常程程， 丁梓雪， 王彥欽， 楊 帆， 孟憲剛

（蘭州交通大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

黃曲霉毒素是由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物， 主要是由一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)M成，是二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素有20 多種，常見的有AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。 其中AFB1的毒性最強(qiáng)，危害最大，因此被用來作為AF 的評價(jià)指標(biāo)（謝慧等，2020）。 玉米、小麥、花生、玉米秸稈等農(nóng)產(chǎn)品因貯存不當(dāng)或其他原因都會污染黃曲霉毒素。全世界范圍內(nèi)，每年有1600 萬t 糧食受到黃曲霉毒素污染，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

黃曲霉毒素具有極強(qiáng)的毒性和致癌性， 威脅農(nóng)業(yè)發(fā)展、糧食安全和人類健康。土壤中存在黃曲霉毒素的污染，可引起土壤理化性質(zhì)改變，土質(zhì)退化，使農(nóng)作物枯萎減產(chǎn)（王曉艷等，2021）。 中國食品中黃曲霉毒素允許量標(biāo)準(zhǔn)（μg/kg）為：花生油、堅(jiān)果和干果中AFB1≤20 μg/kg；玉米、花生仁制品中AFB1≤20 μg/kg；大米及其他食用油中AFB1≤10 μg/kg；面粉、發(fā)酵食品、淀粉類制品中AFB1≤5 μg/kg。 攝入后，AFB1和AFB2被肝臟代謝成它們的羥基化代謝物M1（AFM1）和M2（AFM2），它們可以在尿液、糞便中排泄（Tozzi 等，2016），可導(dǎo)致人和牲畜營養(yǎng)代謝不良、不孕、先天畸形、內(nèi)分泌紊亂 （邢福國等，2021；Valencia-Quintana 等，2020），嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)肝臟疾病，導(dǎo)致肝癌，對人體的免疫系統(tǒng)具有極大的危害性。 連續(xù)攝入少量黃曲霉毒素會慢性中毒， 一次攝入大量的黃曲霉毒素會中毒死亡（羅昱芬，2017；關(guān)心，2016）。

1 黃曲霉毒素的常見去除方法

實(shí)現(xiàn)糧食中黃曲霉毒素的去除， 可以通過主動預(yù)防和被動去除兩種方式，目前常用的降解AF的方法主要有物理方法、化學(xué)方法和生物方法。

1.1 物理法 物理法通過高溫加熱、吸附、紫外線照射、 超聲和低溫等離子體技術(shù)等方式（Wu等，2021），破壞細(xì)胞膜及DNA，防止細(xì)胞復(fù)制，殺死黃曲霉， 或使毒素結(jié)構(gòu)破壞使呋喃環(huán)的化學(xué)鍵斷開，或通過吸附劑將AFB1吸附，從而達(dá)到去除AFB1的效果 （賀冰，2016）。 張小勇等 （2015）用254、365 nm 和420 nm 三種不同波長的紫外燈照射大豆油脂，并對黃曲霉毒素B1去除情況進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)365 nm 波長紫外燈的去除效果最佳，為96.4%，達(dá)到食用油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求，但油脂、酸值及過氧化值升高，對油脂的質(zhì)量有一定影響。其優(yōu)點(diǎn)是時(shí)間短、見效快，如紫外線輻射具有很強(qiáng)的殺菌能力， 但紫外線輻射需要在特定波長下才能起作用，深度有限，存在降解不徹底的問題，且對糧食的質(zhì)量和營養(yǎng)價(jià)值有一定影響。

1.2 化學(xué)法 化學(xué)法是在加工過程中使用化學(xué)物質(zhì)與黃曲霉毒素發(fā)生反應(yīng)， 將黃曲霉毒素轉(zhuǎn)化為無毒或低毒的產(chǎn)物， 達(dá)到去除黃曲霉毒素的效果，常用的方法有強(qiáng)酸強(qiáng)堿處理法、臭氧熏蒸法、電解水技術(shù)等（盧丹等，2018）。強(qiáng)堿處理可以破壞黃曲霉毒素的內(nèi)酯環(huán)， 生成香豆素和無毒的鈉鹽（劉暢等，2010）。 楊威（2019）用一定pH 的NaOH液處理脫皮破碎的花生， 一段時(shí)間后花生油中AFB1含量逐漸降低，AFB1脫除率達(dá)98.0%， 但在處理過程中，酸價(jià)和碘值在國標(biāo)規(guī)定范圍內(nèi)，過氧化值超出了國標(biāo)限定值。 化學(xué)物質(zhì)對毒素降解徹底，有極強(qiáng)的滅活能力，但化學(xué)法成本高，操作復(fù)雜，具有一定危險(xiǎn)性，且容易發(fā)生二次污染，會有殘留，用于糧食作物營養(yǎng)成分流失很大，在大多數(shù)情況下應(yīng)用起來較為困難。

