王 寧 ，婁鈺琦 ，褚衍凱 ，黃佳新 ，徐海冬 ，羅昊玉 ，婁 明 ，牟 芳

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.黑龍江省普通高等學(xué)校動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）是配體激活型轉(zhuǎn)錄因子，被配體激活后，PPARγ 與RXRα結(jié)合形成異二聚體，特異性結(jié)合于靶基因調(diào)控區(qū)PPAR 反應(yīng)元件，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄[1]。PPARγ是脂肪生成的重要調(diào)控因子，對(duì)維持正常胰島素敏感性及葡萄糖、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[2]。此外，PPARγ 與肥胖癥、Ⅱ型糖尿病等代謝性疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3]。

真核生物基因5'非翻譯區(qū)（5' untranslated region，5'UTR）在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用，調(diào)控mRNA 穩(wěn)定性、運(yùn)輸、定位及翻譯效率等[4-5]。5'UTR 調(diào)控作用依賴于其所包含的順式調(diào)控元件，目前已鑒定出的5'UTR順式調(diào)控元件包括RNA G-四鏈體（G-quadruplexes，RG4）、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（Internal ribosomal entry sites，IRES）、上游起始密碼子（Upstream start codons，uAUG）及上游開(kāi)放閱讀框（Upstream open reading frames，uORF）等[6]。PPARγ基因受多個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控，例如人和小鼠PPARγ基因分別存在4個(gè)和2個(gè)啟動(dòng)子[7-8]。由于多啟動(dòng)子使用和選擇性拼接，導(dǎo)致人PPARγ基因至少產(chǎn)生7個(gè)5'UTR不同轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體[9]。PPARγ基因 mRNA 和蛋白半衰期均較短[10]，提示轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在PPARγ基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。雞PPARγ基因有3 個(gè)啟動(dòng)子，產(chǎn)生5 個(gè)5'UTR不同的PPARγ轉(zhuǎn)錄本（cPPARγs1-5）[11]。雞PPARγ基因轉(zhuǎn)錄本 1（cPPARγ1）和PPARγ基因轉(zhuǎn)錄本 3（cPPARγ3）分別具有一個(gè)uORF，研究發(fā)現(xiàn)cPPARγ1 和cPPARγ3 的 uORF 均 抑 制 雞PPARγ基 因 翻譯[10,12]。雞PPARγ轉(zhuǎn)錄本 5（cPPARγ5）的 5'UTR 具有兩個(gè) uORFs，但這兩個(gè) uORFs 對(duì)雞PPARγ基因表達(dá)的影響尚不清楚。本研究采用報(bào)告基因和定點(diǎn)突變等技術(shù)，開(kāi)展cPPARγ5 兩個(gè)uORFs 功能分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司）， pGL3-basic 熒光素酶報(bào)告基因載體（購(gòu)自美國(guó)Promega 公司），海腎報(bào)告基因載體pGL3-TK（購(gòu)自美國(guó)Promega 公司），5'UTR 轉(zhuǎn)錄后分析用報(bào)告基因載體psiCHECK2（本實(shí)驗(yàn)室保存）[12]。雞永生化前脂肪細(xì)胞系ICP1（本實(shí)驗(yàn)室保存），雞胚成纖維細(xì)胞系DF1（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心）。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)Promega公司提供的psiCHECK2報(bào)告基因載體序列信息，設(shè)計(jì)hRluc和hFluc基因qRT-PCR表達(dá)檢測(cè)引物hRluc-F1/R1 和hFluc-F1/R1。根據(jù)已報(bào)道雞PPARγ基因轉(zhuǎn)錄本序列（NM_0010 01460.1），設(shè)計(jì)全長(zhǎng)編碼區(qū)（CDS）克隆引物cPPARγ-F/R。根據(jù)已報(bào)道雞cPPARγ5 mRNA 序列（GenBank 登錄號(hào)：KP736525），設(shè)計(jì) cPPARγ5 的5'UTR 區(qū)克隆引物 cPPARγ5-F1/R1 和 qRT-PCR 表達(dá)檢測(cè)引物cPPARγ5-F2/R2。hRluc基因qRT-PCR表達(dá)檢測(cè)選擇hFluc基因作為內(nèi)參基因；雞PPARγ基因qRT-PCR 表達(dá)檢測(cè)選擇NONO基因（TATA-binding protein gene）作為內(nèi)參基因。利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST檢測(cè)引物特異性，引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.3 載體構(gòu)建

