朱文軒，錢亮亮，程同杰，胡志娟，唐倩，韓秀，孫穎穎*

（1.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222005；2.連云港市質(zhì)量技術綜合檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222005）

類菌孢素氨基酸（mycosporine-like amino acids，MAAs）是以氨基環(huán)己烯酮或氨基環(huán)己烯胺為其骨架的環(huán)狀結構，通過不同種類的氨基酸縮合而成[1]。MAAs廣泛存在于藻類、浮游植物及微生物中[2]，在310 nm～360 nm的紫外光區(qū)具有強的吸收特性[3-4]。研究表明，MAAs還具有抗氧化等多種生理活性[1，4-5]。

大型海藻是MAAs的理想來源之一，已引起研究者們的廣泛關注[6-9]。研究表明，MAAs存在于所有大型紅藻和大型褐藻中[10]。目前，大型海藻MAAs研究多集中在MAAs的分布[11-14]、活性[15-17]以及環(huán)境因子對其積累和誘導[4，9，13]等其它[4，11，18，19]方面。已有的 MAAs 提取和分離純化研究主要集中在 Bangia atropurpurea[5]、Bostrychia scorpioides[7]、Nostoc flagelliforme[20]、海 蘿（Gloiopeltis furcata）[21-22]、江 蘺（Gracilaria chilensis）[23]、壇紫菜（Porphyra haitanensis）[24]、紫菜（Porphyra sp.）[25]等大型紅藻中，而國內(nèi)外大型褐藻MAAs研究很少。本實驗室前期研究指出，570多種含有MAAs的大型海藻中大型褐藻數(shù)量不超過50種[11]。目前，僅在Desmarestia menziesii[12]、Padina crassa[12]和其他大型褐藻[13]中發(fā)現(xiàn)了MAAs，很多大型褐藻MAAs并未被探明。此外，除了 shinorine、porphyra-334、palythine、palythinol、asterina-330和mycosporine-glycine等常見MAAs外，大型褐藻還含有很多未知MAAs[10-15]。因此，非常有必要對大型褐藻MAAs開展研究，以填補國內(nèi)外相應領域的研究空白，并可能獲得新的MAAs。

基于上述，選定羊棲菜（Hizikia fusifarme）、海帶（Laminaria japonica）、馬尾藻（Sargassum sp.）和裙帶菜（Undaria pinnatifida）4種大型褐藻，通過單因素和正交試驗，研究液料比、提取時間、次數(shù)和溫度對MAAs得率的影響，獲得4種大型褐藻MAAs適宜提取工藝。進一步，采用紫外波長掃描、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和質(zhì)譜（mass spectrum，MS）測定，并參照已有文獻報道，鑒定它們中的 MAAs，即 palythine、palythenic acid、porphyra-334 和shinorine。其中，palythenic acid目前僅在大型紅藻Solieria chordalis中發(fā)現(xiàn)[26]，該類菌胞素氨基酸單體化合物（mycosporine-like amino acid，MAA）在浮游植物和微藻中較為常見。目前，國內(nèi)外尚未見馬尾藻提取工藝和4種大型褐藻MAAs鑒定研究，本文為大型褐藻MAAs的研究提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜、海帶、馬尾藻、裙帶菜：江蘇碧藍海洋生物科技有限公司，經(jīng)清洗、冷凍干燥、粉碎后，備用。

甲醇、甲酸（色譜純）：北京迪科馬科技有限公司；無水乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；硅膠板：青島海洋化工廠分廠；碘化鉍鉀：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Cubis II電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DXF-4D搖擺式粉碎機：廣州大祥電子機械設備有限公司；FL-12770風冷商用冷柜：博興縣愛德信商用廚具有限公司；BUCHIR R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHIR公司；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵：臨海市永昊真空設備有限公司；Millipore MIlli-Q超純水系統(tǒng)：美國密理博公司；DKZ-2電熱恒溫振蕩水槽：上海精宏實驗設備有限公司；LGJ-10FD冷凍干燥機：北京松源華興生物技術有限公司；T9CS雙光束紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；1260高效液相色譜儀、Eclipse Plus C18色譜柱：美國安捷倫科技公司；HS-F1613臺式超速冷凍離心機、TSQ Quantum Access型液質(zhì)聯(lián)用儀：賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 大型褐藻MAAs的提取

