范立民，王 慶，陳 曦，裘麗萍，孟順龍，宋 超，蘇永騰，胡庚東，陳家長

（1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214081；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214081；3無錫中糧工程科技有限公司，江蘇無錫 214062；4江蘇溢薈生物技術(shù)有限公司，南京 211225）

0 引言

浮床空心菜種植對(duì)水質(zhì)的凈化能力已經(jīng)被很多的研究證明[1-3]，并且和水芹、水龍、生菜等多種其他的植物相比，浮床空心菜還具有相對(duì)更好的凈化效果[4]。浮床空心菜種植在羅非魚[5-7]、鯉魚[8-9]、中華絨螯蟹[10]、甲魚[11]、鯽魚[12]、草魚[13]養(yǎng)殖池塘中均表現(xiàn)出了較好的凈化效果。除此以外，浮床空心菜在高原地區(qū)的種植[14]、和其他水生植物的輪作[15]，甚至在尾水凈化實(shí)驗(yàn)中[16-17]均得到了較好的應(yīng)用?？招牟丝梢酝ㄟ^從水中吸收氮、磷和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)的方式對(duì)水質(zhì)進(jìn)行凈化；空心菜浮床對(duì)水面的遮擋降低了水體的光能量攝入，與營養(yǎng)競爭作用一起會(huì)在一定程度上抑制藻類的生長；浮床空心菜對(duì)藻類生長的影響和空心菜夜晚的呼吸耗氧會(huì)造成水體溶解氧的下降；空心菜盡管可以一定程度上降低水中藻類對(duì)空氣中二氧化碳的固定，但是其自身的光合作用所固定的二氧化碳也會(huì)經(jīng)新陳代謝后完成向水中的遷移。這些都是浮床空心菜種植在理論上能夠影響水體理化指標(biāo)的因素，對(duì)于影響程度會(huì)受到多種因素的影響，包括空心菜生長狀況、種植面積、池塘養(yǎng)殖過程中人為的物質(zhì)和能量輸入輸出狀況等。而具體在什么情況下是以哪種作用為主，目前為止尚缺乏系統(tǒng)性的報(bào)道。但是已有的一些研究證明，這些作用都是存在的，都是浮床空心菜影響池塘生態(tài)系統(tǒng)的重要方式。

