田 玉，楊玉淑，韓玉祥，丁 萌，彭晨星

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，河北 石家莊 050000

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及多器官、多系統(tǒng)，具有高異質(zhì)性特征的自身免疫性疾病[1-2]。炎癥反應(yīng)和免疫紊亂是SLE發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)[3]。腎小球?yàn)V過屏障(glomerular filtration barrier，GFB)受損所導(dǎo)致的蛋白尿是SLE腎損傷的重要臨床表現(xiàn)，而人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(human glomerular endothelial cell，HRGEC)是GFB的重要組成部分。因此，探討HRGEC在SLE腎損傷中的作用十分重要。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一種存在于真核細(xì)胞核中的非組蛋白核蛋白，細(xì)胞損傷后，HMGB1可大量釋放至細(xì)胞外，除直接刺激細(xì)胞，還會與DNA、細(xì)胞因子、外源性因子、核小體等形成免疫刺激復(fù)合物，在自身免疫性疾病和炎癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[4]。有研究表明，狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)患者血清HMGB1水平明顯升高，且與蛋白尿、狼瘡活動指數(shù)呈正相關(guān)[5]，提示HMGB1可能參與了SLE患者腎損傷的發(fā)生過程。但HMGB1是否參與了SLE中HRGEC的損傷尚未明確。本研究以SLE腎損傷患者血漿刺激HRGEC來模擬疾病的微環(huán)境，旨在探討HMGB1在SLE中對HRGEC通透性的影響，以期為臨床治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2020年1月至2022年3月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院行血漿置換術(shù)治療的50例SLE患者為研究對象。以24 h尿蛋白定量0.5 g為標(biāo)準(zhǔn)將患者分為A組(無蛋白尿，n=27)和B組(有蛋白尿，n=23)。另選取同期于我院體檢的50例健康者納入健康組。SLE患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)未合并血液系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤；(3)未合并重要器官嚴(yán)重?fù)p傷；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并糖尿??；(2)妊娠或哺乳期女性；(3)精神狀態(tài)較差，無法配合本研究。A組中，男性3例，女性24例；年齡29～53歲，平均40.90歲。B組中，男性5例，女性18例；年齡20～56歲，平均37.80歲。健康組中，男性11例，女性39例；年齡25～62歲，平均40.92歲。各組研究對象年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 血清學(xué)檢查 采集所有研究對象空腹靜脈血，離心收集血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿HMGB1、內(nèi)皮素-1、溶性血管細(xì)胞黏附分子(soluble vascular cell adhesion molecule，sVCAM-1)水平，所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。HMGB1、sVCAM-1、內(nèi)皮素-1酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 HRGEC培養(yǎng) 原代HRGEC購自美國sciencell公司。使用含10% FBS、Penicillin、Streptomycin、生長添加劑的ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)HRGEC，每2～3 d換液1次，將細(xì)胞置于含5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃靜置培養(yǎng)。

1.2.3 CCK8檢測細(xì)胞活力 將HRGEC分為control組與LN組。control組以健康者血漿刺激細(xì)胞，LN組以SLE腎損傷血漿刺激細(xì)胞，刺激濃度分別為0、5%、10%、15%和20%，孵育24 h后利用CCK8試劑盒檢測各組細(xì)胞的增殖活力。

1.2.4 跨膜電阻檢測 利用transwell小室構(gòu)建HRGEC單層，應(yīng)用跨細(xì)胞電阻儀測定control組與LN組SLE腎損傷血漿刺激6 h、12 h、18 h、24 h細(xì)胞層的跨膜電阻(transepithelial electrical resistance，TEER)。Transwell小室使用前給予牛纖維連接蛋白包被，加入全培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱平衡過夜。將HRGEC細(xì)胞懸液以1×105個/ml接種于transwell小室上室，下室加入培養(yǎng)基，另設(shè)只有培養(yǎng)基的空白孔。鏡下觀察細(xì)胞呈融合狀態(tài)，且反復(fù)多次跨膜電阻儀測定TEER值穩(wěn)定24 h以上，提示HRGEC單層構(gòu)建成功。測量空白孔的電阻值，連續(xù)測量3次，取平均值。TEER值=(各孔電阻值-空白孔電阻值)×transwell上室底面積，結(jié)果重復(fù)5次。

1.2.5 FITC-BSA法檢測HRGEC單層的通透率 測定control組與LN組SLE腎損傷血漿刺激6 h、12 h、18 h、24 h的HRGEC單層的通透率。在transwell小室上室接種細(xì)胞，待TEER值穩(wěn)定24 h后，PBS漂洗小室，根據(jù)分組在上室分別加入相應(yīng)的試劑，同時加入5 mg/ml的FITC-BSA 0.1 ml，下室加入等摩爾、無標(biāo)記的BSA 0.3 ml，避光環(huán)境下37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計要求孵育不同時間后，分別從上室及下室吸取培養(yǎng)基，倍比稀釋，利用熒光分光光度計檢測上室、下室樣品的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長520 nm)。FITC-BSA購自北京索萊寶科技有限公司。

采用通透系數(shù)(P)表示內(nèi)皮細(xì)胞單層對BSA的通透性大小，通透率的計算公式：P=[F](1/A)(v/[L])。[F]為下室FITC-BSA的熒光強(qiáng)度，A為transwell上室底面積，v為下室溶液體積，[L]為上室熒光強(qiáng)度。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

通透率=(LN組P/control組P)×100%

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白的表達(dá) 以冰生理鹽水沖洗LN組與control組細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗后給予0.5% Triton 100打孔，再次PBS沖洗，正常山羊血清封閉后滴加兔抗血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白(VE-cadherin)一抗(1∶200)， 4℃過夜，滴加FITC-羊抗兔IgG，37℃孵育后PBS沖洗，防淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照。兔抗VE-cadherin單克隆抗體購自CST公司。

