梁文鳳，侯媛媛，郭曉磊，陳碩昌，朱萍，蒙健宗，楊輝 ，4*

（1.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004；3.邯鄲職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物工程系，河北 邯鄲 056000；4.廣西微生物與酶工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530004）

左聚糖是一類分子中含有大量茁-2，6-糖苷鍵連接的主鏈和少量茁-2，1-糖苷鍵連接的支鏈的多糖。其化學(xué)結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，固有黏度低，且有一定的溫度穩(wěn)定性[1]。左聚糖具有抗菌抗病毒、降低血糖和膽固醇等功能[1]，保濕效果可以與透明質(zhì)酸媲美，同時(shí)還具有美白的功能[2]。除此之外，文獻(xiàn)[3-5]研究表明，左聚糖對(duì)益生菌和復(fù)雜腸道中的微生物群有益。目前合成左聚糖的主要方法有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶合成法。相比而言，化學(xué)合成法實(shí)施過(guò)程很繁瑣[6]，微生物發(fā)酵法的左聚糖產(chǎn)量低，大約在14.4 g/L～41.7 g/L[7]，而酶合成法具有易控制、產(chǎn)量高、轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)。因此，酶法合成制備左聚糖比較有優(yōu)勢(shì)[8]。

左聚糖蔗糖酶屬于GH68水解家族中[9]的一員，具有水解和聚合雙重活性，不但可以水解蔗糖，還可以將果糖基聚合成左聚糖。廣西壯族自治區(qū)的蔗糖產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量60%以上，但是蔗糖及其衍生產(chǎn)品種類較少，形成了糖業(yè)發(fā)展技術(shù)的瓶頸。據(jù)報(bào)道，廣西制糖業(yè)在2017年虧損11.41億元[10]。利用左聚糖蔗糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)左聚糖，可提高產(chǎn)品的附加值，對(duì)蔗糖深加工及相關(guān)行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

已有研究表明，不同微生物來(lái)源的左聚糖蔗糖酶利用蔗糖合成左聚糖的效率及產(chǎn)量會(huì)有所不同。例如來(lái)自解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens H47）[11]、納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto CCT7712）[8]和嗜甲基芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus SK 21.002）[12]的左聚糖蔗糖酶分別可合成116、63.60 g/L和100 g/L左聚糖，蔗糖轉(zhuǎn)化率分別為38.67%、18.17%和33.33%。雖然有個(gè)別已報(bào)道的左聚糖蔗糖酶合成左聚糖可獲得較高的產(chǎn)量或較高的蔗糖轉(zhuǎn)化率，但其是在實(shí)驗(yàn)室搖瓶小規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)酶，再經(jīng)過(guò)鎳柱親和層析純化后才進(jìn)行生產(chǎn)左聚糖研究，例如來(lái)自羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri LTH5448）[13]和來(lái)自 Brenneria goodwinii[14]的重組左聚糖蔗糖酶可在500 g/L的蔗糖濃度中分別合成183 g/L和185 g/L的左聚糖，來(lái)自丙酮丁醇梭菌（Bacillus clostridium）[15]重組左聚糖蔗糖酶經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化，可在200 g/L的蔗糖濃度下得到94.88 g/L左聚糖。