1.3 生物法 生物手段防控真菌污染是一種綠色、安全、高效的方法，包括微生物或植物提取物對黃曲霉毒素進(jìn)行吸附去除或分解代謝， 或是利用微生物的代謝產(chǎn)物拮抗真菌， 并控制環(huán)境條件（光照、水分和溫度等），抑制黃曲霉的孢子萌發(fā)和生長。 生物方法脫毒反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、成本低，具有較高的防控效果和應(yīng)用前景。

2 黃曲霉毒素的微生物去除方法

微生物去毒方法主要包括菌體吸附和生物降解兩種方式，近年來，已被證實(shí)許多細(xì)菌和真菌都有去除黃曲霉毒素的能力，如芽孢桿菌、腸桿菌、乳酸菌、沙雷氏菌、假單胞菌、紅球菌、米曲霉和黑曲霉等 （趙雪芹等，2020； 張盼等，2015；Deepak等，2015；楊文華，2013；翟翠萍等，2012）。 微生物通過酶促反應(yīng)破壞AFB1的毒性結(jié)構(gòu)位點(diǎn)雙呋喃環(huán)末端雙鍵、內(nèi)酯環(huán)和環(huán)戊烯酮環(huán)，產(chǎn)生無毒無害的降解產(chǎn)物。

2.1 微生物對黃曲霉毒素的吸附作用 在微生物吸附方面，研究最多的是酵母菌和乳酸菌，吸附方式主要為物理結(jié)合， 它們可以通過菌壁上的多糖（如肽聚糖和磷壁酸）有效地結(jié)合黃曲霉（Guan等，2021）。菌體通過細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)和成分、官能團(tuán)之間的化學(xué)鍵、 大分子之間的作用力和表面張力等與黃曲霉毒素結(jié)合在一起， 形成微生物-毒素復(fù)合體。

酵母菌和乳酸桿菌具有良好的吸附能力和發(fā)酵能力， 因此它們在黃曲霉毒素脫毒過程中能發(fā)揮重要作用（Aazami 等，2018）。 布拉酵母菌具有良好的益生效果，楚杰（2013）發(fā)現(xiàn)布拉酵母菌脫除AFB1的主要機(jī)理是吸附作用， 在處理30 min，pH為8.0 時(shí)對AFB1去除率達(dá)到60%以上。 劉暢（2010）從傳統(tǒng)自制發(fā)酵食品中分離到的11 種益生菌中， 發(fā)現(xiàn)菌株釀酒酵母Y1 對AFB1的吸附率可達(dá)32.11%， 經(jīng)100 ℃加熱滅活后， 吸附率顯著上升，達(dá)到49.53%。 通過掃描及透射電鏡觀察，加熱后菌體表面凹凸不平，細(xì)胞壁厚度增加，說明菌體加熱后由于接觸面積增加，提高了對AFB1的吸附能力。錢潘攀等（2017）用麝香草酚裂解并殺死酵母細(xì)胞，使細(xì)胞壁上肽聚糖的結(jié)構(gòu)改變，提取酵母膜脂與細(xì)胞壁制成去毒劑，使其具有抑制黃曲霉孢子萌發(fā)和吸附毒素的雙重能力。用薄層層析和液相色譜進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該提取物對黃曲霉毒素的吸附能力為2.5 μg/mg。 Haidukowski（2019）將食用菌菌絲體制成新型的吸附劑，結(jié)果表明，杏鮑菇非活菌絲體對AFB1的吸附率能達(dá)到85%，采用因子設(shè)計(jì)模型（DOE）比較多個(gè)因素對吸附率的影響，并進(jìn)行條件優(yōu)化后，側(cè)耳菌絲體吸附率達(dá)到90.7%。

