馬航宇，張士凱，吳澎

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271000）

益生菌、益生元和合生元是常見的微生態(tài)制劑，其中益生菌對腸道菌群進(jìn)行調(diào)節(jié)[1]，益生元為益生菌提供營養(yǎng)底物[2]，合生元是有益宿主的益生菌和益生元的混合物[3]，具有益生功能和治療多種疾病的作用[4]。植物乳桿菌是一種兼性異型乳酸發(fā)酵[5]的革蘭氏陽性益生菌，其來源安全，擁有廣泛的代謝多樣性，被用作各種發(fā)酵食品的功能性發(fā)酵劑[6-7]。益生菌應(yīng)在加工、儲存和胃腸道消化過程中保持較高的活力，而植物乳桿菌對高酸環(huán)境敏感[8]，并且在這些過程中還面臨著高溫和膽汁的威脅。目前微膠囊技術(shù)可以很好地解決食品中生物活性物質(zhì)不穩(wěn)定的問題[9]，該技術(shù)可以在加工和儲存期間保護(hù)植物乳桿菌免受外部壓力，并保護(hù)植物乳桿菌到達(dá)作用部位時免受蛋白酶降解和pH值的影響[10]，從而提高植物乳桿菌的耐酸性能。根據(jù)包裹益生菌的類型，益生菌的食品級遞送系統(tǒng)可分為蠶繭和“蜘蛛網(wǎng)”，前者采用外部保護(hù)層包圍內(nèi)部的益生菌，后者借助于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)保護(hù)益生菌，微膠囊則屬于前者[11]。海藻酸鈉微膠囊是在二價陽離子（通常是CaCl2溶液形式的鈣離子）存在下通過離子凝膠形成[12]，每個鈣離子均與4個α-L-古洛糖醛酸鈉（G）單體的羧基和羥基配位，形成所謂的“蛋盒”模型[13]，然而，當(dāng)磷酸鹽和檸檬酸等螯合劑以及鈉或鎂離子等非膠凝陽離子存在時，海藻酸鈉微膠囊在化學(xué)上是不穩(wěn)定的[14]。殼聚糖可以進(jìn)一步強化海藻酸鈉微膠囊的凝膠結(jié)構(gòu)，它是一種從天然聚合物甲殼素中提取的聚陽離子多糖，與海藻酸鈉形成聚電解質(zhì)復(fù)合物（聚陰離子聚合物），陽離子殼聚糖的加入，可以對海藻酸鈉進(jìn)行包覆從而形成微膠囊[15]。近年來，海藻酸鈉微膠囊的生產(chǎn)已經(jīng)達(dá)到了益生菌包封的關(guān)鍵要求[16]，包括生物相容性、生物降解性以及長期儲存性等[17]。將特定的益生菌與高度選擇性的益生元進(jìn)行配對，使益生元作為益生菌的食物來源[18]，是穩(wěn)定改變腸道微生物群最具前景的方法之一。

黃精多糖（Polygonatum polysaccharide，PP）是黃精主要的活性與功能成分之一，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫力[19]等作用，它在發(fā)揮多糖作用的同時可以影響腸道菌群的生長，因此可以作為益生元協(xié)同植物乳桿菌生長，與其構(gòu)成合生元，促進(jìn)益生作用。菊粉（inulin，IL）是一種天然的低聚果糖，由果糖基經(jīng)β-糖苷鍵鏈接而成，每個分子通常含有一個末端葡萄糖基，這些糖苷鍵使菊粉能夠抵抗動物或人類胃腸道酶的水解[20]。因此，菊粉被認(rèn)為是一種常見的益生元，并且被證明其能夠增加微生物數(shù)量和降低結(jié)腸內(nèi)容物的pH值[21]。研究表明，益生菌與益生元組合成的合生元能促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡[22-23]，如嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌與菊粉組成的合生元能有效緩解小鼠結(jié)腸炎癥并提高腸道有益菌屬比例[24]，但不同微生態(tài)制劑治療潰瘍性結(jié)腸炎的效果有很大差異[25]。到目前為止，關(guān)于多種益生元復(fù)配與海藻酸鈉結(jié)合成微膠囊用于益生菌封裝的研究較少。

