大孔樹脂純化靈芝子實體和孢子粉中總?cè)?/h1>
2023-02-17 11:41:20祝朋玲張靜李思雨崔馨戈袁抒捷王雯彭燦周俊
食品研究與開發(fā) 2023年4期
祝朋玲，張靜，李思雨，崔馨戈，袁抒捷，王雯，彭燦，2，3，4，5*，周俊
（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.藥物制劑技術(shù)與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；3.中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；4.安徽省中醫(yī)藥研究院中藥資源保護與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；5.省部共建安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012；6.安徽黃山云樂靈芝有限公司，安徽 宣城 242600）
靈芝（Ganoderma lucidum）是一種具有極高價值的藥食兩用的靈芝屬真菌，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，最早被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，具有補氣安神、扶正固本、延年益壽等功效[1]，2019年已被納入“藥食同源”試點工作名單。靈芝孢子粉（Ganoderma lucidum spores powder，GLSP）是靈芝成熟后從真菌中排出來的橢圓形生殖細胞，包含靈芝的所有遺傳物質(zhì)[2]。靈芝子實體（Ganoderma lucidum fruiting body，GLFB）和孢子粉除可供藥用外，還可制備成各種保健食品?，F(xiàn)代研究表明，靈芝子實體及孢子粉中均含有三萜類、多糖、氨基酸、甾醇、生物堿等多種活性成分[3-4]，其中三萜類化合物作為靈芝的重要活性成分之一，具有保肝護肝[5-6]、抗炎[7-8]、降血糖[9]、抗腫瘤[10]、抗氧化[11-12]、神經(jīng)保護[13]等多種藥理活性，應用前景廣泛。
采用乙醇浸提獲得的靈芝三萜提取液中仍存有大量的雜質(zhì)，在對靈芝三萜進行成分分析和活性研究時會產(chǎn)生一定的干擾作用，因此需要對靈芝三萜進一步分離純化。到目前為止，對靈芝三萜類成分的研究多為提取工藝及藥理活性[14-16]，而鮮見針對靈芝子實體和孢子粉總?cè)频姆蛛x純化研究。大孔樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，具有選擇性高、吸附能力強、富集效果好、再生簡單、使用周期長等諸多優(yōu)點，被廣泛應用于三萜等天然產(chǎn)物的分離純化[17]。但目前不同型號的大孔樹脂對不同中藥中成分吸附與解吸性能不同，純化工藝也存在差異[18-20]。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，考察不同大孔樹脂分別對同源靈芝子實體和孢子粉總?cè)拼痔崛∥锏奈脚c解吸性能，確定最佳樹脂類型，優(yōu)化分離純化靈芝總?cè)频墓に嚄l件，為靈芝三萜后續(xù)的深入研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
靈芝（Ganoderma lucidum）：安徽省旌德縣安徽黃山云樂靈芝有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學俞年軍教授鑒定為多孔菌科赤芝子實體及孢子粉。無水乙醇（分析純）：江蘇強盛功能化學股份有限公司；冰醋酸、香草醛、乙酸乙酯（均為分析純）：上海潤捷化學試劑有限公司；高氯酸（優(yōu)級純）：國藥集團化學試劑有限公司；齊墩果酸標準品（純度：HPLC≥98%，批號：CHB171229）：成都克洛瑪生物科技有限公司；HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、AB-8、NKA-9、D101 型大孔樹脂：北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；HPD-826型大孔樹脂：鄭州和成新材料科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
千分之一分析天平（BSA224S-CW）、十萬分之一分析天平（BT25S）：北京賽多利斯科學儀器有限公司；恒溫水浴鍋（DF-101S）：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；紫外-可見分光光度計（UV-8000）：上海元析分析儀器有限公司；高速離心機（TG16-WS）：常州市萬豐儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-2102C）：上海智誠分析儀器制備有限公司。
1.3 方法
1.3.1 上樣液制備
取干燥的靈芝子實體粗粉和孢子粉（干樣）各200g，分別加入無水乙醇回流提取兩次，料液比為1∶20（g/mL），每次1.5 h，溫度50℃，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，得干樣含量0.2 g/mL的儲備液，保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 靈芝子實體和孢子粉總?cè)频臐舛葴y定
1.3.2.1 標準曲線的繪制