另一方面，浮床栽培空心菜對(duì)養(yǎng)殖池塘水體微生物狀況影響的也引起了學(xué)者們的重視，已有的一些研究表明，浮床栽培空心菜可以一定程度上對(duì)系統(tǒng)微生物群落造成影響。已有的一些對(duì)空心菜對(duì)水中細(xì)菌群落多樣性的研究結(jié)果略有不同，有的研究表明空心菜栽培對(duì)水中細(xì)菌的群落多樣性沒有影響[18]，另一些研究認(rèn)為其能在一定程度上對(duì)池塘細(xì)菌多樣性造成影響，但未見其差異顯著性分析結(jié)果[19-20]，筆者以為，這些研究結(jié)果是不矛盾的，差別是由浮床空心菜的覆蓋率和養(yǎng)殖水體自身營養(yǎng)物質(zhì)水平差異等因素造成的。另外，即使在分類多樣性層面或一些細(xì)菌分類學(xué)水平上未造成顯著性的差異，以功能進(jìn)行區(qū)分的一些微生物群落的相對(duì)豐度或多樣性可能已經(jīng)在發(fā)生一些變化了。因?yàn)樽鳛轲B(yǎng)殖池塘物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的重要驅(qū)動(dòng)力，微生物功能多樣性的變化是水體理化狀況變化的重要生物學(xué)基礎(chǔ)。有研究表明，水中栽培空心菜可以增加水體微生物的數(shù)量，促進(jìn)水體氮循環(huán)[21]。不僅如此，浮床空心菜還有利于促進(jìn)水中脫氮細(xì)菌直接的穩(wěn)定生長[22]，包括改變不同種類氮循環(huán)細(xì)菌在生態(tài)系統(tǒng)中的分布狀況[23]。與此同時(shí)，作為一種生物附著基，空心菜根系在養(yǎng)殖池塘水體總同樣會(huì)附著一些根際微生物群落，形成生物膜來發(fā)揮作用。因此，即使其沒有對(duì)所在水體微生物組成造成顯著影響，但是通過增加單位面積水體功能性微生物的相對(duì)豐度，空心菜根系同樣會(huì)發(fā)揮除直接吸收營養(yǎng)物質(zhì)之外的功能。已有研究表明，浮床空心菜根際微生物在不同富營養(yǎng)程度水體中會(huì)發(fā)揮不同程度的營養(yǎng)物質(zhì)分解凈化的功能[24]，但是其他促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)向水體中轉(zhuǎn)移的能力是否也同時(shí)有變化還未見報(bào)道。另外，總體而言，浮床空心菜對(duì)養(yǎng)殖水體微生物群落的影響相對(duì)還較少，還需要從不同角度積累更多的報(bào)道，從而更加系統(tǒng)化和精細(xì)化完善浮床空心菜、乃至其他浮床生物在水質(zhì)凈化中的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本研究擬從浮床空心菜根際細(xì)菌群落和水中細(xì)菌群落之間相互作用的角度來分析其對(duì)水中細(xì)菌群落的影響，從浮床空心菜對(duì)單位面積養(yǎng)殖水體固氮酶基因豐度增加量的角度來分析其是否在發(fā)揮氮移出的同時(shí)可能會(huì)促進(jìn)空氣中氮素向養(yǎng)殖水體的輸入，進(jìn)而來綜合分析浮床栽培空心菜對(duì)養(yǎng)殖池塘水體微生態(tài)環(huán)境的影響，為有關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集的6口養(yǎng)殖池塘位于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興屺亭養(yǎng)殖基地。每口面積約為1330 m2，初期水深約0.7 m，7月上旬加水至約2 m。養(yǎng)殖所用吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)魚苗由養(yǎng)殖基地自己繁殖（5月上中上旬），2015年5月20日放苗，放養(yǎng)密度為2.6尾/m2。其中3口試驗(yàn)塘為對(duì)照塘，只進(jìn)行羅非魚養(yǎng)殖.在另3口試驗(yàn)塘中浮床種植空心菜(Ipomoea aquatica)，浮床投放時(shí)間為2015年6月上旬。浮床制作選用PVC管材料(φ=50 mm)，規(guī)格為2 m×2 m。在浮床上用尼龍繩系住網(wǎng)孔直徑為30 mm的網(wǎng)片，用于插播空心菜。插種時(shí)，將空心菜菜秧去葉，剪成10 cm左右且?guī)в幸秆炕蝽斞康男《?，?個(gè)這樣的小段植入一個(gè)網(wǎng)孔中按株行距20 cm×20 cm進(jìn)行扦插。將浮床用尼龍繩連接固定。種養(yǎng)面積占池塘總面積10%左右。養(yǎng)殖期間對(duì)照組塘和試驗(yàn)組塘的日常管理一致，期間不換水。

分別于2015年7月和8月下旬進(jìn)行樣品的采集。水樣采集自水面下深度0.01 m處（約與空心菜根系長出后同一深度范圍），沿池塘矩形長邊方向中線均勻設(shè)點(diǎn)，對(duì)照塘和處理塘采樣點(diǎn)布設(shè)見圖1。將相同池塘三個(gè)點(diǎn)水樣等比例均勻混勻后，作為該池塘該次樣品，100 mL混合水樣經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾，濾膜放置2 mL滅菌離心管后浸于液氮罐中短暫處理，然后放于-80℃超低溫冰箱中備用。3口對(duì)照塘7月得到的3個(gè)濾膜樣品命名為W11、W12、W13，8月份得到的樣品分別命名為W21、W22、W23。與之對(duì)應(yīng)的3口處理塘得到的濾膜樣品分別命名為RW11、RW12、RW13、RW21、RW22、RW23。采集1 g空心菜根部樣品，放入100 mL滅菌重蒸水中，置于搖床上500 rpm震蕩10 min，將100ml震蕩過的水同樣用0.22 μm孔徑的水相微孔濾膜過濾，將過濾完的濾膜放于滅菌離心管中后，置于-80℃超低溫冰箱中備用。3口處理塘兩次得到的根系濾膜樣品分別命名為R11、R12、R13、R21、R22、R23。

圖1 池塘采樣點(diǎn)布設(shè)示意圖

1.2 水質(zhì)分析

采用分光光度法測定水中氨氮(NH3-N)和亞硝酸鹽氮(NO2-N)濃度；采用有機(jī)碳分析儀(GE SieversInnovOx Laboratory TOC Analyzer)測定水中總有機(jī)碳(TOC)、總碳(TC)、無機(jī)碳(IC)濃度；采用過硫酸鉀氧化法測定水中總磷(TP)和總氮(TN)濃度；采用酸性高錳酸鉀氧化法測定水中高錳酸鹽指數(shù)COD mn。

