劉靜，牛秀梅，王美美，胡雨晴，張瑞，高惠穎，呂長鑫*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.錦州市檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心，遼寧 錦州 121013）

紫薯（purple sweet potato）又名黑薯、紫紅薯[1]，富含花青素、多糖和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[2-3]。桑葚（mulberry）又名桑果，富含黃酮醇、花青素等活性物質(zhì)，適合用于開發(fā)具有保健功能的產(chǎn)品[4-5]。隨著大眾對養(yǎng)生的關(guān)注度越來越高，保健類口服液逐漸成為熱銷產(chǎn)品，市場上出現(xiàn)的保健口服液多以美白、抗衰老、抗疲勞等功效迎合消費(fèi)者需求。目前，尚未見有紫薯桑葚復(fù)合口服液的研究，因此以紫薯和桑葚為原料進(jìn)行紫薯桑葚口服液的研究，具有很大的開發(fā)前景[6]。

目前針對復(fù)合口服液在消化過程中活性成分變化及抗氧化活性變化規(guī)律的研究較少，體外模擬消化具有成本低、易于操控等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。故本試驗(yàn)以紫薯為原料進(jìn)行提取濃縮制得紫薯提取液，用桑葚汁進(jìn)行復(fù)合調(diào)配，制備一款具有較高生物活性成分的復(fù)合口服液，并采用體外模擬胃腸消化法，以總酚、黃酮、花色苷含量為指標(biāo)評價(jià)此款復(fù)合口服液在消化過程中的活性物質(zhì)變化規(guī)律以及抗氧化能力的變化，為綜合評價(jià)紫薯桑葚復(fù)合口服液的營養(yǎng)價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯：遼寧省錦州市春利農(nóng)業(yè)發(fā)展科技有限公司；桑葚：遼寧省葫蘆島市南票區(qū)虹螺峴鎮(zhèn)虹南村小南溝屯；白砂糖、檸檬酸（食品級(jí)）：市售；豬膽鹽、胃蛋白酶（250 000 U/g）、胰蛋白酶（10 000 U/g）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]、1，1- 二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；α-淀粉酶（50 000 U/g）、糖化酶（50 000 U/g）（均為食品級(jí)）：江蘇銳康萊科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（UV-2700）：日本島津儀器有限公司；冷凍離心機(jī)（5804R）：德國艾本德公司；冷凍水浴恒溫振蕩器（SHA-2）：金壇市瑞華儀器有限公司。

1.3 工藝流程

1.4 方法

1.4.1 操作要點(diǎn)

紫薯提取液制備：將紫薯切片烘干粉碎后過60目篩備用。稱取10 g紫薯粉加入0.1%α-淀粉酶、0.15%糖化酶、300 mL 70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液，振蕩混合均勻。200 W超聲波輔助提取40 min、85℃滅酶5 min、50℃真空濃縮、定容至100 mL，即得紫薯提取液。

桑葚汁制備：桑葚解凍、打漿（6 000 r/min，2 min）、酶解（果膠酶0.06%、纖維素酶0.09%，48℃攪拌酶解120 min），粗濾兩次后離心得桑葚原汁。

紫薯桑葚復(fù)合口服液制備：將紫薯提取液和桑葚汁按照一定的質(zhì)量比混合，加入白砂糖和檸檬酸進(jìn)行調(diào)配，灌裝殺菌即得紫薯桑葚復(fù)合口服液。

1.4.2 紫薯桑葚復(fù)合口服液配方優(yōu)化試驗(yàn)

1.4.2.1 單因素試驗(yàn)

以紫薯提取液與桑葚汁質(zhì)量比3∶4、檸檬酸0.02%、白砂糖4%為固定參數(shù)，考察紫薯提取液與桑葚汁質(zhì)量比（2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1）、檸檬酸添加量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）、白砂糖添加量（2%、3%、4%、5%、6%）對紫薯桑葚復(fù)合口服液感官評分的影響。

1.4.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化紫薯桑葚復(fù)合口服液配方。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.4.2.3 感官評價(jià)

參考GB 7101—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲料》感官要求規(guī)定，以100為滿分，各項(xiàng)占比為色澤∶氣味∶口感∶組織狀態(tài)=2∶3∶3∶2，依據(jù)紫薯桑葚復(fù)合口服液的特點(diǎn)制定出產(chǎn)品感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，如表2所示。