革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁中含有大量的肽聚糖、多糖和蛋白質(zhì)，具有霉菌毒素吸附位點(diǎn)，故而成為吸附黃曲霉毒素的典型菌。 蔣采貝等（2019）研究了植物乳桿菌對AFB1的吸附能力和吸附特性，進(jìn)行單因素試驗(yàn)確定最佳條件后，吸附率最大值為58%， 熱致死菌體后對AFB1的吸附能力有明顯提高， 表明在吸附過程中起作用的主要部位是細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)和多糖等成分， 其多糖和肽聚糖對熱處理敏感。 唐纓等（2020）從西北酸菜培養(yǎng)物中分離出20 株具有黃曲霉毒素脫除能力的菌株，脫除率為18.37% ～65.06%，將脫毒能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行生理生化鑒定及16S rDNA 序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定為布氏乳桿菌。菌液離心后經(jīng)PBS 多次洗脫后，AFB1逐漸釋放， 菌株吸附率由65.06%逐漸下降至53.7%，說明該菌株對毒素的吸附取決于菌種自身的特異性， 雖然在過程中會有結(jié)合不緊密的毒素解離下來， 但是在多次洗脫后仍然保持較高的穩(wěn)定性。

生物吸附是一種有效的去除黃曲霉毒素的方式， 通過菌體結(jié)合毒素可以達(dá)到高效去除毒素的目的，但在試驗(yàn)過程中，隨著時(shí)間的延長，吸附率會逐漸下降， 與微生物結(jié)合不緊密的毒素會解離下來， 這表明吸附是一種可逆的過程。 Wacoo（2019）將飲料中提取的鼠李糖乳桿菌Yoba 和嗜熱鏈球菌C106 制成發(fā)酵菌劑，30 ℃發(fā)酵24 h 能將黃曲霉毒素降低到無法檢測到的水平， 體外熒光試驗(yàn)證實(shí)Yoba 細(xì)菌在該過程中與AFB1結(jié)合，但單靠吸附并不能達(dá)到這種效果， 推測其中既有菌體吸附，也有降解作用。

2.2 微生物對黃曲霉毒素的降解作用 近年來，國內(nèi)外關(guān)于微生物降解黃曲霉毒素做了很多研究，金佳佳（2019）以香豆素為唯一碳源，從發(fā)酵食品、豆類、土壤、動物腸道及培養(yǎng)物中篩選出9 株能夠去除黃曲霉毒素的菌株， 其中去除能力最高為90.7%，菌液與毒素反應(yīng)后，經(jīng)反復(fù)洗脫、萃取，萃取液中毒素的提取率極低，證明該菌株對AFB1有降解作用， 經(jīng)生理生化及分子生物學(xué)鑒定為枯草芽孢桿菌。 董慧燕（2021）分離了一株對AFB1有降解能力的菌株， 經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定，為銅綠假單胞菌，編號M4，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵條件， 將降解率從初始的34.10%提高到96.17%。 郭鈺婷（2019）以香豆素為唯一碳氮源，從動物糞便、發(fā)霉的糧食、土壤中篩選出一株可以降解AFB1的綠膿桿菌，發(fā)現(xiàn)其對降解起主要作用的是上清液。 邱天宇（2020）從醬醅中篩選出一株具有降解黃曲霉毒素能力的FS10 黑曲霉菌株， 優(yōu)化發(fā)酵條件后，對AFB1的降解率為95.01%， 且對花生粕中的四種黃曲霉毒素都具有較高的降解能力。 王海云（2013）從發(fā)霉的土壤和酒糟中取樣，篩選出7 株菌， 其中4 種菌對AFB1的降解能力均在70%以上，經(jīng)過鑒定，兩種菌為芽孢桿菌，兩種為短桿菌。

黃曲霉毒素的降解過程中， 共培養(yǎng)的菌株降解能力往往優(yōu)于單一的菌株， 兩種或多種菌株之間可能具有協(xié)同或互作。Wang（2013）從土壤樣品中分離出兩種菌，將其混合培養(yǎng)后并未相互抑制。兩種菌株的上清液對毒素的降解率分別為30.2%和36.5%，共培養(yǎng)后上清液降解率達(dá)到87.7%，相比單獨(dú)培養(yǎng)提高了對AFB1的降解率和降解速率，使上清液中蛋白含量和解毒酶含量升高，經(jīng)鑒定，兩種菌均為芽孢桿菌。王康（2020）測定兩種芽孢桿菌的降解率為70.65%和61.42%， 將菌株組合并優(yōu)化培養(yǎng)條件后降解率達(dá)到88.95%，說明結(jié)合菌株進(jìn)行混合培養(yǎng)的效果高于單一菌株。