1.3 樣品DNA的提取和純化

采用PowerWater DNA Isolation Kit（MO BIO，美國）進(jìn)行水樣總DNA的提取，采用PowerSoil DNA Isolation Kit（MO BIO，美國）進(jìn)行根系總DNA的提??；采用Mobio PowerClean DNA Clean-Up Kit進(jìn)行提取到的DNA的純化；采用瓊脂糖凝膠電泳(1%)檢測純化后的DNA樣品。

1.4 細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增及高通量分析

采用帶有barcode（標(biāo)簽）的特異引物（引物序列為338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），擴(kuò) 增 細(xì) 菌 16S rRNA基因V3～V5可變區(qū)；擴(kuò)增體系包括（終體積20 μL）：10 ng模板DNA，2 μL 2.5 mM dNTPs，4 μL 5×FastPfu buffer（TransGen Biotech，中 國 ），0.4 μL FastPfu polymerase（TransGen Biotech，中國）和正反引物各0.8 μL(5 μM)；采用ABI GeneAmp? 9700型基因擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[25]。采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）回收擴(kuò)增產(chǎn)物，采用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行定量。采用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序（由上海美吉生物有限公司完成）。

1.5 數(shù)據(jù)優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[26]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)優(yōu)化和質(zhì)控。

1.6 生物信息學(xué)分析

采用Usearch(vsesion 7.1 http://drive5.com/uparse/)軟件序列進(jìn)行可操作性分類單元OTU(operational taxonomic unit)的聚類分析（97%相似度水平）；采用Qiime(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)軟件、RDP classifier貝葉斯算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析（silva數(shù)據(jù)庫、97%相似度水平）。

1.7 nifH基因的熒光定量分析

采用ABI 7500熒光定量PCR儀（美國），使用SYBRGreen Real-Time PCR試劑盒(ABI Power SybrGreen qPCR Master Mix(2X))，采用 SYBRGreen Ⅰ法熒光定量分析細(xì)菌nifH基因拷貝數(shù)。引物序列為 nifH-1F：5'-AAAGGCGGAATCGGCAAGTC-3'和nifH-2R：5'-TTGTTCGCGGCGTACATG-3'。

為了計(jì)算空心菜根系對(duì)單位體積水體中固氮酶nifH基因拷貝數(shù)的貢獻(xiàn)量，在2次采樣時(shí)同時(shí)隨機(jī)采集并測量浮床下50根空心菜根系的長度和重量，計(jì)算根系的平均長度和平均重量，然后根據(jù)每個(gè)浮床所種植的空心菜的數(shù)量估算空心菜根系在采樣時(shí)對(duì)其所占據(jù)水體單位體積貢獻(xiàn)的固氮酶nifH基因拷貝數(shù)。計(jì)算見公式(1)。

其中RnifH：空心菜根系對(duì)所占據(jù)單位體積水體固氮酶nifH基因拷貝數(shù)，單位Copies/mL；Q：1 g空心菜根系所得到濾膜樣品固氮酶nifH基因拷貝數(shù)，單位Copies/g；Ga：每株空心菜根系的平均重量，單位g：空心菜的平均長度，單位m。

2 結(jié)果與分析

2.1 浮床空心菜種植對(duì)“門”水平細(xì)菌群落在羅非魚養(yǎng)殖池塘水體中分布的影響

通過對(duì)包括水樣和根系樣品在內(nèi)的18個(gè)樣品的高通量測序及分析，本次試驗(yàn)共得到554700條有效序列，序列平均長度為438.88 bp。這些序列可以歸納為1741個(gè)OTUs(Operational Taxonomic Units（)圖2(a)），其中空心菜根系(R)中1440個(gè)OTUs，空心菜栽培池塘水(RW)中 1264 個(gè) OTUs，對(duì)照塘水(W)中 1205 個(gè)OTUs。

采用Venn圖2(a)分析對(duì)照塘水、空心菜栽培池塘水和空心菜根系OTUs數(shù)量的關(guān)系，結(jié)果表明，空心菜根系中獨(dú)有的OTUs有385個(gè)，占總OTUs的22.11%，空心菜栽培塘水和對(duì)照塘水中獨(dú)有的OTUs均只有10個(gè)，分別占總OTUs的0.57%，表明空心菜根系上附著的細(xì)菌組成與其所在的塘水間具有明顯的區(qū)別。對(duì)基質(zhì)間共有OTUs的分析表明，3種基質(zhì)間兩兩共有OTUs占總OTUs的百分比分別為64.04%(RW/W)，61.74%(R/RW)和58.36%(R/W)，單因素方差分析表明空心菜根系中的OTUs顯著多于塘水中(p＜0.05)，但空心菜栽培并沒有對(duì)池塘水體中細(xì)菌的OTUs數(shù)量造成影響(p＞0.05)。