本試驗將黃精多糖和菊粉進(jìn)行復(fù)配并與植物乳桿菌合成合生元，采用擠壓法將其微膠囊化，隨后采用冷凍干燥技術(shù)進(jìn)行干燥處理，再進(jìn)行體外模擬胃腸液消化實驗，研究不同質(zhì)量比的益生元對植物乳桿菌的益生效果，同時評估合生元微膠囊對胃腸液的耐受性能以及植物乳桿菌在胃腸道中的釋放效果，基于這些研究，得到最優(yōu)的益生元質(zhì)量比，從而提高植物乳桿菌對腸胃液的耐受能力和微膠囊的貯藏穩(wěn)定性，為新型益生菌食品的研究與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌HH-LP56：西安聚生源生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；海藻酸鈉、甘油、乳果糖、胃蛋白酶（1∶3 000 NFU/g）、胰蛋白酶（1∶250 NFU/mg）：北京索萊寶科技有限公司；菊粉：河南晟發(fā)生物科技有限公司；黃精：取樣于山東泰安徂徠山地區(qū)；磷酸二氫鉀、無水CaCl2、冰乙酸、殼聚糖（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；海藻糖：上海麥克林生化科技有限公司；脫脂乳粉：新西蘭乳品集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10N冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；303-00A全自動恒溫培養(yǎng)箱：天津市賽得利斯實驗分析儀器制造廠；BCL-1360B型超凈工作臺：北京亞太科隆儀器技術(shù)有限公司；HJ-6多頭加熱磁力攪拌器：國華儀器制造有限公司；TGL-20bR高速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FCD-2000恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上?，樮帉嶒炘O(shè)備有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器：常州智博瑞儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃精多糖的制備

參照賈宇涵等[26]的超聲波輔助提取法對黃精多糖進(jìn)行提取優(yōu)化，選擇成熟度適宜、無損傷腐爛的熟黃精切片烘干，磨干成粉，過40目篩。準(zhǔn)確稱取5 g黃精粉末，按照料液比1∶13（g/mL）添加去離子水，在超聲功率325 W的條件下超聲27 min，8 000 r/min離心15 min后過濾，加入無水乙醇后置于冰箱冷藏（4℃、24 h）后轉(zhuǎn)入烘箱干燥成粉末狀備用。

1.3.2 植物乳桿菌生長曲線的測定

將植物乳桿菌活菌以無菌操作按照5%接種量將菌種分別接種到不含益生元和含1%益生元（IL與PP質(zhì)量比為 0 ∶5、2 ∶3、1 ∶1、3 ∶2、5 ∶0）的 MRS 液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)24 h，調(diào)整培養(yǎng)基初始pH值為5.9，每隔2 h取適量菌液，在600 nm下測定菌液的吸光度，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制生長曲線。

1.3.3 植物乳桿菌微膠囊的制備

首先將活化2代～3代的植物乳桿菌8 000 r/min離心5 min，收集菌泥沉淀與一定濃度的海藻酸鈉溶液混合，進(jìn)行充分?jǐn)嚢枋蛊渚鶆?。在含有一定質(zhì)量的100 mL殼聚糖溶液中加入1%的冰乙酸使殼聚糖溶解，加入一定質(zhì)量的無水CaCl2在磁力攪拌器上使其充分混合均勻至無顆粒狀沉淀。將海藻酸鈉混合液通過5 mL管狀注射器（6號針頭）勻速逐滴滴入到殼聚糖—CaCl2溶液中形成濕態(tài)微膠囊，磁力攪拌15 min使微膠囊與固化液充分接觸，然后置于4℃冰箱靜置固化備用。用0.9%滅菌生理鹽水充分沖洗微膠囊表面，洗去表面浮菌，將其與凍干保護(hù)劑（脫脂乳6%、海藻糖8%、甘油4%、乳果糖8%）混合均勻后，在-20℃冰箱預(yù)凍24 h，壓力1.0 MPa，冷凍干燥24 h得到植物乳桿菌微膠囊顆粒。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 海藻酸鈉濃度對微膠囊包埋率的影響