迄今為止世界上只有美國(guó)、韓國(guó)和日本等少數(shù)國(guó)家實(shí)現(xiàn)了左聚糖量產(chǎn)[16]，在我國(guó)還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道，而且關(guān)于中試規(guī)模以上生產(chǎn)左聚糖蔗糖酶的研究還很缺乏。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)在5 000 L發(fā)酵罐實(shí)現(xiàn)了中試生產(chǎn)大腸桿菌重組枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶[17]，為量產(chǎn)該重組左聚糖蔗糖酶提供了很好的基礎(chǔ)。目前關(guān)于重組枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶生產(chǎn)左聚糖的優(yōu)化研究尚缺乏，并且大部分的優(yōu)化研究只考慮蔗糖轉(zhuǎn)化率或左聚糖產(chǎn)量其中一個(gè)指標(biāo)，但是實(shí)際中得到最高的蔗糖轉(zhuǎn)化率和左聚糖產(chǎn)量的條件往往不一致，需要綜合考慮。因此本文利用中試生產(chǎn)的酶進(jìn)行合成左聚糖研究，并采用響應(yīng)面法分析影響蔗糖轉(zhuǎn)化率和左聚糖產(chǎn)量各因素的相互作用，以期獲得高蔗糖轉(zhuǎn)化率和高左聚糖產(chǎn)量的工藝條件，為酶法生產(chǎn)左聚糖的規(guī)模應(yīng)用提供理論指導(dǎo)和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌重組枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶酶制劑[17]：廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院自制；蔗糖（分析純）：天津博迪化工有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（SE402F）：美國(guó)OHAUS公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（DK-8D）：金壇市醫(yī)療儀器廠；數(shù)字式pH計(jì)（pHS-25）：上海日島科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀（M200 PRO）：瑞士 TECAN 公司；真空濃縮儀（AG5301）：德國(guó)EPPENDORF公司。

1.3 方法

1.3.1 重組左聚糖蔗糖酶水解活力測(cè)定

采用 3，5-二硝基水楊酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）顯色法[18]測(cè)定重組左聚糖蔗糖酶的水解活力。水解活力單位（U）定義：在最適的pH值和溫度條件下，1 min催化蔗糖轉(zhuǎn)化成1 μmol葡萄糖所需的左聚糖蔗糖酶的量為一個(gè)活力單位[19]。

1.3.2 重組左聚糖蔗糖酶聚合活力測(cè)定

稱量若干干燥潔凈、規(guī)格為2.0 mL EP管的質(zhì)量并記錄，從反應(yīng)結(jié)束的反應(yīng)體系中取500 μL反應(yīng)液于EP管中，再加入3倍體積無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，4℃靜置24 h，12 000 r/min離心20 min，棄上清液；用去離子水重懸沉淀，再加入3倍體積無(wú)水乙醇，4℃靜置24 h，10 000 r/min離心16 min，直至用DNS顯色法檢測(cè)上清液無(wú)還原糖殘留[20]。將所得到的左聚糖沉淀放入真空濃縮儀干燥至恒重，計(jì)算蔗糖轉(zhuǎn)化率和左聚糖產(chǎn)量，蔗糖轉(zhuǎn)化率定義為合成的左聚糖產(chǎn)量（g/L）與初始蔗糖（g/L）的百分比[17]，公式如下。

式中：500表示反應(yīng)終止體積，滋L；10-6表示換算單位的倍數(shù)。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室單因素試驗(yàn)結(jié)果[17]，選取對(duì)酶促反應(yīng)影響顯著的3個(gè)因素：反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度和蔗糖質(zhì)量濃度為試驗(yàn)因素，分別以蔗糖轉(zhuǎn)化率和左聚糖產(chǎn)量為響應(yīng)值，通過(guò)Design-Expert軟件設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，如表1和表2所示。試驗(yàn)過(guò)程中，反應(yīng)時(shí)間和酶濃度分別為30 h和1.6 U/mL，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。然后對(duì)蔗糖轉(zhuǎn)化率和左聚糖產(chǎn)量進(jìn)行二次多元回歸方程擬合，得到各因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的回歸方程，根據(jù)試驗(yàn)生成的響應(yīng)曲面圖確定最優(yōu)的酶促反應(yīng)條件。

表1 以蔗糖轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值的Box-Behnken設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and coded levels in Box-Behnken design of conversion yield of sucrose

表2 以左聚糖產(chǎn)量為響應(yīng)值的Box-Behnken設(shè)計(jì)因素及水平Table 2 Factors and coded levels in Box-Behnken design of levan yield

1.3.4 模型的驗(yàn)證及放大體系試驗(yàn)