表2 紫薯桑葚復(fù)合口服液評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standard for evaluation of purple sweet potato and mulberry compound oral liquid

1.4.3 體外模擬胃腸消化

體外模擬胃腸消化參考Estévez-Santiago等[9]的方法，略作修改。

模擬胃消化：取1mL樣品加入19mL生理鹽水，用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0，將樣品分為3組。

式中：N樣品稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾質(zhì)量，449.38 g/mol；ε為消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；L 為光程，1 cm。

1.4.4.2 總酚含量測定

參考王儲(chǔ)炎等[11]的方法，配制0.1 mg/mL沒食子酸溶液，分別取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，加 0.5 mL 福林酚試劑，1 min后加1.5 mL 15%Na2CO3溶液，蒸餾水定容，室溫避光1 h，于765 nm處測定吸光度，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=67.086x+0.015，R2=0.999。準(zhǔn)確量取0.1mL口服液代替沒食子酸溶液，按上述步驟測定，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總酚含量，結(jié)果以每毫升口服液所含沒食子酸當(dāng)量（mg GAE/mL）表示。模擬胃液消化組：加4mL胃液（0.2g胃蛋白酶溶于10mL 0.01 mol/L HCl溶液）；胃酸對照組：加4 mL 0.01 mol/L的鹽酸；空白組：加4 mL生理鹽水。

模擬腸消化：模擬胃消化之后，將樣品用1 mol/L的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，將樣品分為2組。腸液消化組：加入4 mL胰蛋白酶-膽汁混合液（1.9 g豬膽鹽和0.3 g胰蛋白酶溶于60 mL 0.1 mol/L NaHCO3緩沖溶液）；空白組以等量的0.1 mol/L的NaHCO3緩沖液代替。

將上述各組待測溶液于37℃恒溫水浴振蕩2 h，分別消化 0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，取出部分樣品經(jīng)8 000 r/min離心10 min，取上清液用于指標(biāo)測定。

1.4.4 體外模擬消化過程中活性成分測定

1.4.4.1 花色苷含量測定

采用pH示差法[10]，取1 mL口服液樣品，各加9 mL pH1.0和pH4.5的緩沖液，室溫避光靜置1 h，以1 mL蒸餾水代替口服液樣品，為空白對照，分別于510 nm和700 nm 處測吸光度（A510nm、A700nm），紫薯桑葚復(fù)合口服液中花色苷含量按式（2）進(jìn)行計(jì)算。

1.4.4.3 黃酮含量測定

參考Somboonpanyakul等[12]的方法，配制0.2 mg/mL蘆丁溶液，分別取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，每隔5 min依次加1.0mL5%NaNO2、1.0 mL 10%Al（NO3）3和10 mL 4%NaOH，60%乙醇定容，靜置15 min，于510 nm處測吸光度，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=7.148 6x+0.005，R2=0.999 9。準(zhǔn)確量取1 mL口服液代替蘆丁溶液，按上述步驟測定，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算黃酮含量，結(jié)果以每毫升口服液所含蘆丁當(dāng)量（mg RE/mL）表示。

1.4.5 體外模擬消化過程中抗氧化活性測定

1.4.5.1 DPPH自由基清除率測定

根據(jù)Pezeshk等[13]的方法，取0.1 mL口服液樣品與3.9 mL 0.1 mg/mL DPPH溶液混合，室溫避光靜置30 min，于517 nm處測吸光度記為A1；以無水乙醇代替口服液樣品測吸光度記為A0；以無水乙醇代替DPPH溶液測吸光度記為A2，DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.4.5.2 ABTS+自由基清除率測定

參考Kiselova等[14]的方法，制備ABTS工作液。取50 μL口服液樣品與3.5mLABTS工作液混勻，在734nm處測定吸光度記為A1；無水乙醇代替口服液樣品測吸光度記為A0；用緩沖液代替ABTS溶液測定吸光度記為A2，ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.4.5.3 羥自由基清除率測定