1.3.1cPPARγ5 的 5'UTR 及其 uORF 突變的報(bào)告基因載體構(gòu)建

cPPARγ5 野生型 5'UTR 片段及其 3 個(gè) uORF 突變型5'UTR片段由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。uORF 突變是指uATG 突變?yōu)閡TGA，這3 個(gè)uORF 突變型5'UTR 片段分別是兩個(gè)uORFs 單獨(dú)突變型5'UTR片段（M1和M2）及兩個(gè)uORFs同時(shí)突變型5'UTR 片段（M12）。將這些合成的突變型5'UTR片段和野生型5'UTR 片段分別插入到psi-CHECK2M載體hRluc基因上游NheⅠ酶切位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-WT、psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-M12、psiCHECK-2M-cPPARγ5-5'UTR-M1和psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-M2，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，驗(yàn)證無(wú)誤后用于后續(xù)研究。

1.3.2 野生型和uORF突變型cPPARγ5真核表達(dá)載體構(gòu)建

利用引物cPPARγ-F/R，以ICP1 細(xì)胞cDNA 為模板擴(kuò)增雞PPARγ基因CDS片段（兩端攜帶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)），將其插入到pcDNA3.1 表達(dá)載體EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，將載體命名為pcDNA3.1-CDS。然后將合成的雞cPPARγ5 轉(zhuǎn)錄本野生型 5'UTR 片段和 3 個(gè) uORF 突變型 5'UTR 片段（兩端攜帶NheⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)）分別插入到pcDNA3.1-CDS 載體NheⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-cPPARγ5-WT、pcDNA3.1-cPPARγ5-M12、pcDNA3.1-cPPARγ5-M1 和 pcDNA3.1-cPPARγ5-M2，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，驗(yàn)證無(wú)誤后用于后續(xù)研究。

1.3.3cPPARγ5 的 5'UTR 及其 uORF 突變的啟動(dòng)子報(bào)告基因載體構(gòu)建

將合成的cPPARγ5 野生型 5'UTR 片段和 3 個(gè)uORF突變型5'UTR片段（兩端攜帶XhoⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)）分別插入到pGL3-basic 報(bào)告基因載體XhoⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pGL3-basic-cPPARγ5-WT、pGL3-basic-cPPARγ5-M12、pGL3-basic-cPPARγ5-M1 和 pGL3-basic-cPPARγ 5-M2，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，驗(yàn)證無(wú)誤后用于后續(xù)研究。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

ICP1 細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM/F12 完全培養(yǎng)基中，DF1 細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM High Glucose 完全培養(yǎng)基中，這兩種培養(yǎng)基均含有1%青鏈霉素和10%胎牛血清。放置在含5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24～48 h傳代一次。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)

將ICP1 和DF1 細(xì)胞分別接種于24 孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%匯合度時(shí)，按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagen（tInvitrogen，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)操作，將構(gòu)建完成的報(bào)告基因載體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 時(shí)利用Dual-Luciferase?Reporter Assay System（Promega，美國(guó)）試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)報(bào)告基因活性。cPPARγ5 的 5'UTR 及其 uORF 突變報(bào)告基因載體和啟動(dòng)子報(bào)告基因載體分別利用螢火蟲(chóng)熒光素酶（hFluc）活性和海腎熒光素酶（hRluc）活性進(jìn)行校正，其相對(duì)活性分別為hRluc/hFluc和hFluc/hRluc。

1.6 總RNA 提取和qRT-PCR檢測(cè)

利用RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN，德國(guó)）試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA。利用Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為：cDNA模板（50 ng·μL-1）1 μL，F(xiàn)ast Start Universal SYBR Green Master（ROX）（2×）5 μL，上下游引 物（10 μmol·L-1）各 0.2 μL， 滅 菌 蒸 餾 水3.6 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性 10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性延伸40 s，共40 個(gè)循環(huán)。分別以NONO和hFluc基因?yàn)閮?nèi)參基因，PPARγ和hFluc基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法為2-ΔΔCt。