稱取大型褐藻干粉末10 g，加入250 mL濃度25%的甲醇水溶液，45℃振蕩提取2 h，以8 000 r/min常溫離心20 min。重新加入相同體積的25%甲醇溶液，按照上述條件重復浸提1次～2次。上清液合并、減壓蒸發(fā)后（除去甲醇），加入4倍體積無水乙醇，放在-18℃冰箱中靜置6 h。低溫離心20 min或直接抽濾，上清液或濾液40℃下減壓蒸發(fā)，濃縮液冷凍干燥，即得MAAs提取物。MAAs得率按以下公式進行計算。

式中：R為MAAs得率，%；m1為初始提取的MAAs質(zhì)量，g；m2為大型褐藻干粉末質(zhì)量，g。

根據(jù)文獻報道的MAAs摩爾消光系數(shù)ε[2]及計算方法[5]，得到4種大型褐藻MAAs提取物中MAA含量的計算公式如下。

式中：X為MAA含量，mg；A為特征吸收波長下的吸光度；M 為分子質(zhì)量（shinorine，332；palythine，244；porphyra-334，346；palythenic acid，328）；ε 為 MAAs摩爾消光系數(shù) （shinorine，43 700；palythine，35 500；porphyra-334，42 300；palythenic acid，29 200）。

1.3.2 單因素試驗

在提取過程中，根據(jù)表1設定的因素水平，依次分析液料比、提取時間、提取溫度和提取次數(shù)對4種大型褐藻MAAs得率的影響，每個試驗設定3個平行樣。在考察提取溫度單因素試驗中，提取時間、提取次數(shù)和液料比設定為2 h、2次和20 mL/g；在考察液料比單因素試驗中，提取溫度、提取時間和提取次數(shù)設定為45℃、2h和2次；在考察提取時間單因素試驗中，提取溫度、提取次數(shù)和液料比設定為45℃、2次和20 mL/g；在考察提取次數(shù)單因素試驗中，提取溫度、提取時間和液料比設定為和液料比設定為45℃、2 h和20 mL/g。單因素試驗因素與水平見表1。

表1 單因素試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of single factor tests

1.3.3 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，采用L9（34）正交試驗設計，以MAAs得率為指標，進一步分析提取溫度（A）、液料比（B）和提取時間（C）3個因素對4種大型褐藻MAAs提取的影響（因素水平見表2），試驗過程中不設定平行樣。

表2 正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests

1.3.4 MAAs檢測

1.3.4.1 紫外波長掃描

稱取大型褐藻MAAs提取物0.1 g溶解于1 mL水中，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾后，在紫外-可見分光光度計進行200 nm～400 nm波長掃描，確定MAAs提取物特征吸收峰。

1.3.4.2 硅膠薄層層次（silica gel thin layer chromatography，TLC）檢測

稱取大型褐藻MAAs提取物0.1 g，溶解于1 mL 25%甲醇溶液中（濃度均為0.1 g/mL），在硅膠G板上點樣，以甲醇∶乙醇∶水（8∶10∶0.5，體積比）為展開劑。展開結束后，吹干G板，噴灑碘化鉍鉀溶液（7.3 g碘化鉍鉀，冰醋酸10 mL，蒸餾水60 mL）、靜置，橙色或黃色斑點為MAAs陽性反應。

1.3.4.3 高效液相色譜法測定

檢測器設置波長范圍190 nm～400 nm，色譜柱選用 Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流動相:A為0.2%甲酸-水；B為乙腈，梯度設置如表3所示；流速1.0 mL/min、柱溫25℃、波長330 nm、進樣量 50 μL。

