李志明，許海濤，高玉平，蔡德霖，王相國，肖龍菲，安 紅，王穎秋，王 騫，郭 勇，齊曉龍，倪和民

（1北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，北京 102206；2全國畜牧總站，北京 100125；3天津市薊州區(qū)下倉鎮(zhèn)人民政府，天津 301905）

0 引言

在現(xiàn)代規(guī)模化牧場管理中，提高奶牛單產(chǎn)量，盡早診斷出奶牛妊娠可以有效縮短配種期，保證奶牛具有持久泌乳高峰期及較短的空懷周期，從而增加產(chǎn)奶量，提高經(jīng)濟效益[1]。目前確定奶牛妊娠的方法主要有以下幾種：直腸觸診法、B超檢查法、孕酮檢測法，但都有其不可避免的弊端。直腸觸診法操作簡單，成本低，但會造成一定比例的胚胎損失（胚胎死亡、胎兒死亡以及誤診）[2]；B超檢查在人工授精30天之后方可進行準確診斷妊娠，但由于儀器價格較高，體積較大等原因，難以廣泛應用于生產(chǎn)實踐中[3]；孕酮濃度雖然隨發(fā)情周期而變化，但脂肪也會對其造成嚴重干擾，因而無法準確確定是否妊娠[4]。因此，建立一種新的方法在早期確定奶牛妊娠與否至關(guān)重要。

牛妊娠相關(guān)糖蛋白(Pregnancy-associated glycoproteins，PAGs)在胎兒胎盤的滋養(yǎng)層雙核細胞與母體子宮上皮細胞融合時，會釋放到母畜血液中[5]，與未孕奶牛在28天后的血液檢測量相比有顯著增高，并在臨近分娩前達到最高水平。目前，boPAGs基因家族至少有22個轉(zhuǎn)錄本以及變異體，根據(jù)前人的研究將boPAGs分為2類：古代PAGs和現(xiàn)代PAGs[6]。Green等[7]用核糖核酸酶保護實驗檢測胎盤中boPAGs RNA的表達 ，發(fā)現(xiàn) boPAG2、boPAG4、boPAG5、boPAG8、boPAG9、boPAG10、boPAG11在妊娠后25天就已經(jīng)表達；boPAG1從授精后濃度遞增，并且在授精后第240天達到峰值[8]，但由于其半衰期長（＞8天），其免疫反應性在產(chǎn)后80～100天仍可檢測到，容易影響產(chǎn)后早期奶牛妊娠診斷的準確性[9-10]。Telugu等[11]在基因水平檢測中發(fā)現(xiàn)boPAG2比其他boPAGs蛋白的轉(zhuǎn)錄水平都高，表明boPAG2在奶牛妊娠早期發(fā)揮重要作用。boPAG4的半衰期為4.3天，相比于boPAG1的半衰期較短，且在妊娠早期（24～28天）就能被檢測到[12-14]。boPAG6在妊娠早期表達，在妊娠末期（約250天）消失，其半衰期相對較短，以boPAG6作為標志物應用于母牛早期妊娠診斷的準確性更高，且不易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象[7]。

研究表明通過免疫學方法檢測boPAGs與B超結(jié)果符合率非常高，且能夠在配種后30天即可獲得是否懷孕的結(jié)果，已經(jīng)被廣泛應用[15-16]。目前常用的早期妊娠 檢 測 蛋 白 主 要 有 PAG1、PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、PAG18、PAG19等[14,17]，但是有關(guān)抗體的研究僅涉及到boPAG1、boPAG2和boPAG4，針對PAG6多克隆抗體研究的報道在國內(nèi)尚未出現(xiàn)。本試驗利用前期制備的牛妊娠相關(guān)糖蛋白PAG6多克隆抗體制備快速檢測試紙條，為奶牛妊娠的早期診斷提供了方法，為獸醫(yī)的臨床診斷提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

索萊寶公司：PVDF膜、NC膜、牛血清白蛋白(BSA)、5% BSA封閉液；碧云天公司：DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒、PBS；康為世紀公司：HRP標記山羊抗小鼠lgG；泉州科諾迪生物科技有限公司：牛妊娠相關(guān)糖蛋白(PAGs)ELISA檢測試劑盒；實驗室制備的PAG6多克隆抗體。試驗于2020年9月—2021年6月在北京農(nóng)學院動科樓511實驗室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 快速檢測試紙條的制備 分別用水、PBS、含1% BSA的PBS將PAG6多克隆抗體稀釋至2～50 μg/mL。將不同稀釋度的抗體分別點樣至固定載體上，每滴10μL，分別在不同條件下進行固定。隨后在37℃溫箱中進行封閉，60 min后使用PBST清洗試紙條5 min。

