李文宇，王茜，沈靜，劉夢(mèng)文，賀詩(shī)茹，阿依努爾·白克熱，肖輝

（新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000）

香梨，別名快果、果宗、大頭梨，是薔薇科蘋(píng)果亞科梨屬植物。香梨具有皮薄味甜、渣少肉細(xì)等特點(diǎn)[1]，一般在每年的9月中旬成熟[2]。香梨種植歷史悠久，已有1400余年[3]，且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含果糖、維生素、礦物質(zhì)、蘋(píng)果酸等營(yíng)養(yǎng)成分，具有清熱潤(rùn)肺、消炎解毒等功效[4]。作為我國(guó)獨(dú)有特色水果，香梨既可鮮食又可藥用，是生活中常見(jiàn)的藥食同源類食材[5]，其中多糖類化合物和黃酮類化合物被證實(shí)為梨果肉中的有效成分[6-7]，廣泛存在于梨果實(shí)[8]、鐵皮石斛[9]、秋葵[10]、丹參[11]、銀杏[12]、枇杷[13]等植物中?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，梨具有抗氧化[14]、抗?jié)僛15]、抗癌[16]、免疫調(diào)節(jié)[17]、鎮(zhèn)咳祛痰平喘[18]等功效。

近年來(lái)，對(duì)食品中多糖成分開(kāi)發(fā)在功能性食品界有著廣闊的研究前景[19]。新疆的香梨僅2020年產(chǎn)量就高達(dá)154.47萬(wàn)t[20]，所以有著巨大的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值。因此本研究通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)行香梨多糖提取條件的優(yōu)化試驗(yàn)，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出香梨多糖的最優(yōu)提取條件，并比較了不同地區(qū)香梨多糖含量以及提取率的差異，以期補(bǔ)充新疆地產(chǎn)食物植物化學(xué)物標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，為新疆香梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供數(shù)據(jù)支撐和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

11種香梨樣品分別來(lái)自于庫(kù)爾勒市哈拉蘇、庫(kù)爾勒市區(qū)、庫(kù)爾勒市沙依東、和田市皮山、阿克蘇市沙雅、和田市區(qū)、庫(kù)車市區(qū)、喀什市莎車、喀什市葉城、喀什市巴楚、阿克蘇市區(qū)，每個(gè)樣品采購(gòu)3 kg。

無(wú)水乙醇（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；苯酚溶液（分析純）：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；硫酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DZ-2BC11真空干燥箱：天津市斯泰特儀器有限公司；IDH30多功能超聲波清洗機(jī)：德國(guó)IRM/ci有限公司；5430R離心機(jī)：德國(guó)eppendorf有限公司；UV2600紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香梨多糖的提取

1.3.1.1 香梨預(yù)處理

將香梨洗凈后去蒂去核切塊，放入破壁機(jī)勻漿，勻漿后裝入樣品瓶放置于超低溫冰箱。

1.3.1.2 香梨粗多糖提取工藝

10 g樣品→超聲波輔助提取→離心（5 000 r/min，10 min）→殘?jiān)貜?fù)提取兩次→離心（5 000 r/min，10 min）→合并濾液→濃縮→乙醇醇沉→-4℃冰箱靜置過(guò)夜→離心（5 000 r/min，10 min）→棄上清液取其沉淀→香梨粗多糖→真空干燥箱干燥→粗多糖粉末。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用苯酚-硫酸比色法[21]測(cè)定香梨多糖提取液的濃度，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立參考國(guó)標(biāo)SN/T4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定》。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取0.010 0 g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用純水定容至100 mL，置于渦旋振蕩器振蕩混合均勻后得到100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液放于4℃冰箱中儲(chǔ)存。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于20 mL具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)充至1.0mL。向溶液中加入5%苯酚溶液1mL，然后快速加入5.0 mL濃硫酸，靜置10 min，使用渦旋振蕩器將試管中的液體充分混合后置于30℃恒溫水浴鍋水浴20 min，在最大吸收波長(zhǎng)486 nm處測(cè)吸光度。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為y=0.010 2x+0.019 1，R2=0.998 8。該方程在葡萄糖質(zhì)量0～100 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.3.3 香梨多糖提取率的測(cè)定

吸取香梨粗多糖溶液1 mL，將其稀釋到一定體積。按照1.3.2步驟進(jìn)行操作，于486 nm處測(cè)量其吸光值。香梨多糖提取率計(jì)算公式[22]如下。

1.3.4 超聲波輔助提取香梨多糖的單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 液料比對(duì)香梨多糖提取率的影響

分別稱取10 g香梨樣品于5個(gè)錐形瓶中，設(shè)置液料比 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1（mL/g）5 個(gè)水平。設(shè)定超聲時(shí)間50 min、超聲溫度50℃、乙醇濃度85%，考察液料比對(duì)香梨多糖提取率的影響。

1.3.4.2 超聲時(shí)間對(duì)香梨多糖提取率的影響

分別稱取10 g香梨樣品于5個(gè)錐形瓶中，設(shè)置超聲時(shí)間 30、40、50、60、70 min 5 個(gè)水平。設(shè)定液料比3∶1（mL/g）、超聲溫度 50 ℃、乙醇濃度 85%，考察超聲時(shí)間對(duì)香梨多糖提取率的影響。