在殼聚糖濃度0.8%，CaCl2濃度0.3 mol/L，固化時間3 h，海藻酸鈉濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的條件下，按照1.3.3的方法制備植物乳桿菌微膠囊，以微膠囊包埋率為評定指標(biāo)，考察海藻酸鈉濃度對微膠囊包埋率的影響。

1.3.4.2 CaCl2濃度對微膠囊包埋率的影響

在殼聚糖濃度0.8%，海藻酸鈉濃度2%，固化時間3 h，CaCl2濃度分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L 的條件下，按照1.3.3的方法制備植物乳桿菌微膠囊，以微膠囊包埋率為評定指標(biāo)，考察CaCl2濃度對微膠囊包埋率的影響。

1.3.4.3 殼聚糖濃度對微膠囊包埋率的影響

在海藻酸鈉濃度2%，CaCl2濃為0.3 mol/L，固化時間3 h，殼聚糖濃度為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的條件下，按照1.3.3的方法制備植物乳桿菌微膠囊，以微膠囊包埋率為評定指標(biāo)，考察殼聚糖濃度對微膠囊包埋率的影響。

1.3.4.4 固化時間對微膠囊包埋率的影響

在殼聚糖濃度0.8%，海藻酸鈉濃度2%，CaCl2濃度 0.3 mol/L，固化時間為 1、2、3、4、5 h 的條件下，按照1.3.3的方法制備植物乳桿菌微膠囊，以微膠囊包埋率為評定指標(biāo)，考察固化時間對微膠囊包埋率的影響。

1.3.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度、殼聚糖濃度及固化時間4個因子為自變量，以包埋率為評價指標(biāo)，正交試驗優(yōu)化制備微膠囊因素水平見表1。

表1 正交試驗優(yōu)化制備微膠囊因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design for optimizing the preparation conditions of microcapsules

1.3.6 合生元微膠囊的制備

參照1.3.3的方法制備微膠囊，將菌泥沉淀分別與不同質(zhì)量比的益生元（IL與PP質(zhì)量比分別為0∶5、2∶3、1∶1、3∶2、5∶0）混合均勻，再與 2%海藻酸鈉溶液混合攪拌均勻。將海藻酸鈉混合液勻速滴入100 mL含有殼聚糖（0.8%）-CaCl2（0.3 mol/L）溶液中形成濕態(tài)微膠囊，攪拌后置于4℃冰箱靜置固化3 h。用0.9%滅菌生理鹽水充分沖洗微膠囊表面，洗去表面浮菌，將其與凍干保護(hù)劑混合均勻后，在-20℃冰箱預(yù)凍24 h，壓力1.0 MPa，冷凍干燥24 h得到植物乳桿菌微膠囊顆粒。

1.3.7 微膠囊粒徑的測定

用游標(biāo)卡尺隨機取不同質(zhì)量比益生元的合生元微膠囊若干，取平均值得到合生元微膠囊的粒徑分布情況。

1.3.8 微膠囊包埋率以及存活率的測定

以海藻酸鈉為壁材的微膠囊可以于檸檬酸鈉溶液中輕微振蕩實現(xiàn)崩解[27]。取1 g不同質(zhì)量比益生元的合生元微膠囊置于9 mL 3%檸檬酸鈉溶液中進(jìn)行裂解，溶液置于37℃水浴恒溫振蕩器，在180 r/min條件下?lián)u勻60 min。裂解后進(jìn)行活菌計數(shù)，計算公式如下。

式中：N為微膠囊包埋的活菌數(shù)，cfu/mL；N1為包埋前添加的活菌數(shù)，cfu/mL。

不同質(zhì)量比益生元的凍干合生元微膠囊，用檸檬酸鈉溶液進(jìn)行裂解處理，利用活菌計數(shù)計算微膠囊中植物乳桿菌的存活率和活菌率。存活率的計算公式如下。

式中：S為凍干后合生元微膠囊的活菌數(shù)，cfu/mL；S0為凍干前的微膠囊的植物乳桿菌活菌數(shù)，cfu/mL。

活菌率的計算公式如下。

式中：N2為凍干后微膠囊中的活菌數(shù)，cfu/mL；V為裂解液的體積，mL；M為微膠囊的質(zhì)量，g。

1.3.9 體外模擬腸胃液消化

1.3.9.1 模擬胃液的配制

胃液按照Amakiri等[28]的方法進(jìn)行優(yōu)化制備。準(zhǔn)確移取1 mol/L稀鹽酸1.64 mL加入至90 mL無菌水中，攪拌均勻后再向其中加入1.00 g胃蛋白酶，充分?jǐn)嚢杈鶆?，最后用無菌水定容至100 mL，放入4℃冰箱備用。