根據(jù)Li等[15]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，取0.1 mL口服液樣品，依次加 2 mL 6 mmol/L FeSO4、6 mmol/L H2O2和6 mmol/L水楊酸，37℃水浴30 min，于510 nm測吸光值記為A1；用蒸餾水代替口服液樣品測定吸光度記為A0；蒸餾水代替H2O2溶液測定吸光度記為A2，羥自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著，應(yīng)用Origin 9.0及Excel繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 紫薯提取液與桑葚汁質(zhì)量比對感官評分的影響

當(dāng)紫薯提取液和桑葚汁質(zhì)量比為4∶3時(shí)感官評分最高，且風(fēng)味協(xié)調(diào)，顏色呈亮紫黑色；當(dāng)質(zhì)量比小于4∶3時(shí)，口服液桑葚味突出，呈現(xiàn)暗紫色且沉淀較明顯；當(dāng)質(zhì)量比大于4∶3時(shí)，味道偏清淡且具有明顯的熟后“番薯味”，不易被大眾接受。因此紫薯提取液與桑葚汁質(zhì)量比選擇4∶3，此時(shí)風(fēng)味更協(xié)調(diào)。

2.1.2 白砂糖添加量對感官評分的影響

當(dāng)白砂糖添加量為2%～4%時(shí)，感官評分隨白砂糖添加量的增加而升高，此時(shí)紫薯提取液的苦澀味逐漸減弱；當(dāng)白砂糖添加量高于4%時(shí)，感官評分下降，過量添加白砂糖使得紫薯桑葚復(fù)合口服液口感偏甜，不易被大眾接受，同時(shí)也掩蓋了紫薯和桑葚特有風(fēng)味。綜合考慮，選擇白砂糖添加量4%，此時(shí)制得口服液甜度適宜。

2.1.3 檸檬酸添加量對感官評分的影響

當(dāng)檸檬酸添加量高于0.03%時(shí)，感官評分迅速下降，這是因?yàn)檫^大的酸味使得紫薯桑葚復(fù)合口服液原有風(fēng)味遭到破壞，因此選擇檸檬酸添加量0.03%，此時(shí)酸度最適宜。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the orthogonal experiment

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis of orthogonal experiment

由表3試驗(yàn)結(jié)果可知最佳配方為A2B2C1，由表4可知，紫薯提取液與桑葚汁質(zhì)量比、白砂糖添加量對口服液感官品質(zhì)影響較為顯著（p＜0.05）。對正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，感官評分為83.42。因此，可確定該產(chǎn)品最佳配方：紫薯提取液與桑葚汁以質(zhì)量比4∶3復(fù)合、添加量95.98%，白砂糖添加量4%，檸檬酸添加量0.02%，制得的紫薯桑葚復(fù)合口服液口感適宜、風(fēng)味協(xié)調(diào)。

2.3 體外模擬消化過程中活性物質(zhì)變化

2.3.1 總酚含量的變化

模擬消化過程中總酚含量變化見圖1。

圖1 模擬消化過程中總酚含量變化Fig.1 Changes in total phenol content during simulated digestion

如圖1所示，紫薯桑葚復(fù)合口服液在模擬胃液消化 0.5 h時(shí)，總酚含量顯著上升（p＜0.05），0.5 h～1.0 h顯著下降（p＜0.05）后趨于穩(wěn)定，相反，胃酸和胃空白對照組的總酚含量在0.5 h時(shí)顯著下降（p＜0.05）。并且在模擬胃消化2.0 h內(nèi)胃液消化組＞胃酸對照組＞胃空白對照組，這說明胃蛋白酶和酸性條件對紫薯桑葚復(fù)合口服液中多酚的釋放有促進(jìn)作用，這可能是胃蛋白酶能夠分解大分子蛋白質(zhì)，使得某些與蛋白質(zhì)結(jié)合的酚類物質(zhì)得以釋放，此外酸性條件下酚類物質(zhì)易發(fā)生水解，使得酚含量增加[16-17]。在模擬腸消化過程中，0 h時(shí)總酚含量與模擬胃消化相比顯著下降，可能是某些酸性酚類化合物在中性環(huán)境下發(fā)生降解生成了其他物質(zhì)[18]；0～1.0 h 顯著上升（p＜0.05），可能是由于與多糖以酯鍵形式結(jié)合形成糖苷的多酚分子在酶的作用下水解釋放，導(dǎo)致整體酚羥基含量有所上升[19]。