1.7 Western blot分析

使用PBS 清洗3 遍細(xì)胞，加入含有PMSF（1 mmol·L-1）的RIPA 細(xì)胞裂解液（購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司），吹打混勻后于冰上孵育15min，充分裂解細(xì)胞，12 000 r·min-1離心5 min，取上清，利用BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度。然后取20 μg樣品蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳分離，結(jié)束后將樣品轉(zhuǎn)至NC 膜上，置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h；將膜用 PBST 洗滌后加入 1∶1 000 稀釋的雞 PPARγ 一抗（購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），室溫震蕩孵育2 h；將膜用PBST 洗滌后加入1∶5 000 稀釋的HRP標(biāo)記的二抗（山羊抗兔）（購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），室溫震蕩孵育1 h，將膜用PBST洗滌后進(jìn)行ECL顯色反應(yīng)。

1.8 mRNA穩(wěn)定性檢測(cè)

將cPPARγ5 的野生型 5'UTR 及其 uORF 突變的報(bào)告基因載體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后，加入放線菌素D 至終濃度為5 μg·mL-1，分別處理0（對(duì)照）、3、6、9 和12 h。收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用qRT-PCR 檢測(cè)hRluc基因mRNA 表達(dá)，以hFluc基因?yàn)閮?nèi)參基因，以0 h的mRNA表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)，利用2-ΔΔCt分別計(jì)算各報(bào)告基因載體hRluc基因mRNA半衰期。

1.9 數(shù)據(jù)分析

本研究qRT-PCR 數(shù)據(jù)和熒光素酶相對(duì)活性試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Graphpad Prism 7.0 軟件分析顯著性，數(shù)據(jù)表示為平均值（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）。使用Student'st-test進(jìn)行差異分析，*P＜0.05表示差異顯著，**P＜0.01 表示差異極顯著。使用線性回歸分析法進(jìn)行uORF對(duì)hRluc基因mRNA穩(wěn)定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 cPPARγ5 5'UTR區(qū)uORF分析

雞cPPARγ5 的 5'UTR 序 列 長(zhǎng) 度 為 252 nt（KP736525）。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該5'UTR 存在兩個(gè)uORFs，分別位于-213/-199 和-168/-139區(qū)，命名為uORF1和uORF2（見(jiàn)圖1）。

圖1 雞PPARγ基因轉(zhuǎn)錄本5（cPPARγ5）5'UTR區(qū)的uORF分析Fig.1 uORF analysis of the 5'UTR of chicken PPARγ transcript variant 5(cPPARγ5)

2.2 cPPARγ5的uORF對(duì)報(bào)告基因表達(dá)的影響

為探索雞cPPARγ5 兩個(gè)uORFs 功能，分別構(gòu)建野生型5'UTR（psi-CHECK2M-cPPARγ5-5'UTRWT）、兩個(gè)uORFs單獨(dú)突變（psiCHECK2M-cPPARγ 5-5'UTR-M1 和 psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTRM2）以及兩者同時(shí)突變（psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-M12）的報(bào)告基因載體。將這些報(bào)告基因載體分別轉(zhuǎn)染DF1 和ICP1 細(xì)胞，48 h 后檢測(cè)報(bào)告基因活性。結(jié)果顯示，在DF1和ICP1細(xì)胞中，uORF1 和uORF2 單獨(dú)突變型（psiCHECK2M-cPPARγ 5-5'UTR-M1 和 psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTRM2）報(bào)告基因活性均顯著或極顯著高于野生型（psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-WT）報(bào)告基因活性；uORFs 雙突變型（psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-M12）報(bào)告基因活性極顯著高于psiCHECK 2M-cPPARγ5-5'UTR-M1 和psiCHECK2M-cPPARγ 5-5'UTR-M2 報(bào)告基因活性，如圖2A 所示。其中，在DF1 細(xì)胞中，uORFs 雙突變型、uORF1 和uORF2 單獨(dú)突變型報(bào)告基因活性分別為野生型報(bào)告基因活性的2.8、2.0 和1.4 倍。在ICP1 細(xì)胞中，uORFs 雙突變型、uORF1 和uORF2 單獨(dú)突變型報(bào)告基因活性分別為野生型報(bào)告基因活性的8.5、6.8 和2.8 倍，數(shù)據(jù)說(shuō)明這兩個(gè)uORFs 具有協(xié)同作用。