利用響應(yīng)面模型優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)體系為100 mL，比較模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值，驗(yàn)證模型的有效性，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。將反應(yīng)體系從100 mL擴(kuò)大到5 L，其他反應(yīng)條件不變進(jìn)行重組左聚糖蔗糖酶聚合反應(yīng)，比較兩個(gè)體系的蔗糖轉(zhuǎn)化率和左聚糖產(chǎn)量以考察優(yōu)化條件的適用性。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，運(yùn)用Design-Expert 10.0.7軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和方差分析，用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化蔗糖轉(zhuǎn)化率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

重組左聚糖蔗糖酶酶促反應(yīng)條件Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design scheme and results of Box-Behnken

表4 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of Box-Behnken experiment

利用Design-Expert軟件進(jìn)行分析，蔗糖轉(zhuǎn)化率Y對(duì)反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度和蔗糖質(zhì)量濃度的多元二次回歸方程：蔗糖轉(zhuǎn)化率=35.83-0.21A-1.13B+0.92C-0.11AB-0.02AC+0.52BC-1.19A2-3.94B2-1.8C2。

由表4可知，所選擇的回歸模型的P<0.01，表示整體模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有極顯著影響，具有可信度。模型的失擬項(xiàng)P=0.220>0.05，差異不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不大，殘差主要由隨機(jī)誤差引起的，能較好地反映酶促反應(yīng)過(guò)程中3個(gè)因素與蔗糖轉(zhuǎn)化率（Y）之間的準(zhǔn)確關(guān)系，所以模型選擇適當(dāng)。模型的R2為0.993，校正相關(guān)系數(shù)為0.984，信噪比32.933>4，表明各因素與蔗糖轉(zhuǎn)化率之間具有高度相關(guān)性，擬合程度良好，試驗(yàn)誤差較小，可對(duì)蔗糖轉(zhuǎn)化率進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和分析。

在該模型中，一次項(xiàng)反應(yīng)溫度B、蔗糖質(zhì)量濃度C、二次項(xiàng) A2、B2和 C2對(duì)結(jié)果的影響極顯著（P<0.01），交互項(xiàng)BC對(duì)結(jié)果影響顯著（P<0.05），其它項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P>0.05）。根據(jù)F值可知，對(duì)蔗糖轉(zhuǎn)化率影響程度：B（F=94.167）＞C（F=62.866）＞A（F=3.228），即反應(yīng)溫度＞蔗糖質(zhì)量濃度＞反應(yīng)pH值。

2.1.2 響應(yīng)曲面圖

綜上所述，蔗糖轉(zhuǎn)化率回歸方程為酶法合成左聚糖轉(zhuǎn)化率的優(yōu)化提供了一個(gè)合理模型，利用Design-Expert軟件繪制響應(yīng)曲面圖，結(jié)果如圖1所示。

圖1 兩因素交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.1 Response surface plot of the interaction of each two factors

根據(jù)圖1的響應(yīng)曲面圖，可以看到曲面最高點(diǎn)都在響應(yīng)面上，說(shuō)明都有最佳值，3個(gè)因素的最佳水平在所選的范圍之內(nèi)。各因素的交互作用可通過(guò)對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲面圖來(lái)判斷。反應(yīng)溫度和蔗糖質(zhì)量濃度的響應(yīng)曲面較為陡峭，呈橢圓形，表示它們之間的交互作用顯著，蔗糖質(zhì)量濃度和反應(yīng)溫度分別達(dá)到310 g/L和25℃時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化率與蔗糖質(zhì)量濃度和反應(yīng)溫度的升高呈正相關(guān)，但隨著這兩個(gè)變量的進(jìn)一步升高，蔗糖轉(zhuǎn)化率下降。反應(yīng)pH值和反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值和蔗糖質(zhì)量濃度的響應(yīng)曲面較為平緩，表示其交互作用較不顯著，在一定范圍內(nèi)增加各變量的取值，蔗糖轉(zhuǎn)化率會(huì)隨之增加，但與蔗糖質(zhì)量濃度和反應(yīng)溫度的增加相比，增幅較小。