2.3.2 黃酮含量的變化

模擬消化過程中黃酮含量變化見圖2。

圖2 模擬消化過程中黃酮含量變化Fig.2 Changes in flavonoid content during simulated digestion

如圖2所示，模擬胃液消化0～0.5 h黃酮含量顯著上升（p＜0.05），0.5 h～2.0 h趨于穩(wěn)定；胃酸對照組在 1.5 h達(dá)到最大值7.74 mg RE/mL，是初始值的1.06倍；胃空白對照組無顯著變化。這表明胃蛋白酶和胃酸對紫薯桑葚復(fù)合口服液黃酮釋放量均起促進(jìn)作用。模擬腸消化過程中，腸液消化組與腸空白對照組的黃酮變化規(guī)律基本一致。0～0.5 h內(nèi)黃酮含量降低，可能是因?yàn)辄S酮類物質(zhì)在環(huán)境變化情況下不穩(wěn)定所致；0.5 h～1.0 h黃酮含量顯著提高（p＜0.05），推測可能是某些復(fù)合的黃酮類大分子受環(huán)境、胰蛋白酶等影響，分解為黃酮小分子[20]；1.0 h～2.0 h 整體上顯著下降（p＜0.05）可能是損失量大于降解釋放量。

2.3.3 花色苷含量的變化

模擬消化過程中花色苷含量變化見圖3。

圖3 模擬消化過程中花色苷含量變化Fig.3 Changes in anthocyanin content during simulated digestion

如圖3所示，胃液消化組的花色苷含量在1.5 h時(shí)顯著上升（p＜0.05），1.5 h～2.0 h 有所下降，即花色苷含量隨著胃液消化的進(jìn)行先上升后下降，這與Huang等[21]和Tagliazucchi等[22]的研究結(jié)果相似；胃酸對照組和胃空白對照組變化不顯著（p＞0.05），可能由于酸性環(huán)境下胃蛋白酶水解蛋白質(zhì)，促進(jìn)花色苷釋放，這與劉翼翔等[23]研究藍(lán)莓花色苷體外模擬消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。在模擬腸消化過程中，模擬腸消化2.0 h時(shí)腸液消化組花色苷含量下降程度比腸空白對照組更顯著（p＜0.05），這表明腸消化環(huán)境對花色苷含量有顯著影響，因?yàn)橹行詶l件下花色苷不穩(wěn)定易發(fā)生降解。

2.4 模擬胃腸消化過程中抗氧化活性變化

2.4.1 DPPH自由基清除率

模擬消化過程中DPPH自由基清除率變化見圖4。

圖4 模擬消化過程中DPPH自由基清除率變化Fig.4 Changes in DPPH radical scavenging capacity during simulated digestion

如圖4所示，模擬胃消化2 h時(shí)，胃液消化組、胃酸對照組和胃空白對照組DPPH自由基清除率均顯著上升（p＜0.05），且時(shí)胃液消化組＞胃酸對照組＞胃空白對照組，這表明胃蛋白酶以及酸性條件協(xié)同促進(jìn)了DPPH自由基清除能力的提升。結(jié)合圖2～圖4可知，紫薯桑葚復(fù)合口服液在模擬消化過程中黃酮和花色苷含量與DPPH自由基清除能力變化規(guī)律相似，表明模擬胃消化過程中黃酮和花色苷對DPPH自由基清除能力起重要作用。腸液消化組中DPPH自由基清除率在模擬腸消化2 h時(shí)顯著上升（p＜0.05），腸空白對照組顯著下降（p＜0.05），這說明胰酶對DPPH自由基清除能力有一定的影響。

2.4.2 ABTS+自由基清除率

模擬消化過程中ABTS+自由基清除率變化見圖5。

圖5 模擬消化過程中ABTS+自由基清除率變化Fig.5 Changes in ABTS+radical scavenging capacity during simulated digestion

如圖5所示，模擬胃液消化2 h時(shí)，ABTS+自由基清除率在胃液以及胃酸作用下均顯著上升（p＜0.05），胃空白對照組無顯著變化（p＜0.05），胃液消化組和胃酸對照組的ABTS+自由基清除率分別上升到86.87%和84.15%，這表明胃蛋白酶和酸性條件均能夠增強(qiáng)ABTS+自由基清除率。模擬腸消化階段，與0h相比，腸液消化組ABTS+自由基清除率在0.5h～2.0h顯著上升（p＜0.05）；腸空白對照組 2 h時(shí)無顯著差異（p＞0.05），這表明胰蛋白酶和膽汁可增強(qiáng)ABTS+自由基清除能力。