1.3.9.2 模擬腸液的配制

腸液按照Amakiri等[28]的方法進(jìn)行優(yōu)化制備。準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀0.68 g于50 mL的無菌水中，攪拌至充分溶解，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至6.8；另準(zhǔn)確稱取胰蛋白酶1.00 g于30 mL無菌水中，攪拌至充分溶解；將上述兩種液體混合后加無菌水定容至100 mL，放入4℃冰箱備用。

1.3.9.3 連續(xù)胃腸液消化實驗

對照組：取1 mL植物乳桿菌菌液加入9 mL胃液中，180 r/min振蕩處理2 h后，吸取混合液100 μL，適當(dāng)稀釋后涂板計數(shù)。將模擬胃液處理后的混合液4 000 r/min離心15 min，收集菌體。將菌體加入9 mL腸液中，180 r/min振蕩處理2h后，吸取混合液100 μL，適當(dāng)稀釋后涂板計數(shù)。

實驗組：分別取1 g各質(zhì)量比微膠囊顆粒加入到9 mL胃液中，充分搖勻混合后置于37℃搖床（180 r/min），充分搖勻2 h。將混合均勻的菌液進(jìn)行梯度稀釋，然后取最佳梯度稀釋濃度100 μL的菌液進(jìn)行涂布計數(shù)。將胃液處理后收集的微膠囊加入9 mL腸液中，180 r/min振蕩處理2 h，搖勻后涂板計數(shù)。

1.3.9.4 腸胃液分別釋放實驗

取1mL植物乳桿菌菌液、1g未添加益生元的植物乳桿菌微膠囊和5種不同質(zhì)量比益生元的合生元微膠囊顆粒分別加入至9 mL胃液和9 mL腸液中，充分搖勻混合后置于37℃搖床（180 r/min），充分搖勻2 h。將混合均勻的菌液先進(jìn)行梯度稀釋，然后在合適濃度梯度下進(jìn)行涂布計數(shù)。

腸胃液消化實驗前對微膠囊進(jìn)行裂解處理計數(shù)，調(diào)整菌液濃度，保證菌液和微膠囊的初始菌濃度在同一數(shù)量級。

1.3.10 儲存穩(wěn)定性

將冷凍干燥后不同質(zhì)量比益生元的合生元微膠囊放置于若干玻璃小瓶中，將其分別置于-20、4、25℃保藏63 d。每隔7 d取出1 g凍干微膠囊顆粒進(jìn)行活菌數(shù)測定，檢測不同質(zhì)量比益生元的微膠囊貯存穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為3次獨立重復(fù)試驗的結(jié)果，均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用Excel和SPSS 22.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05時有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌生長曲線結(jié)果與分析

測定植物乳桿菌的生長曲線對植物乳桿菌的培養(yǎng)研究具有重要的意義。一方面，它可以反映出試驗中所采用的菌種在液體培養(yǎng)基中的生長和繁殖能力；另一方面，根據(jù)生長曲線可以判斷出達(dá)到最多活菌數(shù)的時間，以實現(xiàn)效益最大化，還可以指導(dǎo)試驗進(jìn)度，對整個工藝進(jìn)行優(yōu)化[29]。添加不同質(zhì)量比益生元（IL∶PP）的植物乳桿菌的生長曲線見圖1。

圖1 添加不同質(zhì)量比益生元（IL∶PP）的植物乳桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus plantarum with prebiotics of different mass ratios（IL ∶PP）