測序得到的這些OTUs則可以歸納為37個(gè)門(phyla)或 組(groups)。 圖 2(b)顯 示 ，變 形 菌 門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、硬壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)在空心菜根系及空心菜栽培塘和對(duì)照塘水中均具有相對(duì)較高的豐度。對(duì)這5個(gè)門在這3種基質(zhì)中的的相對(duì)豐度進(jìn)行對(duì)比表明，硬壁菌門(Firmicutes)的相對(duì)豐度在3種基質(zhì)中的相對(duì)豐度無顯著差異(p＞0.05（)根系：12.55%±16.13%，浮床栽培塘水：14.49%±7.72%，對(duì)照塘水：8.61%±5.44%，變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)的相對(duì)豐度均表現(xiàn)為根系中與2種塘水中的差異顯著(p＜0.05)，而對(duì)照塘和處理塘水間的差異不顯著(p＞0.05)。其中變形菌門(Proteobacteria)（根系：47.00%±6.21%，浮床栽培塘水：25.53%±7.53%），對(duì)照塘水：20.89%±4.67%）和擬桿菌門(Bacteroidetes)（根系：13.73%±4.41%，浮床栽培塘水：8.35%±1.29%），對(duì)照塘水：8.18%±1.41%）在根系中具有較高的相對(duì)豐度，藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)（根系：13.66%±7.00%，浮床栽培塘水：25.08%±10.28%），對(duì)照塘水：30.19%±10.04%）和放線菌門(Actinobacteria)（根系：1.50%±0.52%，浮床栽培塘水：11.69%±1.72%），對(duì)照塘水：12.35%±2.18%）在水中具有較高的相對(duì)豐度。

以上結(jié)果表明空心菜根系具有明顯的細(xì)菌群落選擇性，但試驗(yàn)條件下其沒有對(duì)水中主要的細(xì)菌群落組成在門水平造成顯著的影響。

2.2 空心菜根系和水中細(xì)菌群落及關(guān)系

2.1 的分析表明，無論是OTU數(shù)量還是“門”水平的群落組成，在空心菜根系和所在池塘水中之間均存在著顯著差別。我們希望進(jìn)一步分析這些差別。圖2(c)顯示了“綱”水平的空心菜根系獨(dú)有的細(xì)菌群落組成，獨(dú)有OTU平均相對(duì)豐度占總平均相對(duì)豐度的10.25%，這些“綱”水平細(xì)菌群落組成主要包括Sphingobacteriia、Deltaproteobacteria、Alphaproteobact eria、Betaproteobacteria、Cytophagia、Gammaproteobact eria和 Flavobacteriia等 ，其 中 Sphingobacteriia、Deltaproteobacteria、Alphaproteobacteria是優(yōu)勢菌群。對(duì)空心菜根系和所在池塘水中共有細(xì)菌群落分析表明，有140個(gè)OTU的相對(duì)豐度在空心菜根系上顯著上調(diào)（占共有OTU豐度的30.5%），有149個(gè)OTU的相對(duì)豐度在空心菜根系上顯著下調(diào)（占共有OTU豐度的3.3%）（圖2(d)），表明空心菜根系對(duì)水中的相當(dāng)一部分浮游細(xì)菌存在著較強(qiáng)的選擇性富集作用。同樣，在“綱”水平對(duì)這些共有菌群進(jìn)行分析，結(jié)果表明（圖2(e)），空心菜根系對(duì)Betaproteobacteria的富集能力相對(duì)較強(qiáng)，而對(duì)Actinobacteria的相對(duì)豐度顯示出“下調(diào)”作用。藍(lán)細(xì)菌綱在水中具有最高的相對(duì)豐度，在空心菜根系相對(duì)豐度出現(xiàn)明顯的下降，但是仍然是其主要細(xì)菌組分之一。