1.3.4.3 超聲溫度對(duì)香梨多糖提取率的影響

分別稱取10 g香梨樣品于5個(gè)錐形瓶中，設(shè)置超聲溫度 30、40、50、60、70 ℃ 5 個(gè)水平。設(shè)定液料比3∶1（mL/g）、超聲時(shí)間 50 min、乙醇濃度 85%，考察超聲溫度對(duì)香梨多糖提取率的影響。

1.3.4.4 乙醇濃度對(duì)香梨多糖提取率的影響

分別稱取10 g香梨樣品于5個(gè)錐形瓶中，設(shè)置乙醇濃度75%、80%、85%、90%、95%5個(gè)水平。設(shè)定液料比 3∶1（mL/g）、超聲時(shí)間 50 min、超聲溫度 50 ℃，考察乙醇濃度對(duì)香梨多糖提取率的影響。

1.3.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用design expert軟件中Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)值為香梨多糖提取率（Y），以液料比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）、乙醇濃度（D）為因素進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016和Design Expert軟件進(jìn)行圖表繪制和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 液料比香梨多糖提取率的影響

液料比對(duì)香梨多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on yield of polysaccharides

由圖 1 可知，液料比為 1∶1（mL/g）～5∶1（mL/g）時(shí)，香梨多糖的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在液料比4∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大值3.27%。這與溶劑添加量有關(guān)，由于溶劑較少，溶液稠密且黏性大，溶解能力達(dá)到飽和[23]。此外，溶液濃度過(guò)高，多糖易在超聲、過(guò)濾、離心、烘干等環(huán)節(jié)中有所損失，導(dǎo)致提取率較低；隨著溶劑的增多，溶劑與香梨樣品接觸面積增大，且超聲的空化效應(yīng)和振動(dòng)效果，使得溶出的多糖增加[24]。當(dāng)液料比超過(guò)4∶1（mL/g）時(shí)，提取率略有下降可能是由于隨著溶劑量逐漸增加，原料被過(guò)度稀釋使多糖更易被水解，從而導(dǎo)致多糖提取率下降[25]。因此，選擇液料比為 3∶1、4∶1、5∶1（mL/g）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)香梨多糖提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)香梨多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of polysaccharides

由圖2可知，超聲時(shí)間為30 min～70 min時(shí)，香梨多糖的提取率隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在超聲時(shí)間60 min時(shí)達(dá)到最大值3.23%。在30 min～60 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率隨之增大，這可能是由于在超聲作用下多糖不斷析出使提取率升高[26]。而當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)60 min后，多糖得率下降，這可能是由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)致使提取液中的多糖被分解[27]。因此，選擇超聲時(shí)間50、60、70 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 超聲溫度對(duì)香梨多糖提取率的影響

超聲溫度對(duì)香梨多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on yield of polysaccharides

由圖3可知，超聲溫度為30℃～70℃時(shí)，香梨多糖提取率隨著超聲溫度升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在超聲溫度60℃時(shí)達(dá)到最大值3.15%。當(dāng)溫度較低時(shí)，溶液中物質(zhì)之間的分子運(yùn)動(dòng)較慢，而在30℃～60℃時(shí)，隨著溫度升高，物質(zhì)之間的分子運(yùn)動(dòng)加快，有利于多糖的溶出和分散，使得多糖在水中的溶解度不斷提高[28]。當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，可能由于高溫破壞多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖的提取率下降[29]。因此，選擇超聲溫度50、60、70℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 乙醇濃度對(duì)香梨多糖提取率的影響

乙醇濃度對(duì)香梨多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 乙醇濃度對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on yield of polysaccharides

由圖4可知，乙醇濃度為75%～95%時(shí)，香梨多糖提取率隨著乙醇濃度增大呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，在乙醇濃度為95%時(shí)達(dá)到最大值3.37%。這可能是因?yàn)樵诖汲吝^(guò)程，隨著乙醇濃度的提高，乙醇對(duì)多糖的醇沉能力逐漸增強(qiáng)，從而使多糖的提取率不斷提高，但考慮到試驗(yàn)過(guò)程中隨著乙醇濃度的提高，乙醇消耗量也隨之增加且乙醇濃度已達(dá)到較高水平，故不再設(shè)置更高乙醇濃度。因此，選擇乙醇濃度85%、90%、95%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)

Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

用Design Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析從而得出回歸方程：Y=3.23+0.093 3A+0.045 8B+0.003 3C+0.182 5D-0.057 5AB+0.032 5AC+0.105 0AD+0.022 5BC+0.057 5BD-0.020 0CD-0.260 8A2-0.242 1B2-0.128 3C2+0.022 9D2。

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的顯著性檢驗(yàn)