為進(jìn)一步了解uORF抑制報(bào)告基因活性分子機(jī)制，采用qRT-PCR 檢測(cè)各個(gè)報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hRluc基因mRNA 表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DF1 細(xì)胞中，uORF1 突變型報(bào)告基因載體（psi-CHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-M1）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hRluc基因mRNA 表達(dá)水平顯著高于野生型，uORF2 突變型報(bào)告基因載體（psiCHECK2M- cPPARγ5-5'UTR-M2）和uORFs 雙突變型報(bào)告基因載體（psi-CHECK2M-cPPARγ5- 5'UTR-M12）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hRluc基因mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著變化。在ICP1細(xì)胞中，uORF1突變型報(bào)告基因載體（psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-M1）和uORF2 突變型報(bào)告基因載體（psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-M2）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hRluc基因mRNA 表達(dá)水平顯著高于野生型，如圖2B 所示，uORFs 雙突變型報(bào)告基因載體（psi-CHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-M12）轉(zhuǎn) 染 細(xì) 胞 的hRluc基因mRNA 表達(dá)水平無(wú)顯著變化。對(duì)比雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖2A）和hRluc基因mRNA表達(dá)分析結(jié)果（見(jiàn)圖2B），雖然uORF突變后hRluc基因mRNA表達(dá)在DF1和ICP1細(xì)胞中均升高，但mRNA 表達(dá)升高幅度遠(yuǎn)小于報(bào)告基因活性。與野生型相比，在DF1 細(xì)胞中，uORF1 突變型轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hRluc基因mRNA 表達(dá)僅是野生型的1.2倍；在ICP1細(xì)胞中，uORF2突變型和uORFs雙突變型轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hRluc基因mRNA 表達(dá)僅是野生型的1.15 倍。綜上，這兩個(gè)uORFs 突變主要抑制下游主閱讀框（Main open reading frame，mORF）翻譯。

圖2 uORF突變對(duì)報(bào)告基因活性和報(bào)告基因mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effects of uORF mutation on activity and mRNA expression of reporter gene

2.3 cPPARγ5 的 uORF 對(duì) mRNA 穩(wěn)定性調(diào)控分析

在ICP1 細(xì)胞中，uORF1 單突變以及uORF1 和uORF2 雙突變導(dǎo)致hRluc基因mRNA 表達(dá)水平升高（見(jiàn)圖2B），推測(cè)cPPARγ5的uORF可能影響mRNA穩(wěn)定性。為驗(yàn)證這一推測(cè)，分別檢測(cè)3 種uORF 突變型對(duì)hRluc基因mRNA 穩(wěn)定性的影響。半衰期測(cè)定結(jié)果顯示，野生型報(bào)告基因載體（psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-WT）轉(zhuǎn) 染 細(xì) 胞 的hRluc基 因mRNA 半衰期為7.20 h，uORFs 雙突變型報(bào)告基因載體（psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-M12）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hRluc基因 mRNA 半衰期為 7.43 h（見(jiàn)圖 3A），uORF1 突變型報(bào)告基因載體（psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-M1）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hRluc基因mRNA半衰期為6.15 h（見(jiàn)圖3B），uORF2突變型報(bào)告基因載體（psiCHECK2M-cPPARγ5-5'UTR-M2）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hRluc基因 mRNA 的半衰期為 8.35 h（見(jiàn)圖 3C）。與野生型相比，這3 種uORF 突變型報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hRluc基因mRNA 降解速率均無(wú)顯著差異，說(shuō)明cPPARγ5 的兩個(gè) uORFs 對(duì) mRNA 穩(wěn)定性無(wú)顯著影響。

圖3 uORF突變對(duì)報(bào)告基因mRNA穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of uORF mutation on mRNA stability of reporter gene

2.4 cPPARγ5 的 uORF 對(duì) PPARγ 基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