由圖1可知，植物乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時間的延長，OD值不斷增加。OD值反映了發(fā)酵液中的菌群數(shù)量，變化率反映了菌群的生長速度[30]。培養(yǎng)18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，此時OD值最高，代表著最大生物量。配養(yǎng)16 h時生物量最大，為最佳發(fā)酵點，因此選擇16 h～20 h內(nèi)的發(fā)酵液進(jìn)行后續(xù)試驗。并且通過對比發(fā)現(xiàn)，IL與PP質(zhì)量比為2∶3的OD值最大可達(dá)到1.175 2，高于不添加益生元的最大值1.140 1，且添加不同質(zhì)量比益生元的植物乳桿菌OD值整體高于未添加益生元的OD值，即添加益生元對植物乳桿菌有協(xié)同生長的作用，其中IL與PP質(zhì)量比為2∶3時OD值和變化率最大，即增殖效果最佳。

2.2 單因素試驗結(jié)果

各因素對微膠囊包埋率的影響見圖2。

圖2 單因素對微膠囊包埋率的影響Fig.2 Influences of single factors on microcapsule embedding rate

由圖2a可知，當(dāng)海藻酸鈉濃度小于2.0%時，植物乳桿菌微膠囊的包埋率隨著海藻酸鈉濃度的升高而升高；當(dāng)海藻酸鈉濃度為2.0%時，微膠囊的包埋率達(dá)到最大，為80.3%；海藻酸鈉濃度繼續(xù)增大時，包埋率降低，可能是海藻酸鈉菌液混合液黏度增大使植物乳桿菌混合不均所致[31]。

由圖2b可知，當(dāng)CaCl2濃度小于0.3 mol/L時，植物乳桿菌合生元微膠囊的包埋率隨著CaCl2濃度的增加而增大；當(dāng)CaCl2濃度為0.3 mol/L時，合生元微膠囊的包埋率達(dá)到最大；隨著CaCl2濃度繼續(xù)增大時，包埋率反而降低。這可能是由于CaCl2濃度增大，使Ca2+濃度增大，無法提供給Ca2+更多的結(jié)合位點[32]，難以繼續(xù)包埋植物乳桿菌，導(dǎo)致包埋率下降。

由圖2c可知，當(dāng)殼聚糖濃度達(dá)到0.8%時，植物乳桿菌微膠囊的包埋率最大；當(dāng)殼聚糖濃度小于0.8%時，隨著殼聚糖濃度的增加，殼聚糖與海藻酸鈉結(jié)合愈加緊密，減少了植物乳桿菌的擴散，降低菌體損失，使得包埋率增加；當(dāng)殼聚糖濃度大于0.8%時，植物乳桿菌微膠囊的包埋率略微降低，但降低不明顯，原因可能是殼聚糖濃度的增加減少了包埋過程中的菌體損失。

由圖2d可知，植物乳桿菌微膠囊的包埋率整體隨著固化時間的延長，包埋率增加。當(dāng)達(dá)到3 h時，微膠囊的包埋率最大，此后隨著時間的延長，包埋率有所下降，可能是因為固化時間較長導(dǎo)致植物乳桿菌微膠囊出現(xiàn)菌液滲透的情況，致使微膠囊內(nèi)活菌數(shù)下降，包埋率有所降低。因此，綜合時間以及節(jié)約成本，選擇海藻酸鈉濃度2%、CaCl2濃度0.3 mol/L、殼聚糖濃度0.8%、固化時間3 h作為后續(xù)試驗條件。

2.3 正交試驗結(jié)果

以單因素試驗中獲得的微膠囊最佳制備條件進(jìn)行正交試驗，采用四因素三水平正交分析法探究海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、CaCl2濃度、固化時間對植物乳桿菌微膠囊包埋效果的影響，以確定最終微膠囊制備條件，結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2可知，極差R的大小順序為A＞C＞D＞B，即海藻酸鈉濃度對微膠囊包埋率的影響最大，K1、K2、K3中數(shù)值最大的為相應(yīng)水平的最優(yōu)解，因此A2B2C2D2組合為最佳制備條件，經(jīng)驗證該條件下包埋率達(dá)到（80.44±0.10）%，明顯高于其他組合。因此，選擇A2B2C2D2組合進(jìn)行后續(xù)試驗，以包埋率為評價指標(biāo)，最佳的工藝參數(shù)為海藻酸鈉濃度2%、CaCl2濃度0.3 mol/L、殼聚糖濃度0.8%、固化時間3 h。