精密稱取齊墩果酸標準品10.00 mg，用無水乙醇溶解，配制成0.2 mg/mL的溶液，保存?zhèn)溆?。精密量取標準品溶?0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、2.0、2.6 mL于10 mL試管中，于50℃烘箱中揮干乙醇，放冷，精密加入0.2 mL 50 mg/mL的香草醛冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸溶液，混勻，于70℃水浴加熱15 min，取出，冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，在548 nm波長處測定吸光度（A）。以A為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，計算得線性回歸方程：A=29.503C+0.0208，R2=0.9970，線性范圍為 4 μg/mL～104 μg/mL。
1.3.2.2 樣品中總?cè)茲舛葴y定
吸取靈芝子實體和孢子粉乙醇提取液0.1 mL，于50℃烘箱中揮干乙醇，放冷，其余步驟同1.3.2.1。根據(jù)1.3.2.1中標準曲線回歸方程計算靈芝子實體和孢子粉乙醇提取液中總?cè)茲舛取?/p>
1.3.3 樹脂的預處理和含水量的測定
準確稱取一定量的 HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、HPD-826、AB-8、NKA-9、D101 型大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24 h充分溶脹后，倒出乙醇及漂浮物，濕法裝柱。繼續(xù)用95%乙醇沖洗樹脂柱，直至流出的乙醇洗脫液與蒸餾水（體積比為1∶1）混合無渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味，且樹脂排列均勻，備用。
取少量大孔樹脂，照2020版《中國藥典》附錄ⅨH水分測定法項下第一法-烘干法測定樹脂含水量。
1.3.4 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸
1.3.4.1 靜態(tài)吸附曲線的繪制
精密稱取預處理過的8種大孔樹脂，每份相當于相應的干樹脂2.00 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入20 mL靈芝子實體和孢子粉上樣液（相當于0.1 g干樣/mL），每 10 min 振搖 1 次，每次 10 s，持續(xù) 2 h，并于 0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00 h吸取上清液1 mL，按1.3.2方法測定吸光度。計算不同時間各樹脂對靈芝總?cè)频奈搅?，并繪制靜態(tài)吸附動力學曲線。
1.3.4.2 靜態(tài)吸附-解吸試驗
分別精密量取靈芝子實體和孢子粉上樣液10 mL（相當于0.5 g干樣/mL）各9份，加到預處理好的各型號大孔樹脂中，靜態(tài)吸附8 h，吸取上清液1 mL，按1.3.2方法測定吸光度，計算靈芝總?cè)频臐舛?。靜態(tài)吸附后的各型號大孔樹脂過濾后，先用適量的蒸餾水沖洗，抽干，置于250 mL具塞錐錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL于振蕩器中，振蕩12 h，過濾，95%乙醇定容至100 mL，精密量取各濾液1 mL，按1.3.2方法測定吸光度。按公式（1）～（4）計算靜態(tài)吸附量、吸附率、解吸率和回收率。
式中：Q為靜態(tài)吸附量，mg/g；C0為上樣液中總?cè)茲舛?，mg/mL；C1為靜態(tài)吸附后上清液的總?cè)茲舛?，mg/mL；V 為上樣液體積，mL；W 為干樹脂質(zhì)量，g；G 為吸附率，%；C3為解吸后溶液中總?cè)茲舛龋琺g/mL；D為解吸率，%；R為回收率，%。
1.3.5 大孔樹脂純化靈芝子實體和孢子粉總?cè)乒に噧?yōu)化
1.3.5.1 上樣液濃度的選擇
準確稱取預處理好的HPD-500和AB-8型大孔樹脂各5份（均相當于干大孔樹脂4 g），采用濕法裝柱，HPD-500大孔樹脂柱床體積（bed volume，BV）為27 mL，AB-8型大孔樹脂柱床體積為25 mL。分別制備濃度為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0g干樣/mL 的上樣液各 10mL，以2 mL/min的流速吸附完全后，先以4 BV的水沖洗，再換用4BV的95%乙醇沖洗，收集洗脫液，測定總?cè)茲舛?，計算吸附率和總?cè)妻D(zhuǎn)移率（總?cè)妻D(zhuǎn)移率/%＝洗脫液中總?cè)瀑|(zhì)量／上樣液中總?cè)瀑|(zhì)量×100），以確定最佳上樣液濃度。
1.3.5.2 上樣量的選擇
準確稱取預處理好的HPD-500和AB-8型大孔樹脂各5份（均相當于干大孔樹脂4 g），采用濕法裝柱。精密吸取1.0 g干樣/mL靈芝子實體的上樣液和0.4 g干樣/mL靈芝孢子粉的上樣液各100 mL，以2 mL/min的流速上柱，每5 mL收集一份流出液，并測定每份流出液中的總?cè)茲舛?。以流出液份?shù)為橫坐標，流出液中總?cè)茲舛葹榭v坐標，繪制動態(tài)吸附曲線。
1.3.5.3 最適洗脫溶劑濃度的確定
精密吸取1.0 g干樣/mL靈芝子實體的上樣液2 BV和0.4g干樣/mL靈芝孢子粉的上樣液3BV，以2mL/min的流速通過HPD-500和AB-8型大孔樹脂柱，分別用蒸餾水、20%、40%、50%、60%、75%、85%和95%的乙醇進行洗脫，洗脫劑用量均為4 BV，分段收集洗脫液，測定總?cè)茲舛取?/p>