1.2.2 檢測方法的建立 先將待檢血清樣品進行倍比稀釋，吸取10 μL滴加至點樣孔，分別于不同條件下進行孵育，孵育后PBST清洗芯片3次，每次3 min。隨后，使用山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)的二抗在37℃溫箱中對試紙條進行孵育1 h，孵育后PBST清洗3次，每次3 min。最后，分別選用DAB、TMB和ECL顯色液進行顯色，肉眼觀察檢測結(jié)果。

1.2.3 檢測試紙條的布局 根據(jù)優(yōu)化條件，對檢測試紙條進行點樣，每組3個重復，制備3×3檢測試紙條矩陣。

1.2.4 判定標準的確定 肉眼下，檢測試紙條監(jiān)測點顯色較深即可視為懷孕奶牛。

1.2.5 敏感性驗證 將待檢血清進行檢測試紙條檢測，同時使用商品化的PAG試劑盒進行檢測，最后將所獲得的檢測結(jié)果相比較。

1.2.6 特異性驗證 取1組制備好的檢測試紙條，分別檢測未孕奶牛血清、懷孕奶牛血清和二者的混合血清，檢測在不同血清的顯色效果。

1.2.7 重復性驗證 在3個不同時間點，每次制備3組快速檢測試紙條，對同一批臨床血清進行檢測。

1.2.8 穩(wěn)定性驗證 將同一批制備的檢測試紙條分別于不同條件下保存數(shù)周后，取待檢血清進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。試驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體固定載體的選擇

抗體分別選用NC膜、PVDF膜2種載體進行固定，結(jié)果如圖1所示，抗體均能夠固定于上述2種載體上，且均可與血清中的蛋白進行良好反應，但考慮到肉眼觀察效果，最終確定NC膜為最適蛋白固定載體。

圖1 抗體固定載體的選擇

2.2 點樣緩沖液的選擇

抗體分別選取無菌水、PBS和含1%BSA的PBS進行稀釋，結(jié)果如圖2所示，抗體在3種點樣緩沖液稀釋下均有明顯顯色反應，其中以PBS組效果最好。因此，本研究選擇PBS作為點樣緩沖液。

圖2 點樣緩沖液的選擇

2.3 抗體點樣濃度的選擇

選取PBS作為抗體稀釋液，使用3種濃度的稀釋液進行試驗。如圖3所示，抗體在50 μg/mL和10 μg/mL條件下有明顯顯色反應。但考慮成本，最終確定10 μg/mL為最適抗體點樣濃度。

圖3 抗體點樣濃度的選擇

2.4 抗體固定條件的選擇

本研究分別設計4種抗體固定條件：37℃30 min、37℃ 60 min、25℃ 2 h、4℃ 8 h。結(jié)果如圖4所示，抗體在37℃60 min和37℃30 min條件下效果均較好?？紤]到時間成本，最終選擇37℃30 min作為最佳抗體固定條件。

圖4 抗體固定條件的選擇

2.5 封閉劑種類的選擇

以PBS作為陰性對照，分別選取5%BSA和5%脫脂乳2種封閉劑進行試驗。如圖5所示，抗體在2種封閉劑條件下顯色效果均較好，但考慮試劑成本后，確定5%脫脂乳為最佳封閉劑。

圖5 封閉劑種類的選擇

2.6 待檢血清孵育條件的選擇

將未孕奶牛和懷孕奶牛血清滴加至檢測試紙條后分別在37℃溫箱中孵育30 min、60 min、25℃溫箱中孵育2 h、4℃冰箱中孵育8 h。如圖6所示，考慮到顯色效果和檢測時間后，確定37℃孵育60 min效果最好。

圖6 待檢血清孵育條件的選擇

2.7 檢測試紙條最低檢測限的確定

為明確其最低檢測限，利用檢測試紙條對經(jīng)過梯度稀釋的血清進行檢測。如圖7所示，試紙條分別與1600～12800倍稀釋的血清孵育結(jié)合，試紙條在1600～3200倍稀釋下顯色效果均較好，所以用于判別診斷的最低檢測限為3200倍。

圖7 蛋白芯片最低檢測限的確定

2.8 顯色方法的選擇

分別選取DAB、TMB以及ECL顯色液進行檢測試紙條的顯色，結(jié)果如圖8所示，TMB顯色液組的結(jié)果反應過快，不宜觀察，而ECL顯色需要專業(yè)顯影儀器設備。因此，本研究最終選擇DAB顯色液。