2.4 合生元微膠囊的粒徑分布

合生元微膠囊的粒徑分布情況見圖3。

圖3 不同質(zhì)量比益生元的微膠囊粒徑分布Fig.3 Size distribution of microcapsules of prebiotics with different mass ratios

由圖3可知，不同質(zhì)量比益生元對微膠囊的粒徑分布也有一定影響，IL與PP質(zhì)量比為5∶0時，微膠囊粒徑均值1.583 3 mm；IL與PP質(zhì)量比為3∶2時，微膠囊粒徑均值1.613 3 mm；IL與PP質(zhì)量比為1∶1時，微膠囊粒徑均值1.723 3 mm；IL與PP質(zhì)量比為2∶3時，微膠囊粒徑均值1.893 3 mm；IL與PP質(zhì)量比為0∶5時，微膠囊粒徑均值2.163 3 mm。可以看出，微膠囊粒徑隨著黃精多糖含量的增加而增加，IL與PP質(zhì)量比為0∶5時，微膠囊粒徑最大，可能是由于黃精多糖含量增加，其微粒直徑相較于菊粉較大，導(dǎo)致微膠囊粒徑有所增加。

2.5 合生元微膠囊包埋率的測定

包埋率是評價微膠囊非常重要的一個試驗指標(biāo)，它反映了制備過程中壁材對芯材的包埋情況。包埋率越高，說明益生菌與外界環(huán)境接觸越少，對益生菌的保護(hù)作用越強[33]。本試驗中，IL和PP的加入有益于植物乳桿菌的包埋。在添加不同質(zhì)量比益生元的微膠囊中，其植物乳桿菌活菌率如圖4所示。

圖4 不同質(zhì)量比益生元（IL∶PP）對植物乳桿菌合生元微膠囊包埋率的影響Fig.4 Effect of prebiotics with different mass ratios（IL∶PP）on the encapsulation rate of Lactobacillus plantarum synbiotics microcapsules

由圖4可知，微膠囊包埋率分別為80.44%（未添加）、81.37%（5 ∶0）、86.83%（3 ∶2）、86.18%（1 ∶1）、92.61%（2∶3）、89.39%（0∶5），可見微膠囊對合生元具有很好的包埋效果，且在IL與PP質(zhì)量比為2∶3時，包埋率最高，為92.61%，微膠囊顏色呈淺黃棕色。

2.6 凍干微膠囊的活菌率以及植物乳桿菌的存活率

冷凍干燥是一種用來延長益生菌制品保質(zhì)期的方法，作為傳統(tǒng)干燥方法的一種有效替代，其涉及不加熱的脫水過程，使收縮范圍變小，有助于降低敏感性和保存生物活性材料[34]。益生菌在凍干過程中存活率會下降。冰晶的形成、膜的破壞、細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的高滲透性、細(xì)胞內(nèi)大分子的變性和水的去除是凍干過程中益生菌生存能力喪失的重要原因[35]。不同質(zhì)量比益生元對微膠囊活菌率的影響見表3。

表3 不同質(zhì)量比益生元（IL∶PP）對微膠囊活菌率的影響Table 3 Effect of prebiotics（IL ∶PP）with different mass ratios on the viability of microcapsules

由表3可知，經(jīng)濃縮后的原菌液活菌數(shù)為1.76×1010cfu/mL，添加益生元的微膠囊的活菌率均高于未添加，可能是益生元的益生作用提高了植物乳桿菌的存活率。植物乳桿菌可以利用IL和PP，先將其分解為果糖，然后在細(xì)胞內(nèi)對其進(jìn)行利用。同時，IL酶與植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的水解酶，專門作用于IL的β-2，1鍵，產(chǎn)生果糖或低聚果糖，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)更容易代謝從而促進(jìn)了植物乳桿菌的生長；提取PP時，所得的較多單糖成分也為植物乳桿菌的生長代謝提供了原料，因此含有益生元的微膠囊活菌率較高。

不同質(zhì)量比益生元的合生元微膠囊對植物乳桿菌存活率的影響見圖5。

圖5 不同質(zhì)量比益生元（IL∶PP）合生元微膠囊對植物乳桿菌存活率的影響Fig.5 Effect of prebiotic（IL ∶PP）synbiotic microcapsules with different mass ratios on the survival rate of Lactobacillus plantarum