圖2 水和空心菜根系細(xì)菌OTU及群落組成情況

2.3 空心菜種植對(duì)池塘水體浮游細(xì)菌群落α多樣性的影響

對(duì)來自3中基質(zhì)的細(xì)菌群落Ace（圖3(a)）豐富度指數(shù)及多樣性指數(shù)Shannon（圖3(b)）進(jìn)行分析表明，空心菜根系、空心菜種植塘水中和對(duì)照塘水中細(xì)菌群落豐富度指數(shù)Ace平均分別為1195.33、947.83和914，多樣性指數(shù)Shannon平均分別為5.25、4.89和4.94?？招牟烁导?xì)菌豐富度指數(shù)Ace的值顯著高于空心菜所在塘水和對(duì)照塘水(p＜0.05)，但空心菜種植塘水和對(duì)照塘水間細(xì)菌豐富度指數(shù)Ace差異不顯著(p＞0.05)；空心菜根系細(xì)菌多樣性指數(shù)Shannon的值雖然略高于空心菜所在塘水和對(duì)照塘水，三者之間細(xì)菌豐富度指數(shù)Ace差異均不顯著(p＞0.05)。

圖3 不同基質(zhì)的豐富度和多樣性指數(shù)

2.4 空心菜種植對(duì)池塘水體浮游細(xì)菌群落β多樣性的影響

對(duì)所有樣品測序所得到的OTUs進(jìn)行NMDS分析（圖4），結(jié)果表明空心菜根系樣品中的細(xì)菌群落和池塘水中細(xì)菌群落具有較大差異；無論是空心菜根系中的細(xì)菌群落還是池塘水中的細(xì)菌群落均隨著時(shí)間的變化有產(chǎn)生變化的趨勢。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些差異的顯著性水平，筆者分別對(duì)不同分組樣品進(jìn)行ANOSIM分析，結(jié)果顯示空心菜種植池塘的細(xì)菌群落和對(duì)照塘的細(xì)菌群落之間差異不顯著(R=0.628，P=0.47)，空心菜根際細(xì)菌群落與空心菜種植塘以及與對(duì)照塘細(xì)菌群落之間均差異顯著（均為R=0.628，P=0.002）；池塘水中細(xì)菌群落（包括空心菜種植塘和對(duì)照塘）在不同采樣時(shí)間間差異顯著(R=0.999，P=0.002)，但空心菜根際細(xì)菌群落在兩次不同采樣時(shí)間見的差異不顯著(R=0.999，P=0.10)。綜合以上結(jié)果，本研究認(rèn)為，盡管空心菜根系附著的細(xì)菌群落明顯不同于其所在水中的細(xì)菌群落，但在種植面積10%的情況下，池塘浮床種植空心菜不會(huì)對(duì)水中浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)造成顯著影響；水中的細(xì)菌群落會(huì)隨著時(shí)間的變化而變化，空心菜根際細(xì)菌群落可能也有隨著時(shí)間變化而發(fā)生變化的趨勢。

圖4 池塘系統(tǒng)中細(xì)菌群落的NMDS排序分析

為了了解空心菜種植池塘以及對(duì)照池塘水中浮游細(xì)菌群落和水環(huán)境質(zhì)量狀況之間的關(guān)系，首先采用Mantel檢驗(yàn)對(duì)水中浮游細(xì)菌群落和環(huán)境變量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，環(huán)境變量能夠解釋水中浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性狀況(p=0.002，r=0.538)；在此基礎(chǔ)上，采用enfit函數(shù)來檢驗(yàn)不同環(huán)境變量解釋水中浮游細(xì)菌群落排序(NMDS)的顯著程度，結(jié)果如表1所示，表1表明無機(jī)碳、氨氮和亞硝態(tài)氮與水中浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)間具有顯著的相關(guān)關(guān)系(p＜0.05)；采用Bioenv函數(shù)來分析篩選與水中浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著相關(guān)關(guān)系的環(huán)境變量組合，結(jié)果表明環(huán)境變量中只有無機(jī)碳一個(gè)變量入選(r=0.839)。

表1 水中細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系

2.5 空心菜種植對(duì)池塘水質(zhì)的影響

如前所述，羅非魚養(yǎng)殖池塘水中浮游細(xì)菌群落和水質(zhì)無機(jī)碳、氨氮和亞硝氮間具有顯著的相關(guān)性，特別是無機(jī)碳。除此以外，筆者還希望了解空心菜種植是否對(duì)池塘水質(zhì)產(chǎn)生了顯著的影響。通過對(duì)空心菜種植塘和對(duì)照塘環(huán)境因子的分析，可以發(fā)現(xiàn)空心菜種植可以使得池塘中總氮、總磷、高錳酸鹽指數(shù)、總有機(jī)碳和總碳顯著降低(p＜0.05)（圖5(c)、(d)、(e)、(f)、(g)），和對(duì)照組相比分別平均下降7.98%、20.56%、40.29%、27.7%和11.5%。但是這樣的影響和與水中浮游細(xì)菌密切相關(guān)的理化因子組合并不相同，這可能是造成空心菜種植沒有對(duì)池塘水中浮游細(xì)菌群落產(chǎn)生顯著影響的原因。