1.3.5.4 洗脫劑用量的考察
精密吸取1.0 g干樣/mL靈芝子實體的上樣液2 BV和0.4g干樣/mL靈芝孢子粉的上樣液3BV，以2mL/min的流速分別通過HPD-500和AB-8型大孔樹脂柱，并分別用75%乙醇、95%乙醇進行洗脫，直至流出液無色，每5 mL接收1次流出液，每隔0.5 BV洗脫液測定其中總?cè)茲舛取?/p>
1.3.5.5 驗證試驗
為了考察最佳工藝條件的穩(wěn)定性，在上述篩選的最佳工藝條件下，采用HPD-500和AB-8型大孔樹脂分別純化靈芝子實體和孢子粉三萜粗提物，分別進行平行試驗3次。洗脫液濃縮、烘干至恒重后得到純化產(chǎn)物，按照1.3.2方法測定總?cè)坪俊?/p>
1.4 數(shù)據(jù)處理
所有試驗重復3次，采用Origin進行圖表繪制，通過Excle軟件對數(shù)據(jù)進行處理。
2 結(jié)果與分析
2.1 大孔吸附樹脂含水量
8種大孔樹脂的含水量測定結(jié)果見表1。
表1 樹脂含水量Table 1 Water content of resin
2.2 靜態(tài)吸附曲線
8種大孔樹脂對GLFB和GLSP總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線見圖1和圖2。
圖1 8種大孔樹脂對GLFB總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線Fig.1 Static adsorption curves of macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum fruiting body（GLFB）
圖2 8種大孔樹脂對GLSP總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線Fig.2 Static adsorption curves of macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum spore powder（GLSP）
由圖1和圖2可知，0～2 h時，8種大孔樹脂對靈芝子實體和孢子粉總?cè)频奈搅吭龃筝^快，2 h～8 h內(nèi)隨著時間延長而逐漸平緩，說明在2 h時吸附量都已基本達到平衡，大孔樹脂對靈芝總?cè)频奈搅口呌陲柡?。其中HPD-300和HPD-500型大孔樹脂對靈芝子實體總?cè)频奈搅吭? h后的吸附量略高于其他樹脂；而AB-8型大孔樹脂對靈芝孢子粉總?cè)频奈搅扛哂谄渌麡渲?/p>
2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸附效果
8種大孔樹脂的相關(guān)物理參數(shù)及對靈芝總?cè)频撵o態(tài)吸附與解吸效果見表2。
表2 8種大孔樹脂的相關(guān)物理參數(shù)及對靈芝總?cè)频撵o態(tài)吸附與解吸效果Table 2 Physical parameters and absorption-desorption performance of eight macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum
大孔樹脂的吸附作用來源于與被吸附物質(zhì)樹脂之間的范德華力和氫鍵，兩者之間的相互作用是一個物理過程，并且其極性、比表面積、孔徑也會影響樹脂吸附和解吸。由表2可知，較大比表面積、孔徑較小、非極性的HPD-300和HPD-500型大孔樹脂對靈芝子實體總?cè)频奈叫阅茌^好，但從解吸率和回收率考察可知HPD-500型大孔樹脂的解吸率和回收率均高于HPD-300型大孔樹脂，這可能是由于HPD-500型大孔樹脂與靈芝子實體中三萜類成分有較好的相互作用有關(guān)。對于靈芝孢子粉總?cè)贫?，弱極性的AB-8型大孔樹脂在吸附性能、解吸率以及回收率方面均高于其他7種型號的大孔樹脂，且高于對靈芝子實體三萜的吸附、解吸效果，這可能與靈芝孢子粉三萜與子實體三萜的極性不同有關(guān)。因此，綜合靜態(tài)吸附曲線結(jié)果，選擇HPD-500型大孔樹脂為靈芝子實體總?cè)品蛛x純化的最佳樹脂，AB-8型大孔樹脂作為靈芝孢子粉總?cè)品蛛x純化的最佳樹脂。
2.4 大孔樹脂純化靈芝子實體和孢子粉總?cè)乒に噮?shù)的確定
2.4.1 上樣液濃度的確定
靈芝子實體和孢子粉上樣液濃度對樹脂吸附性能的影響見圖3、圖4。
圖3 GLFB上樣液濃度對樹脂吸附性能的影響Fig.3 Effect of GLFB sample concentration on adsorption capability of macroporous adsorption resin
圖4 GLSP上樣液濃度對樹脂吸附性能的影響Fig.4 Effect of GLSP sample concentration on adsorption capability of macroporous adsorption resin
由圖3和圖4可知，隨上樣液濃度的增加，HPD-500型大孔樹脂對靈芝子實體中三萜類成分的吸附率在逐漸減小，但減幅較小，但隨上樣液濃度的增加，靈芝子實體的總?cè)妻D(zhuǎn)移率呈先升高后降低的趨勢。當靈芝子實體的上樣液濃度為1.0 g干樣/mL時，總?cè)妻D(zhuǎn)移率達到最大值83.72%；而AB-8型大孔樹脂對靈芝孢子粉中三萜類成分的吸附率在0.1 g干樣/mL～1.2 g干樣/mL范圍內(nèi)波動較小，總?cè)妻D(zhuǎn)移率隨上樣液濃度增高也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但在0.4 g干樣/mL時就達到最大值87.27%。上樣液濃度較低，大孔樹脂的吸附效果不能被充分利用造成浪費，但上樣液濃度過大會使上樣液中溶質(zhì)無法充分溶解，甚至會造成樹脂堵塞，不利于后續(xù)的解吸。因此，靈芝子實體的上樣液濃度選擇1.0 g干樣/mL，而孢子粉的上樣液濃度選擇0.4 g干樣/mL。