由圖5可以看出，不同質(zhì)量比益生元在冷凍干燥過程中具有保護(hù)效果。添加益生元的微膠囊相較于未添加的微膠囊，植物乳桿菌的存活率顯著提高（P＜0.05），其中IL與PP質(zhì)量比為2∶3時，存活率最高，達(dá)到81.44%，僅使用擠壓法制備的未添加益生元的微膠囊存活率相對較低。Jouki等[36]研究發(fā)現(xiàn)，添加益生元的微膠囊可以提高植物乳桿菌在微膠囊中的存活率，使微膠囊的耐受凍干能力增強，與本試驗結(jié)果一致。

2.7 合生元微膠囊體外消化性質(zhì)

2.7.1 合生元微膠囊在腸胃液中的穩(wěn)定性

植物乳桿菌作為益生菌，必須在胃環(huán)境中存活下來，并以足夠多的數(shù)量（需在106cfu/mL以上）到達(dá)結(jié)腸以促進(jìn)定植[37]。植物乳桿菌合生元微膠囊腸胃液連續(xù)作用釋放結(jié)果見表4。

表4 植物乳桿菌合生元微膠囊腸胃液連續(xù)作用釋放結(jié)果Table 4 Release of Lactobacillus plantarum in synbiotic microcapsules in simulated gastrointestinal fluid lg（cfu/mL）

由表4可知，當(dāng)植物乳桿菌進(jìn)入胃液后，由于胃液的強酸特性，使植物乳桿菌數(shù)目大幅度下降，從8.67 lg（cfu/mL）下降至 2.13 lg（cfu/mL），下降了 6.54 lg（cfu/mL），而微膠囊通過胃液處理2 h后，活菌數(shù)仍能達(dá)到 7 lg（cfu/mL）以上，僅僅下降了 1 lg（cfu/mL），可以看出微膠囊對植物乳桿菌的保護(hù)作用大幅提升，耐胃液能力加強，達(dá)到腸液后活菌數(shù)仍均保持在6 lg（cfu/mL）以上，即可以在腸道內(nèi)發(fā)揮良好的益生作用。并且通過連續(xù)模擬人工腸胃液實驗，可以發(fā)現(xiàn)，IL與PP質(zhì)量比為2∶3時，微膠囊的耐酸性最強，在腸液中的釋放數(shù)目最多，植物乳桿菌的存活率也最高。

2.7.2 合生元微膠囊在人工胃液中的釋放

植物乳桿菌菌液/微膠囊在人工胃液中的比較見圖6。

圖6 植物乳桿菌菌液/微膠囊在人工胃液中的比較Fig.6 Comparison on the survival rate of Lactobacillus plantarum liquid/microcapsule in simulated gastric fluid

如圖6所示，未經(jīng)包埋的植物乳桿菌被胃液侵蝕，存活率急劇下降，120 min后菌體消耗殆盡，存活率僅24.57%，遠(yuǎn)低于包埋后的微膠囊的存活率，說明微膠囊化植物乳桿菌可以明顯提高植物乳桿菌對胃酸的耐受能力。并且，120 min后合生元微膠囊胃液的存活率均高于未添加益生元的微膠囊，可以看出復(fù)配益生元對植物乳桿菌有一定益生作用，可以提高微膠囊對酸性條件的抵抗能力；當(dāng)IL與PP質(zhì)量比為2∶3時，微膠囊中植物乳桿菌的存活率最高，活菌數(shù)能達(dá)到7.43 lg（cfu/mL），存活率高達(dá) 85.8%，耐酸性更強，有利于減少胃酸的破壞，使足夠數(shù)量的植物乳桿菌能夠到達(dá)腸道發(fā)揮作用。

2.7.3 合生元微膠囊在人工腸液中的釋放

植物乳桿菌微膠囊在人工腸液中的釋放見圖7。

圖7 植物乳桿菌微膠囊在人工腸液中的釋放Fig.7 Release of Lactobacillus plantarum microcapsules in simulated intestinal fluid