本團(tuán)隊(duì)早期研究通過使用液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（UPLC-MS）及核磁共振氫譜，檢測枯草芽孢桿菌WTX1 降解黃曲霉毒素后的產(chǎn)物，得到5 種主要產(chǎn)物，推測菌株降解作用于香蘭素內(nèi)脂環(huán)和戊烯酮環(huán)結(jié)構(gòu)，并破壞呋喃環(huán)8，9 位的碳碳雙鍵， 進(jìn)行細(xì)胞毒理學(xué)試驗(yàn)得出降解后的產(chǎn)物對細(xì)胞形態(tài)、活性影響均不顯著，說明此菌株具有顯著解毒效果（唐瓔等，2021；唐瓔等，2021）。

2.3 降解AFB1的酶 菌體中的活性物質(zhì)如肽、細(xì)菌素、有機(jī)酸、小分子有機(jī)物等對黃曲霉均有抑制、拮抗的效果（王昌祿等，2021），但在降解過程中，發(fā)揮作用的主要是菌體中的酶，其多存在于細(xì)胞內(nèi)容物或胞外上清液中。近年來，利用真菌和細(xì)菌生物降解霉菌毒素已成為科研人員研究的熱點(diǎn)， 微生物降解霉菌毒素的機(jī)理實(shí)質(zhì)上就是在解毒酶作用下發(fā)生酶促降解，改變毒素的原始結(jié)構(gòu)，形成低毒或無毒的新物質(zhì)（紀(jì)俊敏等，2021）。

密環(huán)菌其產(chǎn)生的胞內(nèi)酶AFO 是二肽基肽酶III（DPP III）家族的典型成員（Guan 等，2015），可以作用于AFB1的呋喃環(huán)的稀醚鍵并將其轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物。 水解生成低毒的AFB1-8，9-二氫二醇以達(dá)到解毒的目的 （Wang 等，2019）。 Guan 等（2021）從玉米、水稻和土壤中分離出了能降解黃曲霉毒素的芽孢桿菌， 提取出一種降解酶（BADE），具有熱穩(wěn)定性，在70 ℃、pH 為8.0 時(shí)表現(xiàn)出最高的降解活性， 生成了新物質(zhì)。 宋茂鵬等（2021）發(fā)現(xiàn)降解AFB1的主要活性物質(zhì)位于假單胞菌的上清液中，HPLC 結(jié)果顯示72 h 后AFB1峰面積明顯小于對照組。 岳曉禹等（2017）發(fā)現(xiàn)嗜麥芽窄食單胞菌的胞外粗提液的降解能力最強(qiáng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該活性物質(zhì)主要是菌株的胞外代謝產(chǎn)物，推測為胞外酶類。Wang 等（2017）從AFB1平菇菌絲懸浮液和黑曲霉的分生孢子的混合液中過濾提取出解毒酶， 分子質(zhì)量分別為58 kDa 和63 kDa 的解毒酶對AFB 具有較高的降解性。 通過液相色譜-質(zhì)譜的方法聯(lián)用確定了8 種降解產(chǎn)物的具體成分和結(jié)構(gòu)公式，其毒性都較小或無毒，證明混合真菌培養(yǎng)物促進(jìn)了解毒酶的產(chǎn)生， 這可能比單獨(dú)的菌株降解AFB1更有效。 李文明（2013）用施氏假單胞菌內(nèi)的物質(zhì)，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，AFB1生成兩種新物質(zhì)。

在具有降解能力的菌株中， 許多酶對黃曲霉毒素具有較強(qiáng)的降解能力， 包括水解酶（Alberts等，2009）、過氧化物酶（Yehia 等，2014）、氧化還原酶（Xu 等，2017；Li 等，2019）。AFB1包含呋喃部分和內(nèi)酯環(huán)部分。 末端呋喃環(huán)上的雙鍵是AFB1癌癥和毒性的關(guān)鍵活性位點(diǎn)（賀冰，2016）。酶可以直接或間接作用于末端呋喃環(huán)中雙鍵或碳位點(diǎn)，降低或消除毒性（Wajiha 等，2016）。

