫對(duì)比分析可知[25]，1-辛烯-3-醇和苯乙醇與譜庫檢索結(jié)果一致，為6種霉菌產(chǎn)生的共有代謝產(chǎn)物，其均通過游離氨基酸代謝而形成；其他mVOCs物質(zhì)與譜庫檢索結(jié)果有所差異，如3種曲霉通過游離氨基酸代謝等途徑均可形成正戊醇、葉醇和丙醇等物質(zhì)，但在黃曲霉樣品中葉醇物質(zhì)對(duì)應(yīng)的特征離子峰強(qiáng)度值為0.014，小于3倍的儀器噪聲值[26]，因此認(rèn)定該物質(zhì)并未被檢測(cè)出，同時(shí)，部分物質(zhì)成分雖被檢測(cè)出，但未在mVOCs 2.0數(shù)據(jù)庫檢索到，這可能是由于數(shù)據(jù)庫建設(shè)所用設(shè)備的檢測(cè)限差異所導(dǎo)致。

2.3 判別分析

2.3.1 主成分判別分析

為驗(yàn)證提取香米霉變mVOCs特征變量的有效性，以正常香米樣品與自然霉變樣品為研究對(duì)象進(jìn)行GC-IMS檢測(cè)，并提取表2中篩選出的特征峰對(duì)應(yīng)位置mVOCs的峰強(qiáng)度，并進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 主成分得分圖分析Fig.4 Diagram of principal component score analysis

由圖4可知，經(jīng)過PCA處理后，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為81.52%、11.75%，前2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為93.27%，表明轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)能夠表征原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息[27]；正常香米和自然霉變香米樣品在主成分得分圖中可明顯分為2個(gè)簇類，且其均有各自歸屬區(qū)域，這表明基于選取的特征變量區(qū)分霉變香米具有一定的可行性。

2.3.2 k近鄰判別分析

進(jìn)一步采用kNN算法對(duì)其進(jìn)行判別分析，并采用五次五折交叉驗(yàn)證方法對(duì)判別模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)，即將62個(gè)樣本數(shù)據(jù)分為5個(gè)樣本子集，每次取出其中1個(gè)子集作為驗(yàn)證集，其余4個(gè)子集作為訓(xùn)練集，以最終5個(gè)測(cè)試子集的平均識(shí)別率作為指標(biāo)評(píng)判樣本的識(shí)別率，結(jié)果如表3所示。

表3 kNN模型的五次五折交叉驗(yàn)證分類結(jié)果Table 3 Classification results of a five-repeated 5-fold cross validation of the kNN model

由表3可知，kNN在霉變香米判別中表現(xiàn)出優(yōu)秀的判別性能，五次五折交叉驗(yàn)證中測(cè)試集識(shí)別率均高于90%以上，測(cè)試集樣品識(shí)別率平均值為95.25%，表明kNN判別模型的穩(wěn)定性和適用性。

3 結(jié)論

本研究借助GC-IMS技術(shù)對(duì)導(dǎo)致廣西香米霉變的主要霉菌的mVOCs成分進(jìn)行了分析檢測(cè)，通過數(shù)理統(tǒng)計(jì)結(jié)合視覺觀察方法確定霉變香米微生物生理代謝過程中mVOCs的特征性成分，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)正常大米和霉變大米的判別，并驗(yàn)證了判別模型的穩(wěn)定性和適用性，證明了GC-IMS檢測(cè)分析技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法在大米霉變監(jiān)測(cè)中的可行性，后期可進(jìn)一步結(jié)合其他分析方法研究香米霉變過程不同階段的關(guān)鍵性mVOCs，為大米早期霉變預(yù)警提供具有可行性新方法。