為進(jìn)一步準(zhǔn)確確定全局最優(yōu)解，以最大化蔗糖轉(zhuǎn)化率為優(yōu)化目標(biāo)，根據(jù)Design-Expert軟件運(yùn)行的結(jié)果，蔗糖轉(zhuǎn)化率在最佳工藝條件：反應(yīng)pH值為6.46、反應(yīng)溫度為24.37℃、蔗糖質(zhì)量濃度為311.90 g/L，在此條件下模型預(yù)測(cè)的蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值36.02%。為了驗(yàn)證本模型的準(zhǔn)確性，按照優(yōu)化后的試驗(yàn)條件，結(jié)合實(shí)際情況，進(jìn)行模型的驗(yàn)證。修正條件：反應(yīng)pH 6.5，反應(yīng)溫度24℃，底物濃度310 g/L，按照修正條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得蔗糖轉(zhuǎn)化率為（36.73±0.60）%。與模型預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合，誤差率僅為1.90%，表明該模型預(yù)測(cè)的結(jié)果符合實(shí)際情況，與試驗(yàn)值具有良好的擬合性。同時(shí)，與未優(yōu)化前相比，該工藝條件下蔗糖轉(zhuǎn)化率提高了約19%。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化左聚糖產(chǎn)量試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以左聚糖產(chǎn)量為響應(yīng)值（Y）的Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果如表6所示。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Experimental design scheme and results of Box-Behnken

根據(jù)Design-Expert軟件分析結(jié)果可得，左聚糖產(chǎn)量Y對(duì)反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度和蔗糖質(zhì)量濃度的多元二次回歸方程：左聚糖產(chǎn)量=136.96-3.59A+5.11B+1.35C+1.10AB-4.47AC+1.93BC-4.31A2-13.95B2-10.53C2。

由表6可知，3個(gè)因素對(duì)左聚糖產(chǎn)量影響最大的為反應(yīng)溫度，其次為反應(yīng)pH值。失擬項(xiàng)P=0.143>0.05，差異不顯著，模型的R2為0.972，校正相關(guān)系數(shù)為0.935，信噪比13.933>4，以上數(shù)據(jù)表明該模型的可信度很高，誤差較小，所以模型可用。在該模型中，一次項(xiàng)反應(yīng)pH值A(chǔ)、反應(yīng)溫度B、二次項(xiàng)B2和C2對(duì)結(jié)果的影響極顯著（P<0.01），AC和A2對(duì)結(jié)果影響顯著（P<0.05），其它項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P>0.05）。根據(jù)F值可知，對(duì)左聚糖產(chǎn)量影響程度：B（F=26.234）＞A（F=12.945）＞C（F=1.839），即反應(yīng)溫度＞反應(yīng) pH 值＞蔗糖質(zhì)量濃度。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析Table 6 Variance analysis of Box-Behnken experiment

2.2.2 響應(yīng)曲面圖

利用Design-Expert軟件對(duì)影響左聚糖產(chǎn)量的因素進(jìn)行分析并繪制響應(yīng)曲面圖，結(jié)果如圖2所示。

圖2 兩因素交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface plot of the interaction of each two factors

根據(jù)圖2的響應(yīng)曲面圖，可以看到曲面最高點(diǎn)都在響應(yīng)曲面上，所以3個(gè)因素的最佳水平在所選的范圍之內(nèi)，均存在最大值。反應(yīng)pH值和反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值和蔗糖質(zhì)量濃度、反應(yīng)溫度和蔗糖質(zhì)量濃度之間都有一定的交互作用。當(dāng)反應(yīng)pH值和蔗糖質(zhì)量濃度分別達(dá)到6.3和410 g/L時(shí)，左聚糖產(chǎn)量隨著兩個(gè)變量的升高而升高，兩個(gè)變量進(jìn)一步升高時(shí)，左聚糖產(chǎn)量急劇下降。且它們的響應(yīng)曲面圖呈橢圓形，表明反應(yīng)pH值和蔗糖質(zhì)量濃度之間的交互作用顯著，對(duì)左聚糖產(chǎn)量的影響最大。其次為反應(yīng)溫度和蔗糖質(zhì)量濃度的交互作用，反應(yīng)pH值和反應(yīng)溫度的交互作用最不顯著。