2.4.2 上樣量的確定
HPD-500型大孔樹脂對GLFB和AB-8型大孔樹脂對GLSP吸附總?cè)频膭討B(tài)吸附曲線見圖5。
圖5 HPD-500型大孔樹脂對GLFB和AB-8型大孔樹脂對GLSP吸附總?cè)频膭討B(tài)吸附曲線Fig.5 Dynamic adsorption curves of HPD-500 for the total triterpenoids of GLFB and AB-8 for those of GLSP
由圖5可知，隨著上樣量的增加，靈芝子實體和孢子粉的流出液中總?cè)茲舛染尸F(xiàn)先平緩后快速上升趨勢。當靈芝子實體上樣量低于2 BV時，靈芝子實體的流出液中總?cè)茲舛仍龇^小，但達到2.25 BV時，流出液中總?cè)茲舛仍龃蟮?.30 mg/mL，并隨著上樣量增大而升高；當靈芝孢子粉上樣量低于3 BV時，流出液中總?cè)茲舛茸兓^小，但超過3 BV時，靈芝孢子粉的流出液中總?cè)茲舛妊杆僭龃?。這說明靈芝子實體上樣量為2 BV，孢子粉上樣量為3 BV時，大孔吸附樹脂吸附量基本達到飽和的狀態(tài)。為避免因為過飽和導致三萜未被吸附而直接流出，從而影響分離效果，故靈芝子實體上樣量選擇2 BV，靈芝孢子粉上樣量選擇3 BV。
2.4.3 洗脫溶劑濃度的確定
經(jīng)前期試驗確定乙醇為最適洗脫溶劑，乙醇濃度對GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊懸妶D6。
圖6 乙醇濃度對GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊慒ig.6 Effect of ethanol concentration on the elution performance of HPD-500 for GLFB and AB-8 for GLSP
由圖6可知，隨著乙醇濃度的增加，HPD-500型大孔樹脂對靈芝子實體總?cè)频慕馕食尸F(xiàn)先升高后降低的趨勢，當乙醇濃度為75%時，對HPD-500型大孔吸附樹脂吸附的靈芝子實體總?cè)频慕馕首畲?，?8.52%；而AB-8型大孔樹脂對吸附的靈芝孢子粉總?cè)频慕馕孰S著乙醇濃度的增大而逐漸升高，當乙醇濃度為95%時，對靈芝孢子粉總?cè)频慕馕蔬_到了最大，高達96.93%。這可能是由于總?cè)茷榉菢O性物質(zhì)，乙醇濃度升高降低了極性，三萜在低極性洗脫液中具有較高的溶解性，更容易被洗脫，因此選擇靈芝子實體的洗脫溶劑為75%乙醇，而孢子粉的洗脫溶劑為95%乙醇。
2.4.4 洗脫劑用量的確定
洗脫劑用量對GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊懸妶D7。
圖7 洗脫劑用量對GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊慒ig.7 Effect of eluent dosage on the elution performance of HPD-500 for GLFB and AB-8 for GLSP
由圖7可知，隨著洗脫劑用量的增加，靈芝子實體和孢子粉洗脫液中的總?cè)茲舛染氏壬吆蠼档偷内厔?，且當洗脫劑體積到達8.5 BV后，靈芝子實體和靈芝孢子粉的洗脫液中總?cè)茲舛然静辉僮兓f明8.5 BV的洗脫液就可以將總?cè)葡疵撏耆?，故后續(xù)試驗洗脫劑用量均選擇8.5 BV。
2.5 驗證試驗
在上述優(yōu)選的工藝條件下，采用HPD-500和AB-8型大孔樹脂分別純化靈芝子實體和孢子粉三萜粗提物，分別進行平行試驗3次。洗脫液濃縮、凍干至恒重后得到純化產(chǎn)物，測定純化后的靈芝子實體總?cè)坪糠謩e為60.74%、59.18%及61.85%，平均值為60.59%，孢子粉總?cè)坪糠謩e為65.43%、64.35%及66.67%，平均值為65.48%，純化效果顯著。
3 結(jié)論
靈芝中的總?cè)瓶梢酝ㄟ^大孔樹脂吸附純化，本研究以大孔樹脂對吸附率和解吸率為指標，選用HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、HPD-826、AB-8、NKA-9、D101型8種常用的大孔樹脂分別對靈芝子實體和孢子粉總?cè)频撵o態(tài)吸附、解吸動力學進行考察，篩選出HPD-500型大孔樹脂和AB-8型大孔樹脂分別對靈芝子實體和孢子粉總?cè)频奈浇馕Ч詈?。其中，HPD-500型大孔樹脂純化靈芝子實體總?cè)频淖罴鸭兓に嚄l件：上樣液濃度為1.0 g干樣/mL，上樣量為2 BV，用8.5 BV的75%乙醇進行洗脫。AB-8型大孔樹脂純化對靈芝孢子粉總?cè)频淖罴鸭兓に嚄l件：上樣液濃度為0.4 g干樣/mL，最大上樣量為3 BV，用8.5 BV的95%乙醇進行洗脫。經(jīng)純化后，靈芝子實體和孢子粉總?cè)萍兌确謩e可達到60.59%和65.48%，表明大孔樹脂能夠較好地去除雜質(zhì)，對靈芝子實體和孢子粉中總?cè)凭哂辛己玫募兓Ч?，是一種非常有效的分離純化方法。該大孔樹脂純化工藝的建立為靈芝子實體和孢子粉中三萜類成分的富集和后續(xù)相關(guān)原料藥制劑及保健食品的開發(fā)利用提供了新的參考依據(jù)，具有較好的應用前景。