由圖7可以看出，植物乳桿菌微膠囊在腸液中前20 min釋放速度最快，60 min后釋放曲線趨于平緩，釋放速度開始減慢，120 min時腸液中的微膠囊基本裂解完全。植物乳桿菌微膠囊與合生元微膠囊釋放率相比，合生元微膠囊的釋放率更高，腸溶性較好。在IL與PP質(zhì)量比為2∶3時，合生元微膠囊腸液釋放率最高，同時腸液中的植物乳桿菌也具有最高的存活率。綜上，復(fù)配益生元的微膠囊擁有更好的腸胃液耐受能力，IL與PP質(zhì)量比為2∶3時，合生元微膠囊的耐酸性和腸溶性最好。

2.8 儲存穩(wěn)定性分析

為了評估合生元微膠囊的儲存穩(wěn)定性，將不同質(zhì)量比益生元的微膠囊分別在-20、4、25℃條件下儲存63 d，每7 d進(jìn)行1次活菌數(shù)測定，得到的存活率結(jié)果見圖 8～圖 10。

圖8 合生元微膠囊在-20℃下的保藏性Fig.8 Storage stability of symbiotic microcapsules at-20℃

圖9 合生元微膠囊在4℃下的保藏性Fig.9 Storage stability of symbiotic microcapsules at 4℃

圖10 合生元微膠囊在25℃下的保藏性Fig.10 Storage stability of symbiotic microcapsules at 25℃

由圖8～圖10可知，合生元微膠囊在-20℃時表現(xiàn)出最佳的儲存穩(wěn)定性。隨著儲存時間的延長，微膠囊的活菌數(shù)均有所下降，可能是由于營養(yǎng)底物的消耗和代謝過程中產(chǎn)生的化合物（酸、細(xì)菌素）的存在。在-20℃和4℃時，微膠囊存活率下降相較于25℃明顯減少，可以看出低溫有利于活菌微膠囊的保藏。合生元微膠囊在室溫（25℃）下儲存21 d后植物乳桿菌存活率明顯下降，這可能是由于膠囊壁材的水活性，導(dǎo)致微膠囊內(nèi)植物乳桿菌代謝增加，周圍儲存環(huán)境變差，儲存穩(wěn)定性降低。同時可以看出，益生元的益生作用使添加益生元的微膠囊存活率明顯高于未添加，在IL與PP質(zhì)量比為2∶3時，微膠囊的存活率最高，并且可以在低溫下保持相對穩(wěn)定。因此選擇-20℃對IL與PP質(zhì)量比為2∶3的合生元微膠囊進(jìn)行保藏。

3 結(jié)論

植物乳桿菌對酸性條件敏感，在腸胃液中生存能力低。本試驗以海藻酸鈉和殼聚糖為壁材，使用擠壓法對不同質(zhì)量比益生元（IL∶PP）和植物乳桿菌一同進(jìn)行包埋，制備了合生元植物乳桿菌微膠囊，來提高植物乳桿菌的腸胃液耐受能力，并通過正交試驗確定了制備微膠囊的最佳工藝，最終選取質(zhì)量比2∶3（IL∶PP）作為制備合生元微膠囊的最優(yōu)益生元質(zhì)量比。試驗結(jié)果表明，益生元對植物乳桿菌具有益生作用，OD值增加，其生物量和基質(zhì)消耗量明顯增加；在連續(xù)性腸胃液實驗和腸胃液分別釋放實驗中可以看出，微膠囊明顯降低了胃酸對植物乳桿菌的侵害作用，包埋后的微膠囊在胃酸中60 min內(nèi)幾乎可以崩解完全，并且在腸液仍能保持較高的存活率；合生元微膠囊在腸胃液中呈現(xiàn)出良好的耐酸性和腸溶性，有利于植物乳桿菌在腸道中的定植；低溫有利于微膠囊的儲存，其貯藏穩(wěn)定性明顯高于常溫貯藏，結(jié)果表明-20℃貯藏效果最佳。

本文探討了合生元微膠囊制備工藝及最優(yōu)益生元質(zhì)量比，所制備的合生元微膠囊具備良好的釋放性能和存活率，在新型益生菌功能食品的開發(fā)研究中有良好的應(yīng)用前景，有望為促進(jìn)腸道益生菌的靶向釋放提供一種新的參考。