根據(jù)Design-Expert軟件結(jié)果可知，左聚糖產(chǎn)量在反應(yīng)pH值A(chǔ)、反應(yīng)溫度B、蔗糖質(zhì)量濃度C的共同影響下的最佳工藝條件：反應(yīng)pH值為6.25、反應(yīng)溫度為25.88℃、蔗糖質(zhì)量濃度為409.20 g/L，在此條件下模型預(yù)測(cè)的左聚糖產(chǎn)量達(dá)到最大值，為138.42 g/L。為了驗(yàn)證本模型的準(zhǔn)確性，按照優(yōu)化后的試驗(yàn)條件，結(jié)合實(shí)際情況，進(jìn)行模型的驗(yàn)證。修正條件：反應(yīng)pH6.3，反應(yīng)溫度26℃，底物濃度410 g/L，按照修正條件在100 mL反應(yīng)體系中進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得左聚糖產(chǎn)量為（138.59±2.90）g/L，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果較接近，表明該模型具有良好的擬合性。同時(shí)，與未優(yōu)化前相比，該工藝條件下左聚糖產(chǎn)量提高了約80%。

2.3 放大體系試驗(yàn)

為考察酶法合成左聚糖所優(yōu)化條件的適用性，將優(yōu)化條件100 mL反應(yīng)體系擴(kuò)大到5 L后進(jìn)行大批量反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同反應(yīng)體積下左聚糖合成試驗(yàn)Fig.3 Levan production under different reaction volumes

由圖3可知，5 L反應(yīng)體系的蔗糖轉(zhuǎn)化率為（35.56±0.80）%、左聚糖產(chǎn)量為（130.15±3.30）g/L，與 100 mL反應(yīng)體系結(jié)果相近。體現(xiàn)了酶法合成左聚糖的效果較為穩(wěn)定，優(yōu)化的工藝條件是合理的，為工廠大批量生產(chǎn)左聚糖提供了參考。

3 討論

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)溫度對(duì)蔗糖轉(zhuǎn)化率和左聚糖產(chǎn)量均具有極其顯著的影響，由于重組左聚糖蔗糖酶是蛋白質(zhì)，溫度對(duì)蛋白的活性影響比較大，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使酶的活性遭到抑制，而且過(guò)高的溫度會(huì)使酶變性失活[1]，所以控制溫度在生產(chǎn)過(guò)程中具有極其重要的作用。本文研究的重組枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶的最適聚合溫度在25℃左右，分別為24℃和26℃，與相關(guān)學(xué)者[20]研究的枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶合成左聚糖溫度25℃相近。目前所報(bào)道的研究表明，來(lái)源不同的左聚糖蔗糖酶反應(yīng)溫度差別比較大[21]。左聚糖蔗糖酶催化的反應(yīng)不同，所對(duì)應(yīng)的最適溫度也不同，例如來(lái)自Brenneria goodwinii的左聚糖蔗糖酶的最適聚合和水解溫度分別為35℃和45℃[14]，來(lái)自丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae pv）[22]的左聚糖蔗糖酶最適聚合和水解溫度分別為18℃和60℃。甚至有研究表明即使是來(lái)源相同的左聚糖蔗糖酶轉(zhuǎn)果糖基合成左聚糖的最適溫度也不一樣，來(lái)自Bacillus amyloliquefaciens胞內(nèi)和胞外的左聚糖蔗糖酶的最適溫度分別為25℃～30℃和40℃，均低于最適水解溫度45℃～50℃和50℃[23]。