表3 流動相洗脫梯度Table 3 Mobile phase elution gradient

1.3.4.4 質(zhì)譜測定

噴霧氣壓310 kPa，氮氣流速10.0 L/min，干燥溫度350℃，破碎電壓100 V，毛細管電壓4 500 V，全掃描，參比離子質(zhì)荷比：121.050 9，922.009 8，為參比離子對測定結果進行實時矯正，分辨率m/z在922.009 8處為11 300 全掃描，質(zhì)荷比（m/z）為 120～100 0。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 25分別對單因素和正交試驗結果進行顯著性和方差分析，采用Origin 2018繪圖。

2 結果與分析

2.1 大型褐藻MAAs提取工藝

2.1.1 單因素試驗結果

2.1.1.1 液料比對4種大型褐藻MAAs得率的影響

液料比對4種大型褐藻MAAs得率的影響見圖1。

圖1 液料比對4種大型褐藻MAAs得率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on the yields of MAAs from 4 brown macroalga

由圖1可知，隨液料比增加，整體上4種大型褐藻MAAs得率增大。在液料比為20mL/g或25mL/g時達到最大值，此時得率顯著（P＜0.05）高于液料比為10 mL/g時所制備MAAs的得率，這表明，較大的液料比有利于大型褐藻MAAs的提取。當液料比繼續(xù)增加時，4種大型褐藻MAAs得率并未發(fā)生明顯變化。

2.1.1.2 提取時間對4種大型褐藻MAAs得率的影響

提取時間對4種大型褐藻MAAs得率的影響見圖2。

圖2 提取時間對4種大型褐藻MAAs得率的影響Fig.2 Effects of extraction time on the yields of MAAs from 4 brown macroalga

由圖2可知，4種大型褐藻MAAs得率隨提取時間的延長呈現(xiàn)先明顯增加后略微下降的趨勢。在提取時間為3 h時，馬尾藻MAAs得率最大；其它3種大型褐藻MAAs得率在提取時間為2 h時達到最大。

2.1.1.3 提取次數(shù)對4種大型褐藻MAAs得率的影響

提取次數(shù)對4種大型褐藻MAAs得率的影響見圖3。

圖3 提取次數(shù)對4種大型褐藻MAAs得率的影響Fig.3 Effects of extraction times on the yields of MAAs from 4 brown macroalga

由圖3可知，整體來看，隨提取次數(shù)的增加，4種大型褐藻MAAs得率增加，在提取次數(shù)為2次時所得到的MAAs得率較大，表明較多的提取次數(shù)，利于4種大型褐藻MAAs的提取。當提取次數(shù)繼續(xù)增加時，4種大型褐藻MAAs得率并未出現(xiàn)明顯增加。

2.1.1.4 提取溫度對4種大型褐藻MAAs得率的影響

提取溫度對4種大型褐藻MAAs得率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對4種大型褐藻MAAs得率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on the yields of MAAs from 4 brown macroalga

從圖4可知，4種大型褐藻MAAs得率隨提取溫度的升高先增大后略微降低，分別在45℃（海帶和裙帶菜）或40℃（羊棲菜和馬尾藻）時，得率達到最大，這表明適當?shù)厣邷囟扔欣贛AAs迅速溶出。

2.1.2 正交試驗結果

表4為正交試驗結果直觀分析，表5為正交試驗結果方差分析。

表4 正交試驗結果Table 4 Results of orthogonal tests

表5 正交試驗結果方差分析Table 5 Analysis of variance of orthogonal tests results

由表5可知，4種大型褐藻MAAs提取過程中，除羊棲菜的因素A不顯著外，其余3種大型褐藻的因素A和B均是影響顯著的（P＜0.05）因素，因此，提取溫度和液料比均維持直觀分析結果，不可統(tǒng)一；在裙帶菜和馬尾藻MAAs提取過程中，因素C是顯著（P＜0.05）因素，同樣地，也應該維持直觀分析結果，不能取相同水平。故此，4種大型褐藻MAAs提取的適宜條件各不相同。對4種大型褐藻MAAs的最佳提取工藝進行驗證試驗，結果見表6。

表6 4種大型褐藻MAAs的最佳提取工藝Table 6 Optimum extraction process of MAAs from 4 brown macroalga

采用適宜提取工藝（表6），制備到羊棲菜、海帶、馬尾藻和裙帶菜MAAs提取物，它們的MAAs得率依次為31.40%、46.71%、8.29%和21.92%。驗證試驗得到的得率均高于表4中所有組合的得率。