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（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.藥物制劑技術(shù)與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；3.中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；4.安徽省中醫(yī)藥研究院中藥資源保護與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；5.省部共建安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012；6.安徽黃山云樂靈芝有限公司，安徽 宣城 242600）
靈芝（Ganoderma lucidum）是一種具有極高價值的藥食兩用的靈芝屬真菌，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，最早被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，具有補氣安神、扶正固本、延年益壽等功效[1]，2019年已被納入“藥食同源”試點工作名單。靈芝孢子粉（Ganoderma lucidum spores powder，GLSP）是靈芝成熟后從真菌中排出來的橢圓形生殖細胞，包含靈芝的所有遺傳物質(zhì)[2]。靈芝子實體（Ganoderma lucidum fruiting body，GLFB）和孢子粉除可供藥用外，還可制備成各種保健食品?，F(xiàn)代研究表明，靈芝子實體及孢子粉中均含有三萜類、多糖、氨基酸、甾醇、生物堿等多種活性成分[3-4]，其中三萜類化合物作為靈芝的重要活性成分之一，具有保肝護肝[5-6]、抗炎[7-8]、降血糖[9]、抗腫瘤[10]、抗氧化[11-12]、神經(jīng)保護[13]等多種藥理活性，應用前景廣泛。
采用乙醇浸提獲得的靈芝三萜提取液中仍存有大量的雜質(zhì)，在對靈芝三萜進行成分分析和活性研究時會產(chǎn)生一定的干擾作用，因此需要對靈芝三萜進一步分離純化。到目前為止，對靈芝三萜類成分的研究多為提取工藝及藥理活性[14-16]，而鮮見針對靈芝子實體和孢子粉總?cè)频姆蛛x純化研究。大孔樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，具有選擇性高、吸附能力強、富集效果好、再生簡單、使用周期長等諸多優(yōu)點，被廣泛應用于三萜等天然產(chǎn)物的分離純化[17]。但目前不同型號的大孔樹脂對不同中藥中成分吸附與解吸性能不同，純化工藝也存在差異[18-20]。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，考察不同大孔樹脂分別對同源靈芝子實體和孢子粉總?cè)拼痔崛∥锏奈脚c解吸性能，確定最佳樹脂類型，優(yōu)化分離純化靈芝總?cè)频墓に嚄l件，為靈芝三萜后續(xù)的深入研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
靈芝（Ganoderma lucidum）：安徽省旌德縣安徽黃山云樂靈芝有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學俞年軍教授鑒定為多孔菌科赤芝子實體及孢子粉。無水乙醇（分析純）：江蘇強盛功能化學股份有限公司；冰醋酸、香草醛、乙酸乙酯（均為分析純）：上海潤捷化學試劑有限公司；高氯酸（優(yōu)級純）：國藥集團化學試劑有限公司；齊墩果酸標準品（純度：HPLC≥98%，批號：CHB171229）：成都克洛瑪生物科技有限公司；HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、AB-8、NKA-9、D101 型大孔樹脂：北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；HPD-826型大孔樹脂：鄭州和成新材料科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
千分之一分析天平（BSA224S-CW）、十萬分之一分析天平（BT25S）：北京賽多利斯科學儀器有限公司；恒溫水浴鍋（DF-101S）：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；紫外-可見分光光度計（UV-8000）：上海元析分析儀器有限公司；高速離心機（TG16-WS）：常州市萬豐儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-2102C）：上海智誠分析儀器制備有限公司。
1.3 方法
1.3.1 上樣液制備
取干燥的靈芝子實體粗粉和孢子粉（干樣）各200g，分別加入無水乙醇回流提取兩次，料液比為1∶20（g/mL），每次1.5 h，溫度50℃，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，得干樣含量0.2 g/mL的儲備液，保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 靈芝子實體和孢子粉總?cè)频臐舛葴y定
1.3.2.1 標準曲線的繪制