漆酶已被證實(shí)具有對黃曲霉毒素的降解能力（姜宏等，2021），其作用于黃曲霉毒素的二呋喃環(huán)對其直接氧化（盧丹等，2018）。真菌錳過氧化物酶可以降解包括黃曲霉毒素在內(nèi)的四種真菌毒素，Wang（2019）從枯草芽孢桿菌中克隆出染料脫色過氧化物酶（DYP）基因，在大腸桿菌BL21 中表達(dá)，重組BsDyP 可以有效地降解AFB1，其在48 h內(nèi)被純化的BsDyP 降解至76.93%， 降解后AFB1呋喃環(huán)8，9 號位的碳碳雙鍵被氧化， 加上兩個(gè)羥基生成醇， 生成的AFB1-二醇的毒性小于AFB1。Qin（2021）發(fā)現(xiàn)在二羧酸丙二酸鹽存在下，八種錳過氧化物能夠降解四種主要的霉菌毒素， 包括AFB1，其中自由基起重要作用。 但錳過氧化物酶（MnPs）難以大量獲得，可以在畢赤酵母（Jiang 等，2008）或絲狀真菌（Conesa 等，2002）中獲得，然而它們很難重組表達(dá)， 如未來可以把精力放在基因工程中常用的平臺工業(yè)微生物上，或可促進(jìn)MnPs的大規(guī)模異源生產(chǎn)。

酶不易保存， 隨時(shí)間變化酶易鈍化， 失去活性。 降解酶的產(chǎn)生與分泌是否受毒素的誘導(dǎo)，單獨(dú)的酶對毒素的降解能力不如宿主菌株有效，因此真菌毒素的降解往往需要幾個(gè)或多個(gè)酶協(xié)同并發(fā)揮作用，且降解途徑并不明確，其具體機(jī)制還需要深入研究。 另外，在實(shí)際操作中存在一定難度，是否能夠?qū)⒔到饷富旌匣蛑瞥芍苿┐笈可a(chǎn)投入應(yīng)用，還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論與展望

花生、玉米、小麥等眾多糧食在儲存與運(yùn)輸過程中都會受到黃曲霉毒素的污染， 其毒性與致癌性極強(qiáng)，通過食物鏈的傳遞，危害牲畜與人類的健康。 因此研究一種高效、環(huán)保、安全的去毒方式和防控策略勢在必行。

黃曲霉毒素由黃曲霉菌和寄生曲霉產(chǎn)生，受到光照、溫度、濕度等環(huán)境因素影響，在此基礎(chǔ)上尋找一種能保持糧食營養(yǎng)價(jià)值的去毒方法應(yīng)用于農(nóng)業(yè)迫在眉睫。 現(xiàn)有的物理法包括加熱、吸附、紫外線照射、超聲和低溫等離子體技術(shù)等方式，去除毒素速度快，但降解不徹底，有殘留。 化學(xué)法通過化學(xué)反應(yīng)將毒素轉(zhuǎn)化為低毒或無毒產(chǎn)物， 常用的方法有強(qiáng)酸強(qiáng)堿處理法、臭氧熏蒸法、電解水技術(shù)等?；瘜W(xué)法降解徹底，但操作復(fù)雜，成本高，且化學(xué)藥品的殘留容易發(fā)生二次污染，不能達(dá)到綠色、安全的期望。 生物去除法通過微生物細(xì)胞壁等特殊結(jié)構(gòu)吸附毒素，將糧食與毒素分離；或通過微生物的生長特性， 利用黃曲霉毒素作為自身生長的碳源，達(dá)到降解的目的。生物去除方法可以有效的去除毒素并保證食品品質(zhì)，無毒無害，有很強(qiáng)的特異性和生物安全性。

因此利用微生物去除黃曲霉毒素是最有潛力和發(fā)展前景的方法， 篩選出對黃曲霉毒素具有高效拮抗作用的菌株是防治毒素污染領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌、假單胞菌、乳酸菌、酵母菌等對黃曲霉毒素有拮抗作用， 分離出微生物中的活性物質(zhì)， 并進(jìn)一步研究以闡明黃曲霉毒素的降解機(jī)制， 是今后防治真菌毒素污染應(yīng)用的重要基礎(chǔ)研究工作。