裴靜嫻 莫 沛 王月剛

1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科(廣州 510260) 2 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心血管內(nèi)科(廣州 510515)

低氧是心血管疾病發(fā)病過程中一個常見的病理生理因素，特別是在心肌梗死、心力衰竭發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用[1]。HIF-1α 作為調(diào)節(jié)細(xì)胞對低氧適應(yīng)性反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過與低氧反應(yīng)元件(hypoxia responsive element,HRE)核心DNA序列5′-RCGTG- 3′結(jié)合激活基因轉(zhuǎn)錄[2]，從而調(diào)節(jié)多種下游靶基因的表達，參與了紅細(xì)胞生成、鐵代謝、葡萄糖代謝、血管生成、細(xì)胞增殖與凋亡等多種生理病理過程[3- 4]。

p53RFP是調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的一個重要基因[5]，最初被鑒定為受p53調(diào)控的基因，其產(chǎn)物具有E3泛素連接酶活性，通過泛素化降解細(xì)胞周期調(diào)控因子p21WAF1/CIP1 參與細(xì)胞增殖和凋亡。生物信息學(xué)分析顯示p53RFP啟動子區(qū)域存在多個低氧反應(yīng)元件，而p53RFP基因表達是否受低氧的調(diào)控尚未見相關(guān)報道。因此，本研究擬觀察低氧對p53RFP基因表達及p53RFP啟動子活性的影響，并探索HIF-1α潛在的結(jié)合位點HRE在低氧調(diào)控p53RFP基因啟動子活性中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞

HEK293細(xì)胞、E.coli DH5α 由本課題組保存，pGL3-p53RFP 載體由本課題組前期構(gòu)建；pRL-SV40、雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；定向突變試劑盒購于Stratagene公司；Lipofectamine 2000、TRIzol、質(zhì)粒中提試劑盒均購于Invitrogen公司；質(zhì)粒小提取試劑盒購自Biomiga公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司；熒光定量PCR試劑盒購自 Roche公司；ECL發(fā)光試劑盒、 PVDF膜購自Millipore公司；兔抗HIF-1α多克隆抗體購自Abcom公司；小鼠抗p53RFP單克隆抗體購自Abnova公司；小鼠抗β-actin 單克隆抗體、羊抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗均購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 低氧對HEK293細(xì)胞p53RFP mRNA及蛋白表達的影響 將HEK293細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液、計數(shù)，以4×105細(xì)胞總數(shù)接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2，21% O2)培養(yǎng)24小時，細(xì)胞換新鮮培養(yǎng)基。將細(xì)胞置入低氧培養(yǎng)箱(37 ℃，1% O2，5% CO2，94% N2)分別培養(yǎng)0、3、6、12小時，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。

1.2.1.1 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達 以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒，以β-actin基因為內(nèi)對照，行 Real-time PCR，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。引物序列如下：p53RFP 上游5′CATCTGGACCCCTACCGAACA 3′,下游5′ACACGAGCAGAATTTCAGGTG3′；β-actin 上游5′CAAATGCTTCTAGGCGGA CTATG 3′，下游5′TGCGCAAGTTAG GTTTTGTCA 3′。

1.2.1.2 Western blot 檢測蛋白表達 將蛋白加入SDS加樣緩沖液，100 ℃加熱5 min，取20 μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，依次5%脫脂牛奶封閉2～3 h， 一抗(HIF-1α稀釋比例為1:700；p53RFP稀釋比例為1:500；β-actin稀釋比例為1:1000)孵育過夜，TBST 洗 膜10 min×3次，二抗(稀釋比例為1:10000)室溫孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3次，ECL發(fā)光。