圖5 空心菜種植對(duì)池塘水質(zhì)的影響

2.6 空心菜種植對(duì)單位體積水中固氮酶nifH基因豐度的影響

前已述及，實(shí)驗(yàn)條件下空心菜浮床種植對(duì)池塘水中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響不顯著，筆者還希望了解空心菜種植對(duì)池塘水中和氮素代謝密切相關(guān)的固氮菌豐度的影響。圖6可見，空心菜種植塘和對(duì)照塘水體中固氮酶基因nifH拷貝數(shù)之間沒有顯著差異(p＞0.05)，但是經(jīng)過換算的空心菜根系附著的細(xì)菌為其所占據(jù)的單位體積水體所貢獻(xiàn)的nifH基因拷貝數(shù)顯著高于其所在的水中的拷貝數(shù)(p＜0.05)，換句話說，即使不考慮空心菜根系所在池塘水體中已有的固氮酶nifH基因，空心菜根系為其所占據(jù)的單位體積水體貢獻(xiàn)的nifH基因拷貝數(shù)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于池塘水體單位體積中的拷貝數(shù)。由此可見，池塘種植空心菜并不是簡單的植株生長吸收水體中的氮素那么簡單，還存在著促進(jìn)空氣中氮?dú)獾墓潭ㄗ饔眠@樣的過程。

圖6 空心菜種植對(duì)單位體積池塘水固氮酶nifH基因拷貝數(shù)的影響

3 討論

3.1 浮床空心菜種植對(duì)池塘生態(tài)系統(tǒng)細(xì)菌群落的影響分析

本研究表明，以10%的覆蓋面積浮床種植空心菜對(duì)池塘浮游細(xì)菌群落并沒有顯著的影響，無論是“門”水平的群落組成，還是群落多樣性均未發(fā)生顯著變化。這與李建柱等[19]在草魚養(yǎng)殖池塘中的研究類似。李建柱等采用3.5%的浮床空心菜覆蓋率研究其對(duì)池塘中微生物群落的影響，結(jié)果表明，在“門”水平上浮床空心菜沒有對(duì)水中的浮游細(xì)菌群落造成顯著影響。然而，兩者之間亦有不同之處，3.5%的浮床空心菜覆蓋率一定程度上提高了水體浮游細(xì)菌豐富度指數(shù)、降低了其多樣性指數(shù)。和本研究相比，其無論是養(yǎng)殖品種、浮床面積還是水質(zhì)營養(yǎng)狀況都存在著不同，這些都可能是原因，但是筆者認(rèn)為其中水質(zhì)營養(yǎng)負(fù)荷可能是最主要的原因，兩者在水質(zhì)總氮、氨氮等水平都存在非常顯著的差別，本研究中的羅非魚養(yǎng)殖池塘中總氮和氨氮的濃度均接近于2倍于草魚養(yǎng)殖池塘。有研究表明，以營養(yǎng)物質(zhì)濃度為代表的環(huán)境因子對(duì)浮游細(xì)菌群落的影響甚至能夠大于6000 km空間距離對(duì)其的影響[27]，一些其他的影響因素往往最終也是通過改變環(huán)境因子的濃度來對(duì)浮游細(xì)菌群落造成影響。因此，對(duì)于養(yǎng)殖池塘來講，營養(yǎng)負(fù)荷越高，包括浮床種植在內(nèi)的外源性干預(yù)對(duì)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響可能也就會(huì)越小。盡管如此，浮床種植空心菜在還未明顯改變水中浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的情況下，一些細(xì)微的變化可能已經(jīng)在發(fā)生，例如通過某種機(jī)制影響到水中細(xì)菌及氮循環(huán)細(xì)菌的數(shù)量。吳偉等[21]的研究就表明，在異育銀鯽為主養(yǎng)品種的池塘中分別以10%和20%的覆蓋率，浮床空心菜種植40天后能夠促進(jìn)水中細(xì)菌總數(shù)及氮循環(huán)細(xì)菌數(shù)量的增加；并且隨著浮床覆蓋率的增加，其影響也越顯著，王珊珊等[22]的研究表明，空心菜浮床面積占總面積25%以上時(shí)能夠促進(jìn)水中脫氮細(xì)菌的穩(wěn)定生長。

