陳凱，朱瑩

湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是常見的胃腸道慢性炎癥性疾病，近年來發(fā)病率逐年上升[1]，且呈現年輕化趨勢，給患者生活質量造成嚴重影響。UC病情纏綿難愈，且易復發(fā)，腸道炎癥狀態(tài)日久有并發(fā)結直腸癌的風險。

現代醫(yī)學認為，UC與遺傳、機體免疫、腸道微生態(tài)等密切相關[1-2]，病理表現為局部炎性細胞浸潤，黏膜糜爛，散在性潰瘍。白細胞介素（IL）是由多種細胞產生并參與機體多種生理病理反應的細胞因子。研究表明，IL-13、IL-6分泌量與腸道炎癥水平呈正相關，而抗炎因子IL-10與腸道炎癥水平呈負相關[3-4]。凋亡作為一種細胞程序性死亡方式，能夠加重腸道炎癥，進一步誘導腸道上皮細胞凋亡，二者相互影響[5-7]。JAK-STAT信號通路與細胞增殖、凋亡、分化等密切相關，IL-13、IL-6等細胞因子均能通過JAK-STAT信號通路進行轉導，從而調控下游靶基因表達，影響UC病情[8-9]。

課題組前期以三硝基苯磺酸（TNBS）誘導UC大鼠模型，采用潰結寧膏進行干預，發(fā)現其能降低IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α等細胞因子分泌[10]?；诖?，本實驗以脂多糖（LPS）誘導人結腸癌HT-29細胞炎癥模型，采用潰結寧膏穴位敷貼血清進行干預，觀察其對HT-29細胞炎癥反應及凋亡的影響，從JAK-STAT信號通路探討其作用機制，為潰結寧膏治療UC提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞

6～8周齡SD雄性大鼠18只，體質量180～220 g，湖南斯萊克景達實驗有限公司提供，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物房，本實驗經湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批（ZYFY20190814-1）。HT-29細胞，中國科學院細胞庫。

1.2 藥物及試劑

潰結寧膏穴位敷貼（炮附子、細辛、丁香、芥子、延胡索、赤芍、生姜按1∶1∶1∶1∶1∶1∶2比例組成），湖南省中醫(yī)院制備；柳氮磺吡啶（SASP）腸溶片，批號09190501，上海信誼。McCoy” s 5a培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素（雙抗）、胰蛋白酶，批號分別為PM150710、164210-50、PB180120、PB180226，武漢普諾賽；TUNEL試劑盒，批號40306ES50，上海翊圣生物；mRNA反轉錄試劑盒，批號CW2569，北京康為世紀；Trizol，批號15596026，美國Thermo；信號傳導與轉錄激活因子（STAT）3抗體，批號ab31370，英國Abcam；p-STAT3抗體，批號ab76315，英國Abcam；Janus激酶（JAK）2抗體，批號ab39636，英國Abcam；JAK1抗體，批號ab133666，英國Abcam；HRP標記山羊抗小鼠IgG，批號SA00001-1，美國Proteintech；HRP標記山羊抗兔IgG，批號SA00001-2，美國Proteintech；電泳緩沖液，批號AWB0083，長沙艾碧維；蛋白酶抑制劑，批號583794，北京金泰宏達；顯影液，批號BW-61，上海佳信；CCK8試劑盒，批號C0009，上海碧云天；IL-6、IL-10、IL-13試劑盒，批號分別為CSB-E08008r、CSB-E08005r、CSB-E08006r，武漢華美生物工程有限公司。

1.3 主要儀器

搖床（型號TS-92，海門其林貝爾），恒溫箱（型號DYY-6C，北京貝一），熒光顯微鏡（型號BA410T，廈門Motic），臺式冷凍離心機（型號H1650R，湖南湘儀），熒光定量PCR儀（型號PIKOREAL96，美國Thermo），生物樣品均質儀（型號BioPrep-24，杭州奧盛），電泳儀（型號DYY-6C，北京六一），電泳槽（型號DYCZ-24DN，北京六一），化學發(fā)光成像系統(tǒng)（型號ChemiScope6100，上海勤翔）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)及造模

HT-29細胞用McCoy” s 5a完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗）置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數生長期細胞，胰蛋白酶消化制成細胞懸液，以1×105個/mL接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中貼壁過夜，加入1 μg/mL LPS處理24 h建立炎癥模型。ELISA檢測細胞培養(yǎng)液IL-6、IL-13含量，高于對照組（不加LPS處理）表明造模成功。