2.4.3 羥自由基清除率

模擬消化過程中羥自由基清除率變化見圖6。

圖6 模擬消化過程中羥自由基清除率變化Fig.6 Changes in hydroxyl radical scavenging capacity during simulated digestion

如圖6所示，胃液消化組在1.0 h時(shí)，羥自由基清除能力顯著上升（p＜0.05）后逐漸趨于穩(wěn)定，胃酸對照組和胃空白對照組在0.5 h內(nèi)顯著下降（p＜0.05）。羥自由基清除能力依次為胃液消化組＞胃酸對照組＞胃空白對照組，說明胃蛋白酶和胃酸環(huán)境對羥自由基清除能力有一定的影響。模擬腸消化階段，腸液消化組0.5 h時(shí)，羥自由基清除能力顯著上升（p＜0.05），在1.5 h后有所下降；腸空白對照組0.5 h時(shí)，顯著下降（p＜0.05），最終腸液消化組的清除能力略高于腸空白對照組，這表明胰蛋白酶和膽汁前期可增強(qiáng)羥自由基清除率，后期受到環(huán)境等多方面影響導(dǎo)致羥自由基清除率下降。觀察圖1、圖4～圖6可知，紫薯桑葚復(fù)合口服液在模擬腸消化過程中總酚含量與DPPH、ABTS+和羥自由基清除能力變化規(guī)律相似，表明模擬腸消化過程中酚類化合物在抗氧化活性中作用效果明顯。

2.5 模擬胃腸消化過程中活性物質(zhì)含量與抗氧化能力之間相關(guān)性分析

活性物質(zhì)含量與抗氧化能力相關(guān)性分析見表5。

表5 活性物質(zhì)含量與抗氧化能力相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between active substance content and antioxidant activity

如表5所示，在模擬胃消化過程中黃酮含量與DPPH自由基清除率、羥自由基清除率相關(guān)性顯著（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.879和0.910，黃酮含量與ABTS+自由基清除率相關(guān)系數(shù)為0.336，說明兩者相關(guān)性不高；花色苷含量與DPPH自由基清除率之間相關(guān)系數(shù)為0.902，兩者相關(guān)性顯著（p＜0.05），花色苷含量與ABTS+、羥自由基清除率相關(guān)系數(shù)分別為0.542和0.821，相關(guān)性不顯著（p＜0.05）。在模擬腸消化階段總酚含量與DPPH、ABTS+及羥自由基清除率呈現(xiàn)良好正相關(guān)性（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為 0.919、0.921和0.924?？偟膩碚f模擬胃消化過程中，胃蛋白酶作用有利于抗氧化活性物質(zhì)釋放，且黃酮與花色苷含量對抗氧化活性貢獻(xiàn)較高，模擬腸消化過程中多酚類化合物在抗氧化活性中起重要作用。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以紫薯和桑葚為主要原料，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了口服液最佳配方：紫薯提取液與桑葚汁以4∶3的質(zhì)量比復(fù)合，按紫薯提取液與桑葚汁復(fù)合添加量95.98%、白砂糖添加量4%、檸檬酸添加量0.02%進(jìn)行調(diào)配時(shí)，口感最佳。采用體外模擬胃腸消化法，檢測口服液活性物質(zhì)釋放規(guī)律。在體外模擬胃消化階段活性物質(zhì)含量總體呈上升趨勢，其中總酚含量上升了1.31%、黃酮含量上升了4.67%、花色苷釋放量提高了2.81%；在體外模擬腸消化階段，總酚含量顯著上升（p＜0.05）。此外經(jīng)過體外模擬消化后，抗氧化能力均有所增強(qiáng)，這表明紫薯桑葚復(fù)合口服液具有較好的抗氧化活性，經(jīng)相關(guān)性分析進(jìn)一步驗(yàn)證了不同消化階段活性物質(zhì)含量與抗氧化能力呈良好的相關(guān)性。此研究對開發(fā)紫薯和桑葚保健類產(chǎn)品具有一定的技術(shù)指導(dǎo)與參考價(jià)值。