有研究發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的左聚糖蔗糖酶合成左聚糖的產(chǎn)量會(huì)隨著蔗糖質(zhì)量濃度的升高而有不同的趨勢(shì)。例如來(lái)自地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis 8-37-0-1）[24]、Bacillus amyloliquefaciens H47[11]的重組左聚糖蔗糖酶在蔗糖濃度超過(guò)一定濃度后（300 g/L左右）左聚糖產(chǎn)量開始降低，且Bacillus amyloliquefaciens H47重組左聚糖蔗糖酶在蔗糖質(zhì)量濃度為600 g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率降低到不足2%。但也有當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度達(dá)到一定程度后產(chǎn)量趨于穩(wěn)定的情況，例如來(lái)自Bacillus methylotrophicus SK 21.002[12]的左聚糖蔗糖酶，合成左聚糖產(chǎn)量在蔗糖質(zhì)量濃度為300 g/L時(shí)達(dá)到最高，隨后逐漸趨于穩(wěn)定。本文響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響極顯著，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度超過(guò)310g/L后，轉(zhuǎn)化率開始下降。Permatasari等[25]使用響應(yīng)面法優(yōu)化來(lái)自Bacillus licheniformis BK2的重組左聚糖蔗糖酶生產(chǎn)左聚糖時(shí)，發(fā)現(xiàn)蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)左聚糖產(chǎn)量的影響最大。由于左聚糖蔗糖酶擁有水解和聚合雙重活性，有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度超過(guò)10%時(shí)，左聚糖蔗糖酶催化水解反應(yīng)超過(guò)轉(zhuǎn)果糖基化反應(yīng)[22]。而且反應(yīng)體系的滲透壓和黏度隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加而增加，會(huì)導(dǎo)致酶的活性遭到抑制[25]。此外，來(lái)源不同的左聚糖蔗糖酶合成左聚糖的能力差別比較大。雖然蔗糖轉(zhuǎn)化為左聚糖的理論轉(zhuǎn)化率約為50%[18]，但已有研究中的實(shí)際蔗糖轉(zhuǎn)化率一般在20%～40%左右。來(lái)自Bacillus licheniformis的左聚糖蔗糖酶的蔗糖轉(zhuǎn)化率較高，可到40%以上[7]，但是其最適底物濃度為100 g/L，實(shí)際產(chǎn)量?jī)H為40 g/L左右，即該酶對(duì)底物的耐受性不高，限制了其生產(chǎn)應(yīng)用。有些左聚糖蔗糖酶雖然可以在實(shí)驗(yàn)室中得到比較高的轉(zhuǎn)化率，但產(chǎn)量不一定高，說(shuō)明只看蔗糖轉(zhuǎn)化率是不能評(píng)價(jià)左聚糖蔗糖酶的應(yīng)用價(jià)值的。本文采用中試發(fā)酵生產(chǎn)的重組枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶酶制劑可以在較高的底物濃度（300 g/L～400 g/L）下進(jìn)行反應(yīng)，說(shuō)明其底物耐受性比較高。且經(jīng)酶法合成左聚糖工藝優(yōu)化，得到的蔗糖轉(zhuǎn)化率（36.73±0.60）%和左聚糖產(chǎn)量（138.59±2.90）g/L，在已有報(bào)道中處于較高水平，顯著高于來(lái)自Bacillus subtilis natto[8]的左聚糖蔗糖酶合成左聚糖的產(chǎn)量（63.60 g/L）和轉(zhuǎn)化率（18.17%）。本工藝在5 L酶促反應(yīng)體系中能夠高效地生產(chǎn)左聚糖，顯示了其具有規(guī)模生產(chǎn)左聚糖的潛在應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本文應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了大腸桿菌重組枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)左聚糖的工藝條件。重組左聚糖蔗糖酶在310 g/L和410 g/L蔗糖質(zhì)量濃度下反應(yīng)分別得到最高的蔗糖轉(zhuǎn)化率和左聚糖產(chǎn)量，比優(yōu)化前分別提高了約19%和80%。得到的回歸模型能較好地反映相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量規(guī)律，為左聚糖生產(chǎn)提供了有效的理論支持。優(yōu)化的工藝在5 L體系中能夠穩(wěn)定高效地生產(chǎn)左聚糖，為進(jìn)一步量產(chǎn)左聚糖研究提供了基礎(chǔ)，具有良好的應(yīng)用潛力。