為排除uORF 僅在報(bào)告基因表達(dá)中發(fā)揮作用，進(jìn)一步分析這兩個(gè)uORFs 對(duì)PPARγ基因表達(dá)的影響。將構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-cPPARγ5-WT、 pcDNA3.1-cPPARγ5-M12、 pcDNA3.1-cPPARγ5-M1 和 pcDNA3.1-cPPARγ5-M2 分別轉(zhuǎn)染DF1和ICP1細(xì)胞，采用qRT-PCR和Western blot 分別檢測(cè)雞PPARγ基因mRNA 和蛋白表達(dá)。qRTPCR 結(jié)果顯示，在ICP1 細(xì)胞中，與野生型相比，uORF1 突變型表達(dá)載體（pcDNA3.1-cPPARγ5-M1）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PPARγ基因mRNA 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），但上調(diào)幅度較小；uORF2突變型表達(dá)載體（pcDNA3.1-cPPARγ5-M2）和uORFs 雙突變型表達(dá)載體（pcDNA3.1-cPPARγ5-M12）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PPARγ基因mRNA 表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，但無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)變化（見(jiàn)圖4A）。在DF1 細(xì)胞中，uORF1 突變型表達(dá)載體（pcDNA3.1-cPPARγ5-M1）和uORFs雙突變型表達(dá)載體（pcDNA3.1-cPPARγ5-M12）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PPARγ基因mRNA 表達(dá)顯著升高，但上調(diào)幅度較小；uORF2 突變型表達(dá)載體（pcDNA3.1-cPPARγ5-M2）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PPARγ基因mRNA 表達(dá)無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)變化（見(jiàn)圖4A）。Western blot 結(jié)果顯示，在ICP1 和DF1 細(xì)胞中，與野生型相比，3 個(gè)uORF突變型的PPARγ蛋白表達(dá)均極顯著升高，其中uORFs雙突變型表達(dá)載體（pcDNA3.1-cPPARγ5-M12）的 PPARγ 蛋白表達(dá)最高，分別上調(diào)約 1.7 倍（ICP1細(xì)胞）和1.3倍（DF1細(xì)胞），如圖4B所示。以上結(jié)果表明，cPPARγ5 的兩個(gè)uORFs 均抑制下游PPARγ mORF翻譯。

圖4 uORF突變對(duì)cPPARγ5 mRNA和蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of uORF mutation on the expression of cPPARγ5 mRNA and protein

2.5 5'UTR區(qū)啟動(dòng)子活性檢測(cè)

5'UTR 在基因組中相應(yīng)DNA 序列通常是啟動(dòng)子一部分。在前述研究中所使用5'UTR報(bào)告基因載體和表達(dá)載體中，uORF 突變可能影響5'UTR 啟動(dòng)子活性，導(dǎo)致報(bào)告基因和PPARγ基因表達(dá)發(fā)生變化。為驗(yàn)證這一推測(cè)，將構(gòu)建的啟動(dòng)子報(bào)告基因載 體 pGL3- basic、 pGL3- basic- cPPARγ5- WT、pGL3-basic-cPPARγ5-M1、pGL3-basic-cPPARγ 5-M2 和 pGL3-basic-cPPARγ5-M12 分別轉(zhuǎn)染 ICP1細(xì)胞。報(bào)告基因活性結(jié)果顯示，pGL3-basic-cPPARγ5-WT、pGL3-basic-cPPARγ5-M1、pGL3-basic-cPPARγ5-M2 和 pGL3-basic-cPPARγ5-M12報(bào)告基因活性均極顯著高于pGL3-basic 空載體報(bào)告基因活性（P＜0.01），約是pGL3-basic 空載體報(bào)告基因活性5～6倍（見(jiàn)圖5）。

圖5 cPPARγ5 5'UTR區(qū)啟動(dòng)子活性分析Fig.5 Promoter activity analysis of the 5'UTR of cPPARγ5

與野生 型 pGL3-basic-cPPARγ5-WT 相比，pGL3-basic-cPPARγ5-M12 啟動(dòng)子活性顯著升高，但升高幅度較?。籶GL3-basic-cPPARγ5-M1 和pGL3-basic-cPPARγ5-M2 啟動(dòng)子活性無(wú)顯著變化（見(jiàn)圖5）。上述結(jié)果表明，cPPARγ5 的5'UTR 區(qū)具有啟動(dòng)子活性，uORFs雙突變?cè)鰪?qiáng)啟動(dòng)子活性，但uORF1或uORF2單獨(dú)突變對(duì)啟動(dòng)子活性影響較小。

3 討 論

uORF 普遍存在于真核生物基因mRNA，是真核生物基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控重要元件之一[6,13]。大量研究證實(shí)，多數(shù)uORF 主要抑制基因翻譯[14-15]，但也有部分uORF 促進(jìn)基因翻譯[16]。除翻譯調(diào)控外，研究發(fā)現(xiàn)uORF還可調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性，例如TPO基因 uORF 可導(dǎo)致其 mRNA 降解[17]，而GCN4和YAP1 基因 uORF 可增強(qiáng)其 mRNA 穩(wěn)定性[18]。本研究采用報(bào)告基因、qRT-PCR、Western blot 及定點(diǎn)突變等技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，cPPARγ5 的uORFs（uORF1 和uORF2）并不影響mRNA 穩(wěn)定性，但抑制下游mORF翻譯。