精密稱取齊墩果酸標準品10.00 mg，用無水乙醇溶解，配制成0.2 mg/mL的溶液，保存?zhèn)溆?。精密量取標準品溶?0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、2.0、2.6 mL于10 mL試管中，于50℃烘箱中揮干乙醇，放冷，精密加入0.2 mL 50 mg/mL的香草醛冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸溶液，混勻，于70℃水浴加熱15 min，取出，冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，在548 nm波長處測定吸光度（A）。以A為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，計算得線性回歸方程：A=29.503C+0.0208，R2=0.9970，線性范圍為 4 μg/mL～104 μg/mL。
1.3.2.2 樣品中總?cè)茲舛葴y定
吸取靈芝子實體和孢子粉乙醇提取液0.1 mL，于50℃烘箱中揮干乙醇，放冷，其余步驟同1.3.2.1。根據(jù)1.3.2.1中標準曲線回歸方程計算靈芝子實體和孢子粉乙醇提取液中總?cè)茲舛取?/p>
1.3.3 樹脂的預處理和含水量的測定
準確稱取一定量的 HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、HPD-826、AB-8、NKA-9、D101 型大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24 h充分溶脹后，倒出乙醇及漂浮物，濕法裝柱。繼續(xù)用95%乙醇沖洗樹脂柱，直至流出的乙醇洗脫液與蒸餾水（體積比為1∶1）混合無渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味，且樹脂排列均勻，備用。
取少量大孔樹脂，照2020版《中國藥典》附錄ⅨH水分測定法項下第一法-烘干法測定樹脂含水量。
1.3.4 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸
1.3.4.1 靜態(tài)吸附曲線的繪制
精密稱取預處理過的8種大孔樹脂，每份相當于相應的干樹脂2.00 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入20 mL靈芝子實體和孢子粉上樣液（相當于0.1 g干樣/mL），每 10 min 振搖 1 次，每次 10 s，持續(xù) 2 h，并于 0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00 h吸取上清液1 mL，按1.3.2方法測定吸光度。計算不同時間各樹脂對靈芝總?cè)频奈搅?，并繪制靜態(tài)吸附動力學曲線。
1.3.4.2 靜態(tài)吸附-解吸試驗
分別精密量取靈芝子實體和孢子粉上樣液10 mL（相當于0.5 g干樣/mL）各9份，加到預處理好的各型號大孔樹脂中，靜態(tài)吸附8 h，吸取上清液1 mL，按1.3.2方法測定吸光度，計算靈芝總?cè)频臐舛?。靜態(tài)吸附后的各型號大孔樹脂過濾后，先用適量的蒸餾水沖洗，抽干，置于250 mL具塞錐錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL于振蕩器中，振蕩12 h，過濾，95%乙醇定容至100 mL，精密量取各濾液1 mL，按1.3.2方法測定吸光度。按公式（1）～（4）計算靜態(tài)吸附量、吸附率、解吸率和回收率。
式中：Q為靜態(tài)吸附量，mg/g；C0為上樣液中總?cè)茲舛?，mg/mL；C1為靜態(tài)吸附后上清液的總?cè)茲舛?，mg/mL；V 為上樣液體積，mL；W 為干樹脂質(zhì)量，g；G 為吸附率，%；C3為解吸后溶液中總?cè)茲舛龋琺g/mL；D為解吸率，%；R為回收率，%。
1.3.5 大孔樹脂純化靈芝子實體和孢子粉總?cè)乒に噧?yōu)化
1.3.5.1 上樣液濃度的選擇
準確稱取預處理好的HPD-500和AB-8型大孔樹脂各5份（均相當于干大孔樹脂4 g），采用濕法裝柱，HPD-500大孔樹脂柱床體積（bed volume，BV）為27 mL，AB-8型大孔樹脂柱床體積為25 mL。分別制備濃度為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0g干樣/mL 的上樣液各 10mL，以2 mL/min的流速吸附完全后，先以4 BV的水沖洗，再換用4BV的95%乙醇沖洗，收集洗脫液，測定總?cè)茲舛?，計算吸附率和總?cè)妻D(zhuǎn)移率（總?cè)妻D(zhuǎn)移率/%＝洗脫液中總?cè)瀑|(zhì)量／上樣液中總?cè)瀑|(zhì)量×100），以確定最佳上樣液濃度。
1.3.5.2 上樣量的選擇
準確稱取預處理好的HPD-500和AB-8型大孔樹脂各5份（均相當于干大孔樹脂4 g），采用濕法裝柱。精密吸取1.0 g干樣/mL靈芝子實體的上樣液和0.4 g干樣/mL靈芝孢子粉的上樣液各100 mL，以2 mL/min的流速上柱，每5 mL收集一份流出液，并測定每份流出液中的總?cè)茲舛?。以流出液份?shù)為橫坐標，流出液中總?cè)茲舛葹榭v坐標，繪制動態(tài)吸附曲線。
1.3.5.3 最適洗脫溶劑濃度的確定
精密吸取1.0 g干樣/mL靈芝子實體的上樣液2 BV和0.4g干樣/mL靈芝孢子粉的上樣液3BV，以2mL/min的流速通過HPD-500和AB-8型大孔樹脂柱，分別用蒸餾水、20%、40%、50%、60%、75%、85%和95%的乙醇進行洗脫，洗脫劑用量均為4 BV，分段收集洗脫液，測定總?cè)茲舛取?/p>
1.3.5.4 洗脫劑用量的考察