回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

由表 3 可知，模型 F=40.8，P＜0.000 1，失擬項(xiàng)（P=0.160 9＞0.05）不顯著，說(shuō)明該模型擬合程度較好，可以用其進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。液料比、超聲時(shí)間與乙醇濃度對(duì)香梨多糖的提取率有極顯著影響；AB、BD對(duì)香梨多糖提取率的影響顯著（P＜0.05）；AD、A2、B2、C2對(duì)香梨多糖提取率的影響極顯著（P＜0.01）。R2=0.976 1，表明該模型可以解釋97.61%的響應(yīng)值變化，R2adj=0.952 2，表明該模型具有較好的線性擬合。以上結(jié)果均表明回歸模型可信度高，可以對(duì)香梨多糖提取率進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)和分析。

根據(jù)F值可知，4個(gè)因素對(duì)香梨多糖提取率影響的先后順序?yàn)椋篋（乙醇濃度）＞A（液料比）＞B（超聲時(shí)間）＞C（超聲溫度）。

2.2.3 響應(yīng)面分析

通過(guò)Design expert軟件得到的三維曲面圖和等高線圖可以很好地反映出兩因素之間的交互作用對(duì)香梨多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5～圖7。

圖5 液料比與超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.5 Effect of liquid-to-material ratio and ultrasonic time on polysaccharide yield

圖6 液料比與乙醇濃度對(duì)多糖提取率的影響Fig.6 Effect of liquid-to-material ratio and ethanol concentration on polysaccharide yield

圖7 超聲時(shí)間與乙醇濃度對(duì)多糖提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time and ethanol concentration on polysaccharide yield

由圖5可知，當(dāng)A（液料比）確定時(shí)，多糖的提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)B（超聲時(shí)間）確定時(shí)，多糖的提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，等高線呈橢圓形，響應(yīng)曲面坡度較陡峭，這說(shuō)明A（液料比）和B（超聲時(shí)間）之間的交互作用對(duì)香梨多糖得率有顯著影響，這與表3回歸模型方差分析結(jié)果一致。

由圖6可知，A（液料比）確定時(shí)，多糖的提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)D（乙醇濃度）確定時(shí)，多糖的提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，等高線呈橢圓形。表明A（液料比）和D（乙醇濃度）之間的交互作用對(duì)香梨多糖得率作用極顯著，這與表3回歸模型方差分析結(jié)果一致。

由圖7可知，當(dāng)B（超聲時(shí)間）確定時(shí)，多糖的提取率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，當(dāng)D（乙醇濃度）確定時(shí)，多糖的提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，等高線呈橢圓形。表明B（超聲時(shí)間）和D（乙醇濃度）之間的交互作用對(duì)香梨多糖得率有顯著影響，這與表3回歸模型方差分析結(jié)果一致。

2.2.4 最優(yōu)工藝和驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design expert軟件擬合得出最優(yōu)的提取條件為液料比 3.777∶1（mL/g）、超聲時(shí)間 53.416 min、超聲溫度47.581℃、乙醇濃度95%。考慮到實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況和可行性，最終將香梨多糖的最優(yōu)提取條件調(diào)整為液料比 4∶1（mL/g）、超聲時(shí)間 53 min、超聲溫度 48 ℃、乙醇濃度95%。通過(guò)該條件得出香梨多糖提取率為3.45%，該值與預(yù)測(cè)值（3.48%）的相對(duì)誤差為0.97%，驗(yàn)證了提取工藝參數(shù)的可靠性。

2.3 11處采樣點(diǎn)多糖提取率

根據(jù)1.3.3中公式依次代入多糖質(zhì)量、稀釋倍數(shù)和樣品質(zhì)量，每個(gè)采樣點(diǎn)做3個(gè)平行樣取均值，得出11處采樣點(diǎn)多糖的提取率見(jiàn)表4。

表4 11處采樣點(diǎn)香梨多糖提取率Table 4 Yield of polysaccharide from fragrant pears at 11 sampling sites

由表4可知，11處采樣點(diǎn)多糖提取率排序依次為庫(kù)爾勒市哈拉蘇＞庫(kù)爾勒市區(qū)＞庫(kù)爾勒市沙依東＞和田市皮山＞喀什市巴楚＞阿克蘇市沙雅＞庫(kù)車市區(qū)＞喀什市葉城＞和田市區(qū)＞阿克蘇市區(qū)＞喀什市莎車。

3 結(jié)論

本研究采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，考察液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度、乙醇濃度4個(gè)單因素對(duì)香梨多糖提取率的影響，得出香梨多糖最優(yōu)提取條件：液料比 4∶1（mL/g）、超聲時(shí)間 53 min、超聲溫度 48 ℃、乙醇濃度95%，此條件下香梨多糖提取率為3.45%。在最優(yōu)工藝條件下，新疆11個(gè)采樣點(diǎn)香梨多糖提取率順序依次為庫(kù)爾勒市哈拉蘇＞庫(kù)爾勒市區(qū)＞庫(kù)爾勒市沙依東＞和田市皮山＞喀什市巴楚＞阿克蘇市沙雅＞庫(kù)車市區(qū)＞喀什市葉城＞和田市區(qū)＞阿克蘇市區(qū)＞喀什市莎車。本研究補(bǔ)充了新疆地產(chǎn)食物植物化學(xué)物標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，有利于為新疆香梨的開(kāi)發(fā)與利用提供一定的數(shù)據(jù)支撐和參考。