浮床空心菜種植對(duì)池塘微生態(tài)環(huán)境的影響不光是直接對(duì)于其接觸的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，空心菜根系作為基質(zhì)為水中微生物提供了附著場所，并且隨著根系的不斷生長，基質(zhì)表面積也不斷增加。本研究表明，空心菜根系獨(dú)有OTU占總數(shù)的22.11%，這些OTU可能是由空心菜幼苗栽培時(shí)帶入的，隨著空心菜的不斷生長，其可能也經(jīng)歷了自然選擇的過程，并在系統(tǒng)中發(fā)揮著作用；與此同時(shí)，根系作為基質(zhì)對(duì)占總數(shù)30.5%的OTU發(fā)揮了富集作用，使得占總數(shù)3.3%的OTU表現(xiàn)為下調(diào)作用。這樣以富集為主的選擇性富集作用和空心菜幼苗帶入的獨(dú)有菌群一起在池塘生態(tài)系統(tǒng)中形成了特異性的生物膜，盡管對(duì)水中浮游細(xì)菌群落的直接影響不顯著，但是水中的生物膜同樣是池塘微生態(tài)環(huán)境中重要的組成部分，同樣在池塘生態(tài)系統(tǒng)包括氮循環(huán)在內(nèi)物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，相較于水中，亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌在空心菜根系具有更多的數(shù)量分布[29]，因此空心菜根系生物膜為池塘水體的硝化反應(yīng)的發(fā)生提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。而本研究首次對(duì)空心菜根系表面的固氮菌進(jìn)行了定量研究，經(jīng)換算后其顯著增加了空心菜所在區(qū)域單位水體固氮菌的數(shù)量，因此空心菜根系在促進(jìn)氮素硝化轉(zhuǎn)化的過程中，也可能在一定程度上促進(jìn)了空氣中氮素向池塘水體的轉(zhuǎn)移。

3.2 浮床空心菜種植對(duì)水質(zhì)影響及原因分析

本研究表明，在吉富羅非魚養(yǎng)殖池塘中以10%的空心菜浮床覆蓋率使得水質(zhì)指標(biāo)總氮、總磷、高錳酸鹽指數(shù)、總有機(jī)碳和總碳均顯著下降，和對(duì)照塘相比下降平均幅度分別達(dá)到7.98%、20.56%、40.29%、27.7%和11.5%。目前為止，已經(jīng)報(bào)道了在多個(gè)養(yǎng)殖品種池塘中采用浮床空心菜來凈化水質(zhì)的研究。本實(shí)驗(yàn)室先前在以異育銀鯽為主的養(yǎng)殖池塘中以10%和20%的覆蓋率來浮床種植空心菜的研究，和對(duì)照組相比，水中總磷、總氮、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、葉綠素a和高錳酸鹽指數(shù)等多個(gè)指標(biāo)均顯著下降，并且20%覆蓋率下降幅度更大；李文祥等[3]在異育銀鯽為主養(yǎng)品種的池塘中同樣以10%的空心菜覆蓋率，使得水質(zhì)總磷、總氮和高錳酸鹽指數(shù)的值在9至11月份間顯著低于對(duì)照池塘，這與本研究基本吻合；Li等[29]采用10%的覆蓋率在中華鱉養(yǎng)殖池塘中種植浮床空心菜對(duì)水質(zhì)進(jìn)行凈化，結(jié)果表明氨氮、總氮、總磷、葉綠素a和濁度在7月份以后顯著低于對(duì)照塘。在羅非魚養(yǎng)殖池塘中也有學(xué)者進(jìn)行過浮床空心菜凈化水質(zhì)的研究，郭中寶等[5]和宋超等[30]在羅非魚養(yǎng)殖池塘中應(yīng)用浮床空心菜來控制氮磷的實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)水質(zhì)總氮、總磷、氨氮、亞硝酸鹽氮等也都起到了明顯的凈化效果。和本研究相比，空心菜種植使得水質(zhì)氨氮、亞硝氮均顯著下降?？傮w而言，池塘中浮床種植空心菜的研究表明均會(huì)對(duì)水體總氮、總磷到凈化作用。這2個(gè)指標(biāo)均包含了幾個(gè)更具體的指標(biāo)，例如總氮包括有機(jī)氮、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮等，總磷包括有機(jī)態(tài)磷、可溶性磷酸鹽等，這些具體指標(biāo)的值在不同的養(yǎng)殖池塘中可能會(huì)受到不同的具體條件的影響而呈現(xiàn)出更為多樣性的變化，因此浮床空心菜對(duì)其的影響也就可能會(huì)有所不同，這可能是造成不同的這些研究中這些指標(biāo)有的顯著降低了，而另一些沒有顯著降低的原因。