1.2.2 構(gòu)建突變型p53RFP啟動子熒光素酶報告基因載體 p53RFP啟動子區(qū)域-1118/-1115 、-636/-633存在2個低氧反應(yīng)元件特征序列，我們將可能的HRE核心序列5′-RCGTG- 3′分別突變成RTACA，構(gòu)建p53RFP啟動子HRE單突變型(pGL3-p53RFPM)或雙突變型熒光素酶報告基因載體(pGL3-p53RFPM2)。以野生型p53RFP啟動子1230bp截短片段的熒光素酶報告基因載體(pGL3-p53RFP)為模板，設(shè)計針對 -1118/-1115 區(qū)域HRE 突變引物，引物序列如下：上游引物5′GGTGCCTGTTGGTACACACAGATCCTTTCC 3′；下游引物：5′GGAAAGGATCTGTGTGTACCAACAGG-CACC3′，按照定點突變試劑盒操作說明，PCR擴增突變DNA。PCR結(jié)束后，向擴增產(chǎn)物中加入2 μL Dpn I，37 ℃水浴5分鐘，切掉未突變的超螺旋雙鏈DNA。將Dpn I處理的DNA轉(zhuǎn)化超級感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂Amp+LB培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)14～16 h。挑取單克隆，接種至LB液體培養(yǎng)基，小提質(zhì)粒，送華大基因公司測序。

以-1118/-1115 區(qū)域HRE 突變成功的p53RFP 啟動子熒光素酶報告基因載體(pGL3-p53RFPM)為模板，設(shè)計針對- 636/- 633 HRE位點的突變引物，引物序列如下：上游引物5′CAGTTGTCTGCCATACAGGAAGGCAGGTC3′；下游引物5′GACCTG CCTTCCTGTATGGCAGACAACTG3′，構(gòu)建HRE雙突變型啟動子報告基因(pGL3-p53RFPM2)。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測低氧對p53RFP基因啟動子活性的影響 按照Lipofectamine 2000操作說明，將250 ng野生型及突變型p53RFP啟動子熒光素酶報告載體分別轉(zhuǎn)染48孔細(xì)胞培養(yǎng)板的HEK293細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染25 ng pRL-SV40作為內(nèi)參，以pGL3-Basic轉(zhuǎn)染組作為陰性對照。分別置于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱及低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24小時后收集細(xì)胞，應(yīng)用雙熒光素酶檢測試劑盒，經(jīng)化學(xué)法發(fā)光儀檢測螢火蟲及海蜃光子數(shù)，以螢火蟲光子數(shù)與海蜃光子數(shù)的比值作為相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 低氧對HEK293細(xì)胞p53RFP及HIF-1α基因表達的影響

實時熒光定量PCR檢測低氧對HEK293細(xì)胞p53RFP mRNA表達的影響，結(jié)果顯示：低氧處理不同時間點p53RFP mRNA 表達水平均顯著增加(F=96.493,P<0.001)，與低氧0 h組相比，低氧培養(yǎng)3 h、6 h、12 h的p53RFP mRNA表達水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.01，<0.001,<0.001)，見圖1A。

Western blot 檢測低氧對HEK293細(xì)胞p53RFP及HIF-1α蛋白表達的影響，結(jié)果顯示：與常氧組相比，低氧組不同時間點p53RFP及HIF-1α蛋白表達水平均明顯上調(diào)，且呈時間依賴性遞增趨勢,見圖1B。

圖1 低氧對p53RFP 基因表達表達的影響條帶旁邊標(biāo)注蛋白大小注：A，熒光定量PCR檢測低氧處理不同時間p53RFP mRNA表達水平的變化，與0小時相比， **P<0.01， ***P<0.001；B，Western blot 檢測低氧處理不同時間p53RFP及HIF-1α蛋白表達水平的變化

2.2 突變型p53RFP基因啟動子熒光素酶報告基因載體構(gòu)建

基因測序結(jié)果經(jīng)NCBI 基因序列對比，結(jié)果顯示pGL3-p53RFPM 單突變載體啟動子區(qū)域-1118/-1115 HRE核心序列5′-RCGTG- 3′突變成RTACA，pGL3-p53RFPM雙突變載體啟動子區(qū)域-1118/-1115 、-636/-633 HRE核心序列5′-RCGTG- 3′均突變成RTACA，證明HRE單突變型(pGL3-p53RFPM)及雙突變型(pGL3-p53RFPM2)熒光素酶報告基因載體構(gòu)建成功。載體示意圖見圖2，測序結(jié)果見圖3。

圖2 p53RFP基因啟動子熒光素酶報告載體示意圖

2.3 低氧對p53RFP基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示：與常氧組野生型p53RFP啟動子活性相比，低氧組野生型p53RFP基因啟動子活性顯著增加(t=-19.504,P<0.001)，盡管低氧仍能增加pGL3-p53RFPM及pGL3-p53RFPM2 啟動子活性，但低氧條件下，HRE單突變或雙突變均較野生型p53RFP啟動子活性顯著下降(F=160.891,P<0.001)。