2.2 含藥血清制備

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為空白組、穴位敷貼組和SASP組，每組6只?？瞻捉M予生理鹽水灌胃，穴位敷貼組予生理鹽水灌胃及潰結寧膏穴位敷貼，具體穴位及操作參考課題組前期研究[10]，1次/d，2 h/次，每次貼于一側，左右交替，連續(xù)14 d。SASP組予10 mg/mL SASP灌胃，灌胃體積5 mL/kg。末次給藥2 h后腹主動脈采血，室溫靜置2 h，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，吸取血清，滅菌、過濾后于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 含藥血清濃度篩選

將HT-29細胞按5×104個/mL接種至96孔板，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細胞分為空白組、模型組、5%空白血清組、10%空白血清組、15%空白血清組、5%潰結寧膏血清組、10%潰結寧膏血清組、15%潰結寧膏血清組，每組4個復孔，除空白組外，加入含1 μg/mL LPS的完全培養(yǎng)基處理24 h。棄去培養(yǎng)基，更換含相應濃度血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK8試劑10 μL，培養(yǎng)箱中孵育2 h，以不含細胞、只加培養(yǎng)基孔作為空白對照，酶標儀450 nm波長檢測各孔吸光度（OD值），計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白對照OD值）÷（空白組OD值-空白對照OD值）×100%。

2.4 分組及干預

篩選出最佳含藥血清濃度后，將細胞分為空白組、模型組、空白血清組、潰結寧膏血清組和SASP血清組，加入含1 μg/mL LPS的完全培養(yǎng)基處理24 h，更換相應濃度血清繼續(xù)培養(yǎng)24 h。空白血清組和SASP含藥血清組使用與潰結寧膏血清組相同濃度的血清進行干預，空白組和模型組均使用完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

2.5 CCK8法檢測

將HT-29細胞按5×104個/mL接種至96孔板，每孔100 μL，按“2.4”項下方法處理，加入CCK8試劑孵育2 h，檢測各孔OD值并計算細胞存活率。

2.6 TUNEL染色

在24孔板中制作細胞爬片，按“2.4”項下方法處理，細胞爬片用多聚甲醛進行固定，依次加入Proteinase K工作液、TdT酶反應液、Streptavidin-TRITC標記工作液，DAPI工作液染細胞核，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，計算細胞凋亡率（凋亡細胞數÷總細胞數×100%）。

2.7 ELISA檢測

收集培養(yǎng)后的細胞上清液，按試劑盒說明書檢測IL-6、IL-10、IL-13含量。

2.8 RT-PCR檢測

收集HT-29細胞，使用Trizol、三氯甲烷、異丙醇提取細胞總RNA，紫光分光光度計測定RNA濃度和純度。配制反轉錄反應體系，將RNA反轉錄為cDNA，PCR進行定量擴增，2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.9 Western blot檢測

收集HT-29細胞，預冷RIPA裂解液裂解，BCA法測定蛋白濃度，配制10%分離膠和4.8%濃縮膠，樣本煮沸備用。75 V電泳至溴酚藍到達分離膠底部時停止電泳，200 mA轉膜1.5 h，5%脫脂奶粉封閉90 min，加入JAK2一抗（1∶750）、STAT3一抗（1∶750）、p-STAT3一抗（1∶5 000）、JAK1一抗（1∶2 000）、β-actin一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。膜室溫放置30 min，加入HRP標記山羊抗小鼠 IgG（1∶5 000）、HRP標記山羊抗兔IgG（1∶6 000），室溫孵育60 min，ECL顯色液顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)成像，使用Image J軟件進行分析，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）灰度值比值計算蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析。數據以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 潰結寧膏穴位敷貼血清濃度篩選

與空白組比較，模型組和各濃度血清組細胞存活率明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，5%、10%、15%空白血清組細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），5%、10%、15%潰結寧膏血清組細胞存活率明顯升高（P＜0.05）；與5%、15%潰結寧膏血清組比較，10%潰結寧膏血清組細胞存活率明顯升高（P＜0.05）。見表2。因此用10%潰結寧膏血清進行后續(xù)實驗。

表2 不同血清濃度的HT-29細胞存活率比較（，%）

表2 不同血清濃度的HT-29細胞存活率比較（，%）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與10%潰結寧膏血清組比較，&P＜0.05

細胞存活率100.00±7.50 50.94±3.73*54.72±5.44*60.43±3.75*57.34±4.38*70.33±1.84*#&84.39±5.71*#66.74±3.95*#&組別空白組模型組5%空白血清組10%空白血清組15%空白血清組5%潰結寧膏血清組10%潰結寧膏血清組15%潰結寧膏血清組n 4 4 4 4 4 4 4 4