對(duì)于這些具體的水質(zhì)指標(biāo)，有的指標(biāo)能夠直接被空心菜所利用，而其他的主要是通過微生物的轉(zhuǎn)化后而濃度降低的。Zhang等[31]的研究認(rèn)為，空心菜對(duì)水質(zhì)磷的凈化作用主要通過直接吸收，而氨氮和硝酸鹽的凈化作用主要是基于微生物的作用。本研究中除了總磷和總氮外，和對(duì)照組相比空心菜種植塘高錳酸鹽指數(shù)和總有機(jī)碳濃度也顯著下降，其顯然不會(huì)被空心菜直接利用了，而是基于微生物的作用。即使是總氮，由于處理塘氨氮、亞硝氮等無機(jī)氮沒有明顯下降，推測其有機(jī)氮部分應(yīng)該通過微生物的轉(zhuǎn)化使得其濃度降低了，與此同時(shí)，相當(dāng)多的無機(jī)氮也會(huì)被移出到系統(tǒng)之外，只不過增加和降低的聯(lián)合作用結(jié)果是氨氮和亞硝氮濃度沒有顯著降低。而發(fā)揮作用的微生物一部分來自水中的浮游微生物，其群落結(jié)構(gòu)盡管沒有被顯著改變，但是根據(jù)先前的一些研究，浮床空心菜可以通過某種機(jī)制促使水中的細(xì)菌總數(shù)和氮循環(huán)細(xì)菌總數(shù)增加，從而間接發(fā)揮水質(zhì)凈化的作用，至于水中微生物群落和水質(zhì)無機(jī)碳、氨氮和亞硝態(tài)氮間的相關(guān)關(guān)系可能是因?yàn)閯偤脙烧咦罱K的結(jié)果是都沒有因浮床空心菜的種植發(fā)生顯著的改變。另外一部分發(fā)揮作用的微生物就來自空心菜根系形成的選擇性生物膜。生物膜和根系本身構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，可以同時(shí)發(fā)生直接吸收營養(yǎng)物質(zhì)和生物膜中微生物對(duì)水質(zhì)的凈化作用，空心菜浮床比仿生植物具有更好的去除效果凈化效果可以在一定程度上證明這一點(diǎn)[16]。而生物膜對(duì)氮素轉(zhuǎn)化同樣包含了促進(jìn)空氣中氮?dú)獾墓潭ê痛龠M(jìn)水體氮素轉(zhuǎn)化雙重的效應(yīng)。從另一方面來說，任何影響到空心菜生長發(fā)育的因素均可能影響到其物質(zhì)吸收和生物膜形成及轉(zhuǎn)化作用，也就會(huì)影響到浮床空心菜對(duì)水質(zhì)的凈化效果，例如水中的營養(yǎng)狀態(tài)、酸堿度等均會(huì)對(duì)空心菜的生長造成影響，也就會(huì)對(duì)水質(zhì)凈化效果造成影響，這也是不同養(yǎng)殖池塘中使用浮床空心菜來凈化水質(zhì)效果會(huì)產(chǎn)生差異的重要原因。酸堿度水體對(duì)其中水培的空心菜產(chǎn)量造成影響

4 結(jié)論

（1）羅非魚養(yǎng)殖池塘中，以10%的覆蓋率浮床種植空心菜對(duì)水體浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響不大；

（2）空心菜根系生物膜細(xì)菌的組成包括外源性的獨(dú)有菌群和來自水中的菌群，其中生物膜對(duì)水中菌群的附著大部分相對(duì)豐度未顯著變化，除此以外的部分基本上都進(jìn)行了富集（上調(diào)）。

（3）生物膜對(duì)水質(zhì)的作用可能包含促進(jìn)水中氮素的轉(zhuǎn)化的一面，還包含促進(jìn)對(duì)空氣中氮?dú)庀蛩修D(zhuǎn)移的一面。