圖8 顯色方法的選擇

2.9 顯色時間的選擇

選取DAB顯色液在1、3、5 min和10 min作為顯色時間點進行優(yōu)化。結(jié)果如圖9所示，試紙條在3、5 min和10 min顯色條件下效果均明顯，隨著顯色時間增加背景加深。因此，確定3 min為DAB顯色液的最佳顯色時間。

圖9 顯色時間的選擇

2.10 檢測試紙條特異性分析

如圖10所示，在混合血清中仍然可以檢測，證明試紙條特異性較強。

圖10 蛋白芯片特異性分析

2.11 檢測試紙條敏感性分析

取10頭奶牛待檢血清進行檢測，并與ELISA測定結(jié)果進行對比。如圖11所示，為ELISA測定結(jié)果的標曲，計算得出5頭奶牛懷孕，5頭奶牛未懷孕，通過與檢測試紙條的對比，二者符合率為80%，證明試紙條敏感性好。

圖11 Bovine PAGs標準曲線

2.12 檢測試紙條重復性分析 本研究用不同時間制備的試紙條進行重復性驗證，每份樣品重復3次，結(jié)果與預期一致，證明重復性好。

2.13 檢測試紙條穩(wěn)定性分析 本研究將于同一批次制備的檢測試紙條分別于4℃和-20℃保存14天和28天。結(jié)果如圖12所示，2周內(nèi)試紙條顯色效果均明顯，證明檢測試紙條保存在4℃和-20℃條件下2周內(nèi)性能穩(wěn)定。

圖12 蛋白芯片穩(wěn)定性分析

3 討論

對于奶牛養(yǎng)殖行業(yè)而言，高效配種能增加產(chǎn)奶量、降低護理成本，提高企業(yè)效益[1]。因此，盡早發(fā)現(xiàn)奶牛妊娠能夠減少其配種次數(shù)，降低胚胎死亡率，并且提早發(fā)現(xiàn)空懷現(xiàn)象，能縮短產(chǎn)犢間隔時間，提高奶牛繁殖率[18]。研究表明與未懷孕的奶牛相比，懷孕奶牛第24天母體血液循環(huán)中PAG濃度有所增加[19]；在授精后的24～26天母體血液循環(huán)中PAG增加[20-21]。

目前國內(nèi)市場有關(guān)PAGs早期診斷產(chǎn)品主要為ELISA試劑盒，常用的早期妊娠檢測PAGs主要有PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、PAG18、PAG19等[17]。筆者前期通過原核表達方式獲得了PAG6蛋白，免疫小鼠后制備了多克隆抗體，檢測發(fā)現(xiàn)其具有較高的抗體滴度，可以用來制備奶牛早期妊娠診斷檢測試紙條。

目前，可視化芯片技術(shù)在動植物病毒檢測、食品中抗生素殘留檢測、基因分型、酶功能鑒定等方面廣泛應用[22-24]，且蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在獸醫(yī)診斷學上的應用，近些年來也已取得了巨大進步[25-27]。本試驗通過優(yōu)化載體材質(zhì)、點樣濃度、顯色方法等檢測的各個環(huán)節(jié)，將抗體用PBS稀釋成10 μg/mL點樣至NC膜上，在37℃溫箱中固定抗體30 min，經(jīng)5%的脫脂奶粉封閉，清洗后制成標準化檢測試紙條。待檢血清滴加至試紙條后，在37℃溫箱中孵育1 h后，進行洗滌和二抗孵育，最后在DAB顯色試劑盒作用下顯色3 min即可觀察。初步臨床檢測表明，在稀釋3200倍的最低檢測限的情況下，在混合血清中仍然可以檢測出懷孕，該檢測試紙條特異性強；此外，該方法與ELISA的符合率在80%，敏感性良好。試驗重復性良好，并能在4℃和-20℃條件下，保存2周。雖然本方法僅針對一種蛋白，在面臨復雜的妊娠環(huán)境下存在局限，但作為直腸觸診和超聲波診斷檢測技術(shù)的替代方法，在協(xié)助臨床診斷方面仍能起到積極的作用?？焖贆z測試紙條兼具平價、易操作、易推廣、易保存等優(yōu)點，能夠深入基層臨床，打破美國企業(yè)對中國相關(guān)行業(yè)的壟斷控制，提高中國奶牛早期妊娠診斷效率。

4 結(jié)論

制備了奶牛妊娠相關(guān)糖蛋白6快速檢測試紙條，待檢血清滴加至試紙條后，在37℃溫箱中孵育1 h后，進行洗滌和二抗孵育，最后在DAB顯色試劑盒作用下顯色3 min即可判定，可用于奶牛早期妊娠診斷，該法具有簡便、快速、特異性好等優(yōu)點。