4.2 潰結寧膏對HT-29細胞存活率的影響

與空白組比較，模型組和不同血清組細胞存活率明降低（P＜0.05）；與模型組和空白血清組比較，潰結寧膏血清組和SASP血清組細胞存活率明顯升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組HT-29細胞存活率比較（，%）

表3 各組HT-29細胞存活率比較（，%）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與空白血清組比較，&P＜0.05

細胞存活率100.00±5.00 57.22±4.67*61.46±1.92*83.26±3.78*#&86.58±5.03*#&組別空白組模型組空白血清組潰結寧膏血清組SASP血清組n 4 4 4 4 4

4.3 潰結寧膏對HT-29細胞凋亡的影響

與空白組比較，模型組和空白血清組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組和空白血清組比較，潰結寧膏血清組和SASP血清組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。見圖1、表4。

表4 各組HT-29細胞凋亡率比較（，%）

表4 各組HT-29細胞凋亡率比較（，%）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與空白血清組比較，&P＜0.05

組別空白組模型組空白血清組潰結寧膏血清組SASP血清組n 5 5 5 5 5細胞凋亡率3.68±0.46 11.28±1.51*9.49±1.72*4.29±0.56#&4.24±0.61#&

圖1 各組HT-29細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，×200）

4.4 潰結寧膏對HT-29細胞上清液白細胞介素-6、白細胞介素-10、白細胞介素-13含量的影響

與空白組比較，模型組和空白血清組細胞上清液IL-6、IL-13含量明顯增加，IL-10含量明顯減少（P＜0.05）；與模型組和空白血清組比較，潰結寧膏血清組和SASP組細胞上清液IL-6、IL-13含量明顯減少（P＜0.05），IL-10含量明顯增加（P＜0.05）。見表5。

表5 各組HT-29細胞上清液IL-6、IL-10、IL-13含量比較（，pg/mL）

表5 各組HT-29細胞上清液IL-6、IL-10、IL-13含量比較（，pg/mL）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與空白血清組比較，&P＜0.05

組別空白組模型組空白血清組潰結寧膏血清組SASP血清組IL-13 20.72±1.64 39.41±4.36*36.39±5.10*25.17±2.97#&23.49±3.37#&n 5 5 5 5 5 IL-6 25.12±3.05 53.41±3.52*47.19±2.74*31.17±6.09#&29.49±4.18#&IL-10 36.49±7.63 20.40±2.63*22.80±2.93*33.49±5.99#&31.80±4.24#&

4.5 潰結寧膏對 HT-29 細胞 JAK1、JAK2、STAT3、STAT6基因表達的影響

與空白組比較，模型組和空白血清組細胞JAK1、JAK2、STAT3、STAT6基因表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組和空白血清組比較，潰結寧膏血清組和SASP血清組細胞JAK1、JAK2、STAT3、STAT6基因表達明顯降低（P＜0.05）。SASP血清組和潰結寧膏血清組各指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表6。

表6 各組HT-29細胞JAK1、JAK2、STAT3、STAT6基因表達比較（）

表6 各組HT-29細胞JAK1、JAK2、STAT3、STAT6基因表達比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與空白血清組比較，&P＜0.05

組別空白組模型組空白血清組潰結寧膏血清組SASP血清組STAT6 1.35±0.41 7.31±1.36*5.62±0.77*2.76±1.01#&2.50±0.86#&n 5 5 5 5 5 JAK1 1.07±0.15 4.00±0.72*3.47±0.28*1.82±0.51#&1.71±0.39#&JAK2 1.29±0.22 3.80±0.91*3.35±0.71*2.06±0.41#&1.81±0.41#&STAT3 1.01±0.20 3.80±0.51*3.27±0.42*1.76±0.52#&1.67±0.38#&

4.6 潰結寧膏對 HT-29細胞 JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組和不同血清組細胞JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組和空白血清組比較，潰結寧膏血清組和SASP血清組細胞JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖2、表7。

表7 各組HT-29細胞JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達比較（）

表7 各組HT-29細胞JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與空白血清組比較，&P＜0.05