前期研究表明，uORF 對(duì)下游mORF 翻譯的抑制作用受uORF 數(shù)量、長(zhǎng)度、uORF 距下游CDS 起始密碼子距離及uORF起始密碼子及其上下游序列影響，uORF 抑制作用可累加，即同一轉(zhuǎn)錄本中uORF 數(shù)量越多，對(duì)下游基因抑制作用越強(qiáng)[19]。Zhang 等在果蠅中發(fā)現(xiàn)，基因含有一個(gè)uORF 時(shí)，其翻譯效率降低8.38%～30.40%，而基因含有多個(gè)uORF 時(shí)，其翻譯效率降低18.4%～60.7%[20]。Chew等對(duì)人、鼠和斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)錄本中uORF的生物信息學(xué)分析顯示，uORF 數(shù)量與翻譯效率呈負(fù)相關(guān)[21]。本研究結(jié)果與上述報(bào)道相似，uORF1 和uORF2 雙突變對(duì)報(bào)告基因活性和PPARγ 蛋白表達(dá)的抑制作用顯著高于這兩個(gè)uORF 單獨(dú)突變的抑制作用（見(jiàn)圖4A 和 4B），說(shuō)明 uORF1 和 uORF2 對(duì)下游 mORF 的翻譯抑制具有協(xié)同作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，uORF 突變導(dǎo)致hRluc和PPARγ基因mRNA 表達(dá)升高（見(jiàn)圖2A 和圖4A），進(jìn)一步mRNA 穩(wěn)定性分析顯示，uORF 突變對(duì)hRluc基因mRNA 穩(wěn)定性無(wú)顯著影響，如圖3 所示，這表明uORF 突變促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。許多基因5'UTR 相應(yīng)DNA 序列具有啟動(dòng)子活性，例如Nomura 等發(fā)現(xiàn)V（1b）加壓素受體基因5'UTR 的相應(yīng)DNA 序列具有啟動(dòng)子活性，uORF 抑制5'UTR 啟動(dòng)子活性，抑制該 基因轉(zhuǎn) 錄[22]； Li 等發(fā) 現(xiàn)WNK8 基 因 5'UTR 相應(yīng)DNA序列具有啟動(dòng)子活性，uORF突變可增強(qiáng)該基因啟動(dòng)子活性，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[23]。本試驗(yàn)證明cPPARγ5 的 5'UTR 相應(yīng) DNA 序列確實(shí)具有啟動(dòng)子活性，且uORF突變一定程度上增強(qiáng)啟動(dòng)子活性，如圖5 所示，這一結(jié)果表明uORF 突變導(dǎo)致hRluc和PPARγ基因mRNA表達(dá)升高，原因是uORF突變引起5'UTR啟動(dòng)子活性增強(qiáng)。

雞和哺乳動(dòng)物脂肪生成和代謝不同，例如，雞僅有白色脂肪組織且具有天然高血糖和胰島素抗性，雞脂肪細(xì)胞脂肪分解受胰高血糖素調(diào)節(jié)[24]；雞脂肪細(xì)胞分化不需要胰島素，但需要脂肪酸[25]。McClelland 等研究表明人、鼠和雞PPARγ基因5'UTR序列相似性較低，長(zhǎng)度也存在較大差異，且人和鼠PPARγ基因5'UTR中不存在uORF[9-10]。這些數(shù)據(jù)提示，哺乳動(dòng)物和雞PPARγ基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控不同，本研究及cPPARγ1和cPPARγ3的uORF研究均發(fā)現(xiàn)，uORF在雞PPARγ基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用[10,12]，uORF 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能是哺乳動(dòng)物和雞脂肪生成、脂肪發(fā)育和胰島素敏感性表現(xiàn)差異的一個(gè)重要原因。本研究不足之處是缺乏體內(nèi)研究，未來(lái)有必要利用CRISPR/Cas9 技術(shù)分析uORFs 在體內(nèi)PPARγ基因表達(dá)調(diào)控、雞脂肪生成、脂肪細(xì)胞表型維持、胰島素抵抗以及雞體脂過(guò)度沉積中作用和機(jī)制。

4 結(jié) 論

cPPARγ5 兩個(gè) uORF 不影響 mRNA 穩(wěn)定性，但抑制下游PPARγ基因mORF的翻譯。