精密吸取1.0 g干樣/mL靈芝子實體的上樣液2 BV和0.4g干樣/mL靈芝孢子粉的上樣液3BV，以2mL/min的流速分別通過HPD-500和AB-8型大孔樹脂柱，并分別用75%乙醇、95%乙醇進行洗脫，直至流出液無色，每5 mL接收1次流出液，每隔0.5 BV洗脫液測定其中總?cè)茲舛取?/p>
1.3.5.5 驗證試驗
為了考察最佳工藝條件的穩(wěn)定性，在上述篩選的最佳工藝條件下，采用HPD-500和AB-8型大孔樹脂分別純化靈芝子實體和孢子粉三萜粗提物，分別進行平行試驗3次。洗脫液濃縮、烘干至恒重后得到純化產(chǎn)物，按照1.3.2方法測定總?cè)坪俊?/p>
1.4 數(shù)據(jù)處理
所有試驗重復3次，采用Origin進行圖表繪制，通過Excle軟件對數(shù)據(jù)進行處理。
2 結(jié)果與分析
2.1 大孔吸附樹脂含水量
8種大孔樹脂的含水量測定結(jié)果見表1。
表1 樹脂含水量Table 1 Water content of resin
2.2 靜態(tài)吸附曲線
8種大孔樹脂對GLFB和GLSP總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線見圖1和圖2。
圖1 8種大孔樹脂對GLFB總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線Fig.1 Static adsorption curves of macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum fruiting body（GLFB）
圖2 8種大孔樹脂對GLSP總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線Fig.2 Static adsorption curves of macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum spore powder（GLSP）
由圖1和圖2可知，0～2 h時，8種大孔樹脂對靈芝子實體和孢子粉總?cè)频奈搅吭龃筝^快，2 h～8 h內(nèi)隨著時間延長而逐漸平緩，說明在2 h時吸附量都已基本達到平衡，大孔樹脂對靈芝總?cè)频奈搅口呌陲柡?。其中HPD-300和HPD-500型大孔樹脂對靈芝子實體總?cè)频奈搅吭? h后的吸附量略高于其他樹脂；而AB-8型大孔樹脂對靈芝孢子粉總?cè)频奈搅扛哂谄渌麡渲?/p>
2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸附效果
8種大孔樹脂的相關(guān)物理參數(shù)及對靈芝總?cè)频撵o態(tài)吸附與解吸效果見表2。
表2 8種大孔樹脂的相關(guān)物理參數(shù)及對靈芝總?cè)频撵o態(tài)吸附與解吸效果Table 2 Physical parameters and absorption-desorption performance of eight macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum
大孔樹脂的吸附作用來源于與被吸附物質(zhì)樹脂之間的范德華力和氫鍵，兩者之間的相互作用是一個物理過程，并且其極性、比表面積、孔徑也會影響樹脂吸附和解吸。由表2可知，較大比表面積、孔徑較小、非極性的HPD-300和HPD-500型大孔樹脂對靈芝子實體總?cè)频奈叫阅茌^好，但從解吸率和回收率考察可知HPD-500型大孔樹脂的解吸率和回收率均高于HPD-300型大孔樹脂，這可能是由于HPD-500型大孔樹脂與靈芝子實體中三萜類成分有較好的相互作用有關(guān)。對于靈芝孢子粉總?cè)贫?，弱極性的AB-8型大孔樹脂在吸附性能、解吸率以及回收率方面均高于其他7種型號的大孔樹脂，且高于對靈芝子實體三萜的吸附、解吸效果，這可能與靈芝孢子粉三萜與子實體三萜的極性不同有關(guān)。因此，綜合靜態(tài)吸附曲線結(jié)果，選擇HPD-500型大孔樹脂為靈芝子實體總?cè)品蛛x純化的最佳樹脂，AB-8型大孔樹脂作為靈芝孢子粉總?cè)品蛛x純化的最佳樹脂。
2.4 大孔樹脂純化靈芝子實體和孢子粉總?cè)乒に噮?shù)的確定
2.4.1 上樣液濃度的確定
靈芝子實體和孢子粉上樣液濃度對樹脂吸附性能的影響見圖3、圖4。
圖3 GLFB上樣液濃度對樹脂吸附性能的影響Fig.3 Effect of GLFB sample concentration on adsorption capability of macroporous adsorption resin
圖4 GLSP上樣液濃度對樹脂吸附性能的影響Fig.4 Effect of GLSP sample concentration on adsorption capability of macroporous adsorption resin
由圖3和圖4可知，隨上樣液濃度的增加，HPD-500型大孔樹脂對靈芝子實體中三萜類成分的吸附率在逐漸減小，但減幅較小，但隨上樣液濃度的增加，靈芝子實體的總?cè)妻D(zhuǎn)移率呈先升高后降低的趨勢。當靈芝子實體的上樣液濃度為1.0 g干樣/mL時，總?cè)妻D(zhuǎn)移率達到最大值83.72%；而AB-8型大孔樹脂對靈芝孢子粉中三萜類成分的吸附率在0.1 g干樣/mL～1.2 g干樣/mL范圍內(nèi)波動較小，總?cè)妻D(zhuǎn)移率隨上樣液濃度增高也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但在0.4 g干樣/mL時就達到最大值87.27%。上樣液濃度較低，大孔樹脂的吸附效果不能被充分利用造成浪費，但上樣液濃度過大會使上樣液中溶質(zhì)無法充分溶解，甚至會造成樹脂堵塞，不利于后續(xù)的解吸。因此，靈芝子實體的上樣液濃度選擇1.0 g干樣/mL，而孢子粉的上樣液濃度選擇0.4 g干樣/mL。