2.2 MAAs提取物定性檢測和鑒定

圖5為4種大型褐藻MAAs提取物200nm～400nm波長紫外光譜掃描圖。

圖5 4種大型褐藻提取物的紫外波長掃描圖Fig.5 Ultraviolet wavelength scanning of MAAs extracts from 4 brown macroalga

從圖5可以看出，在310 nm～360 nm，馬尾藻MAAs提取物有明顯吸收峰；其余3種大型褐藻在260 nm～280 nm有吸收峰。研究表明，某些MAAs特征吸收峰為260 nm～280 nm[17]。進一步，采用硅膠薄層層析，對這些MAAs提取物進行定性檢測，結果見圖6。

圖6 4種大型褐藻MAAs提取物的硅膠薄層層析檢測Fig.6 Silica gel TLC detection of MAAs extracts from 4 brown macroalga

由圖6發(fā)現(xiàn)，4種大型褐藻MAAs提取物均在硅膠G板上呈現(xiàn)了黃色斑點。將紫外掃描和薄層層析檢測結合，可以對待測樣品中的MAAs進行快速篩選。同時，硅膠G板上斑點面積的大小，也能直觀反映樣品中MAAs含量的高低。

4種大型褐藻MAAs提取物的高效液相色譜圖見圖7。

圖7 4種大型褐藻MAAs提取物的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC of MAAs extracts from 4 brown macroalga

在圖7中，能夠清晰地看出4種大型褐藻MAAs提取物在不同停留時間出現(xiàn)吸收峰，表明它們中存在多種MAAs，然而無法確定具體MAAs種類。進一步綜合分析質(zhì)譜和高效液相色譜結果，并參照已有報道[17-18]，鑒定了4種大型褐藻MAAs提取物中MAAs組成，結果見表7。

表7 4種大型褐藻MAAs提取物相對峰面積、最大吸收波長、質(zhì)譜相應信息和MAAs種類Table 7 Relative peak area，maximum absorption wavelength，corresponding information on mass spectrum，and MAAs species of MAAs from 4 brown macroalga

從表7可以看出，4種大型褐藻MAAs提取物都含 有 shinorine、palythine、porphyra-334 和 palythenic acid 4種MAA，此外，海帶和裙帶菜中還有未知MAA。

在上述試驗基礎上，根據(jù)MAAs摩爾消光系數(shù)，計算得到它們在相應大型褐藻MAAs提取物中的含量，結果見表8。

表8 4種大型褐藻MAAs提取物中MAA含量Table 8 Content of MAA in the MAAs from 4 brown macroalga μg/g

表8結果表明，馬尾藻和羊棲菜MAAs提取物中palythenic acid、porphyra-334和shinorine含量明顯高于其它3種大型褐藻；羊棲菜MAAs提取物中，palythine含量最高。同時，還發(fā)現(xiàn)在同一種大型褐藻中，palythenic acid含量明顯高于其它3種MAA含量。在后續(xù)研究中，可以對馬尾藻和羊棲菜MAAs提取物中的palythenic acid進行純化制備。

3 結論

本文建立了羊棲菜、海帶、馬尾藻和裙帶菜等4種大型褐藻MAAs提取工藝，優(yōu)化發(fā)現(xiàn)當提取溫度、時間和液料比依次為 40、45、45℃和 40℃；2、2、2 h和 3 h；25、20、25 mL/g和 20 mL/g時，MAAs提取物得率最大。經(jīng)紫外光譜、薄層層析、高效液相色譜和質(zhì)譜分析，鑒定了4種大型褐藻MAAs提取物的MAAs組成。但尚未建立4種大型褐藻MAAs提取物的分離純化工藝，后續(xù)工作中還需展開MAAs純化制備研究。MAAs作為一種多功能活性化合物，在食品、醫(yī)藥和化妝品領域展現(xiàn)出巨大的發(fā)展前景。本文為大型褐藻MAAs研究提供了良好的技術支撐，并為其它大型海藻MAAs的篩選和鑒定提供了必要的理論參考。