圖3 突變型p53RFP基因啟動子熒光素酶報告基因載體測序結(jié)果 注：A:pGL3-p53RFPM 測序結(jié)果，-1118/-1115 HRE(CGTG)突變?yōu)門ACA(下劃線處)； B、C: pGL3-p53RFPM2測序結(jié)果，-1118/-1115 及- 636/- 633HRE(CGTG)均突變?yōu)門ACA(下劃線處)

圖4 低氧對野生型及突變型p53RFP啟動子活性的影響注：與常氧組pGL3-p53RFP啟動子活性比較， ***P<0.001；與低氧組pGL3-p53RFP啟動子活性比較， ###P <0.001

3 討 論

低氧是機體最常見的病理生理過程，大多數(shù)情況下，短暫的缺氧和HIF-1α低氧信號通路的激活是有益的。然而，在某些慢性損傷、慢性缺氧及病理修復(fù)的情況下，低氧途徑的激活可能導(dǎo)致組織纖維化及器官功能損傷[6]。大量研究表明低氧通過介導(dǎo)HIF-1α的穩(wěn)定表達在急性心肌缺血中減輕梗死面積、保護心功能。但也有證據(jù)表明在慢性缺血中HIF-1α的長期激活可促進心肌重構(gòu)和心功能惡化。動物實驗顯示HIF-1α的持續(xù)激活可能參與了缺血性心肌病的發(fā)病過程，同樣在慢性缺血性心肌病患者的尸檢組織中也檢測到了心肌HIF-1α蛋白的高表達[10]。同樣，低氧也是心臟肥厚的病理特征，有研究表明HIF-1α參與了壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚[11]。此外，Lei等構(gòu)建了心肌細(xì)胞特異性 VHL基因缺失小鼠，結(jié)果顯示VHL基因缺失小鼠嚴(yán)重心衰的發(fā)生與HIF-1α的持續(xù)表達直接相關(guān)[12]。因此， HIF-1α在急性心肌缺血中既發(fā)揮了心臟保護作用，也可能參與了心梗后續(xù)心衰的發(fā)生發(fā)展過程。然而，HIF-1α通過激活哪些信號通路參與了缺血性心肌病的發(fā)病過程目前尚不明確。

p53RFP是受p53家族成員調(diào)控的一個基因，具有E3泛素連接酶活性。研究表明p53RFP 通過泛素化降解Bax、p21、p63，在調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用。我們的研究顯示低氧可促進p53RFP mRNA及蛋白表達增加，其mRNA表達上調(diào)更加顯著，提示低氧對p53RFP基因表達的調(diào)控可能主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。同時，低氧條件下，HIF-1α與p53RFP蛋白表達趨勢均呈時間依賴性。生物信息學(xué)分析顯示p53RFP基因啟動子區(qū)域存在多個低氧反應(yīng)元件。因此，我們推測低氧可能通過HIF-1α介導(dǎo)了p53RFP基因轉(zhuǎn)錄激活。

為此，本研究在野生型p53RFP雙熒光素酶報告載體的基礎(chǔ)上[15]，構(gòu)建了低氧反應(yīng)元件突變型的p53RFP雙熒光素酶報告載體。我們通過雙熒光素酶報告基因檢測了低氧對野生型及突變型p53RFP啟動子活性的影響，結(jié)果顯示低氧可顯著增加野生型p53RFP基因啟動子活性，HRE單突變或雙突變后，p53RFP啟動子活性顯著下降。以上研究結(jié)果表明低氧可能通過啟動子區(qū)域的低氧反應(yīng)元件調(diào)控p53RFP基因表達，p53RFP啟動子區(qū)域位點的-1118/-1115、- 636/- 633 位點的低氧反應(yīng)元件可能是HIF-1α潛在的結(jié)合位點，提示p53RFP可能是HIF-1α直接調(diào)控的一個靶基因。因此，我們推測p53RFP作為調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的一個重要基因，可能參與了低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷過程。

綜上所述，本研究首次表明低氧可能通過HIF-1α介導(dǎo)了對p53RFP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。野生型及突變型p53RFP雙熒光素酶報告基因載體的成功構(gòu)建，為下一步深入研究低氧調(diào)控p53RFP的分子機制及生物學(xué)效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。