2.4.2 上樣量的確定
HPD-500型大孔樹脂對GLFB和AB-8型大孔樹脂對GLSP吸附總?cè)频膭討B(tài)吸附曲線見圖5。
圖5 HPD-500型大孔樹脂對GLFB和AB-8型大孔樹脂對GLSP吸附總?cè)频膭討B(tài)吸附曲線Fig.5 Dynamic adsorption curves of HPD-500 for the total triterpenoids of GLFB and AB-8 for those of GLSP
由圖5可知，隨著上樣量的增加，靈芝子實體和孢子粉的流出液中總?cè)茲舛染尸F(xiàn)先平緩后快速上升趨勢。當靈芝子實體上樣量低于2 BV時，靈芝子實體的流出液中總?cè)茲舛仍龇^小，但達到2.25 BV時，流出液中總?cè)茲舛仍龃蟮?.30 mg/mL，并隨著上樣量增大而升高；當靈芝孢子粉上樣量低于3 BV時，流出液中總?cè)茲舛茸兓^小，但超過3 BV時，靈芝孢子粉的流出液中總?cè)茲舛妊杆僭龃?。這說明靈芝子實體上樣量為2 BV，孢子粉上樣量為3 BV時，大孔吸附樹脂吸附量基本達到飽和的狀態(tài)。為避免因為過飽和導致三萜未被吸附而直接流出，從而影響分離效果，故靈芝子實體上樣量選擇2 BV，靈芝孢子粉上樣量選擇3 BV。
2.4.3 洗脫溶劑濃度的確定
經(jīng)前期試驗確定乙醇為最適洗脫溶劑，乙醇濃度對GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊懸妶D6。
圖6 乙醇濃度對GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊慒ig.6 Effect of ethanol concentration on the elution performance of HPD-500 for GLFB and AB-8 for GLSP
由圖6可知，隨著乙醇濃度的增加，HPD-500型大孔樹脂對靈芝子實體總?cè)频慕馕食尸F(xiàn)先升高后降低的趨勢，當乙醇濃度為75%時，對HPD-500型大孔吸附樹脂吸附的靈芝子實體總?cè)频慕馕首畲?，?8.52%；而AB-8型大孔樹脂對吸附的靈芝孢子粉總?cè)频慕馕孰S著乙醇濃度的增大而逐漸升高，當乙醇濃度為95%時，對靈芝孢子粉總?cè)频慕馕蔬_到了最大，高達96.93%。這可能是由于總?cè)茷榉菢O性物質(zhì)，乙醇濃度升高降低了極性，三萜在低極性洗脫液中具有較高的溶解性，更容易被洗脫，因此選擇靈芝子實體的洗脫溶劑為75%乙醇，而孢子粉的洗脫溶劑為95%乙醇。
2.4.4 洗脫劑用量的確定
洗脫劑用量對GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊懸妶D7。
圖7 洗脫劑用量對GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊慒ig.7 Effect of eluent dosage on the elution performance of HPD-500 for GLFB and AB-8 for GLSP
由圖7可知，隨著洗脫劑用量的增加，靈芝子實體和孢子粉洗脫液中的總?cè)茲舛染氏壬吆蠼档偷内厔?，且當洗脫劑體積到達8.5 BV后，靈芝子實體和靈芝孢子粉的洗脫液中總?cè)茲舛然静辉僮兓f明8.5 BV的洗脫液就可以將總?cè)葡疵撏耆?，故后續(xù)試驗洗脫劑用量均選擇8.5 BV。
2.5 驗證試驗
在上述優(yōu)選的工藝條件下，采用HPD-500和AB-8型大孔樹脂分別純化靈芝子實體和孢子粉三萜粗提物，分別進行平行試驗3次。洗脫液濃縮、凍干至恒重后得到純化產(chǎn)物，測定純化后的靈芝子實體總?cè)坪糠謩e為60.74%、59.18%及61.85%，平均值為60.59%，孢子粉總?cè)坪糠謩e為65.43%、64.35%及66.67%，平均值為65.48%，純化效果顯著。
3 結(jié)論
靈芝中的總?cè)瓶梢酝ㄟ^大孔樹脂吸附純化，本研究以大孔樹脂對吸附率和解吸率為指標，選用HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、HPD-826、AB-8、NKA-9、D101型8種常用的大孔樹脂分別對靈芝子實體和孢子粉總?cè)频撵o態(tài)吸附、解吸動力學進行考察，篩選出HPD-500型大孔樹脂和AB-8型大孔樹脂分別對靈芝子實體和孢子粉總?cè)频奈浇馕Ч詈?。其中，HPD-500型大孔樹脂純化靈芝子實體總?cè)频淖罴鸭兓に嚄l件：上樣液濃度為1.0 g干樣/mL，上樣量為2 BV，用8.5 BV的75%乙醇進行洗脫。AB-8型大孔樹脂純化對靈芝孢子粉總?cè)频淖罴鸭兓に嚄l件：上樣液濃度為0.4 g干樣/mL，最大上樣量為3 BV，用8.5 BV的95%乙醇進行洗脫。經(jīng)純化后，靈芝子實體和孢子粉總?cè)萍兌确謩e可達到60.59%和65.48%，表明大孔樹脂能夠較好地去除雜質(zhì)，對靈芝子實體和孢子粉中總?cè)凭哂辛己玫募兓Ч?，是一種非常有效的分離純化方法。該大孔樹脂純化工藝的建立為靈芝子實體和孢子粉中三萜類成分的富集和后續(xù)相關(guān)原料藥制劑及保健食品的開發(fā)利用提供了新的參考依據(jù)，具有較好的應用前景。
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