組別空白組模型組空白血清組潰結寧膏血清組SASP血清組p-STAT3 0.21±0.02 0.55±0.03*0.52±0.02*0.38±0.03*#&0.34±0.03*#&n 5 5 5 5 5 JAK1 0.21±0.02 0.70±0.03*0.59±0.07*#0.37±0.06*#&0.38±0.06*#&JAK2 0.20±0.01 0.71±0.03*0.64±0.08*0.44±0.04*#&0.36±0.04*#&STAT3 0.20±0.01 0.70±0.02*0.65±0.08*0.47±0.03*#&0.37±0.03*#&

圖2 各組HT-29細胞JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白免疫印跡

5 討論

UC屬中醫(yī)學“泄瀉”“痢疾”等范疇，病變早期以濕熱蘊結為主，病情纏綿難愈，久病損傷機體陽氣，高齡患者常兼有不同程度陽虛表現[11]。脾為倉廩之官，主飲食與水液代謝，水液代謝失衡，液體不循腸道，故出現腹瀉。脾為后天之本，腎為先天之本，后天陽氣病久影響先天陽氣，故脾腎陽氣虧虛是UC常見病機。陽氣虛弱，血液運行不暢，氣血瘀阻，通則不痛，故出現腹部疼痛不適。中藥穴位敷貼通過藥物刺激機體經絡穴位，使皮膚血管擴張，促進藥物吸收入血，進而調節(jié)機體功能，對改善UC患者腹痛、腹瀉等癥狀具有一定作用[12-13]。潰結寧膏由課題組負責人朱瑩教授根據UC脾腎陽虛證病機研制，由炮附子、細辛、丁香、芥子、延胡索、赤芍、生姜組成，具有溫脾補腎、活血化瘀之效。前期研究表明，潰結寧膏治療脾腎陽虛型UC臨床效果顯著[14-15]。動物實驗表明，潰結寧膏穴位敷貼能通過抑制結腸黏膜炎癥反應，進而控制UC病情發(fā)展[10]。

IL-6最初被發(fā)現是作為調節(jié)IgG產生的B細胞刺激因子，可由巨噬細胞、淋巴細胞、腫瘤細胞等一系列細胞產生，在先天免疫和適應性免疫中發(fā)揮多效性活性。IL-6作為重要的促炎因子，其表達量與UC嚴重程度呈正相關。采用IL-6拮抗劑托珠單抗進行治療能夠有效緩解UC患者癥狀體征，改善內鏡評分[16-18]。IL-13在Th2免疫應答中發(fā)揮關鍵作用，被認為與腸道疾病有關[19]。IL-13由Th2細胞、自然殺傷T細胞、先天淋巴細胞和先天免疫細胞產生，有助于觸發(fā)和維持慢性特發(fā)性腸道炎癥。同時IL-13能促進UC腸道上皮細胞凋亡，破壞腸道黏膜屏障。IL-10具有廣泛的抗炎作用，通過抑制炎癥反應和促炎因子釋放，從而參與機體炎癥反應的多個階段。研究表明，IL-10對維持腸道穩(wěn)態(tài)、調節(jié)機體免疫平衡具有重要作用[3，20]。UC病變組織上皮細胞凋亡程度明顯高于正常組織，上皮細胞凋亡導致腸道屏障破壞，腸道微生物紊亂，加重腸道炎癥反應，加重UC病情[21-22]。JAK-STAT信號通路對調節(jié)IL-6、IL-13、IL-10等炎癥因子傳導及腸道黏膜細胞凋亡有重要作用，抑制JAK-STAT信號通路活性可有效降低UC炎癥因子分泌及腸道細胞凋亡[23-25]。

HT-29細胞是研究UC病理或藥理機制的常用細胞之一，可以模擬UC相關炎癥及凋亡因子分泌，已被用于UC體外實驗多年，其可靠性已得到驗證[26-28]。本實驗結果顯示，造模后細胞上清液IL-6、IL-13含量增加，表明炎癥模型制備成功。采用潰結寧膏穴位敷貼血清進行干預，能增加HT-29細胞存活率，抑制細胞凋亡及減少促炎因子分泌，增加抗炎因子分泌，從而發(fā)揮抗炎作用。進一步檢測JAK-STAT信號通路相關基因和蛋白表達發(fā)現，潰結寧膏能夠降低細胞JAK1、JAK2、STAT3、STAT6基因及JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達，提示其可能通過抑制JAK-STAT信號通路發(fā)揮治療UC作用。

綜上所述，潰結寧膏可能通過降低JAK-STAT信號通路活性抑制HT-29細胞炎癥反應及凋亡。本課題組從體外UC炎癥角度出發(fā)，為潰結寧膏穴位敷貼的臨床應用及UC的治療提供實驗依據。