1.2.7 HMGB1對HRGEC單層的通透率的影響 細(xì)胞分組：control組、LN組、LN+HMGB1中和抗體(LN+H ab)組、LN+對照IgG抗體(LN+IgG ab)組。control組給予健康血漿刺激細(xì)胞，LN組給予SLE腎損傷血漿刺激細(xì)胞，LN+H ab組及LN+IgG ab組分別給予HMGB1中和抗體(沈陽萬類生物)及對照IgG抗體預(yù)處理細(xì)胞30 min，然后給予SLE腎損傷血漿刺激細(xì)胞12 h，其他操作同1.2.5。

2 結(jié)果

2.1 各組研究對象血漿HMGB1、內(nèi)皮素-1、sVCAM-1水平比較 A組和B組血漿HMGB1、內(nèi)皮素-1、sVCAM-1水平均明顯高于健康組，且B組高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組研究對象血漿HMGB1、內(nèi)皮素-1、sVCAM-1水平比較

2.2 CCK8細(xì)胞活力檢測結(jié)果 CCK8結(jié)果顯示，隨著血漿刺激濃度的增加，control組細(xì)胞活力無明顯改變(P>0.05)；當(dāng)刺激濃度為10%、15%、20%時，LN組細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)，因此在后續(xù)的試驗(yàn)中選取10%作為刺激濃度。見圖1。

圖1 CCK8細(xì)胞活力檢測結(jié)果

2.3 SLE腎損傷血漿刺激HRGEC不同時間TEER值變化 LN組刺激12 h、18 h、24 h的TEER分別為(7.33±1.03)Ω·cm2、(6.15±1.18)Ω·cm2、(4.77±1.32)Ω·cm2，均顯著低于control組的(11.23±0.58)Ω·cm2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。LN組刺激6 h的TEER為(11.03±1.40)Ω·cm2，與control組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 SLE腎損傷血漿刺激HRGEC不同時間通透率變化 LN組刺激6 h時HRGEC的熒光通透率為(104.27%±6.59%)，與control組的100.00%比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。LN組刺激12 h、18 h、24 h的通透率分別為(137.22%±14.88%)、(156.92%±14.28%)、(200.06%±10.08%)，均顯著高于control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 SLE腎損傷血漿刺激HRGEC細(xì)胞間VE-cadherin表達(dá)結(jié)果 免疫熒光結(jié)果顯示，control組VE-cadherin于細(xì)胞間緊密連接處連續(xù)表達(dá)，而LN組VE-cadherin的分布不連續(xù)，細(xì)胞間隙增大，部分VE-cadherin表達(dá)在細(xì)胞漿，提示細(xì)胞間緊密連接受損。見圖2。

2.6 HMGB1中和抗體預(yù)處理后各組HRGEC細(xì)胞TEER值及熒光通透率變化 與control組比較，LN組的TEER值明顯下降、熒光通透率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與LN組比較，LN+H ab組TEER值明顯升高、熒光通透率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3～4。

圖2 免疫熒光檢測HRGEC細(xì)胞膜上的VE-cadherin表達(dá)(a.control組；b.LN組；bar=25 μm) 圖3 各組HRGEC細(xì)胞TEER值檢測結(jié)果 圖4 各組HRGEC細(xì)胞熒光通透率檢測結(jié)果

2.7 HMGB1中和抗體預(yù)處理后各組HRGEC細(xì)胞間VE-cadherin表達(dá) 免疫熒光結(jié)果顯示，LN+H ab組細(xì)胞間VE-cadherin的表達(dá)較LN組有所增加，提示細(xì)胞間緊密連接有所改善。見圖5。

圖5 免疫熒光顯示各組HRGEC細(xì)胞間VE-cadherin表達(dá)的情況(a.control組；b.LN組；c.LN+H ab組；d.LN+IgG ab組；bar=25 μm)

3 討論

HRGEC是一種高度分化的內(nèi)皮細(xì)胞，位于GFB的最外層。GFB的屏障功能和完整性對于維持血管穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損，細(xì)胞間的緊密連接松散，細(xì)胞形態(tài)收縮，一些大分子物質(zhì)如白蛋白從細(xì)胞旁漏出，導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管通透性增加，進(jìn)而出現(xiàn)蛋白尿。有研究報道，SLE患者存在內(nèi)皮細(xì)胞損傷，且SLE與動脈粥樣硬化進(jìn)展及心血管事件風(fēng)險有關(guān)[7]。內(nèi)皮素-1是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的高效內(nèi)源性血管收縮肽，參與了慢性腎病的發(fā)生發(fā)展，且與SLE活動度有關(guān)[8-9]。sVCAM-1已被證實(shí)在LN患者的血清中明顯升高，且與內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示，A組和B組患者血漿內(nèi)皮素-1、sVCAM-1水平均明顯升高，且B組升高更為明顯，提示SLE腎損傷患者存在更嚴(yán)重的內(nèi)皮血管病變。此外，在體外試驗(yàn)中，筆者利用transwell小室構(gòu)建HRGEC單層模型以模擬腎小球內(nèi)皮屏障，以SLE腎損傷血漿刺激HRGEC，結(jié)果顯示，HRGEC單層的跨細(xì)胞電阻降低、熒光通透率增加，細(xì)胞間VE-cadherin表達(dá)減少，細(xì)胞間緊密連接破壞，提示SLE腎損傷患者HRGEC單層的通透性增加。

HMGB1是高遷移率族蛋白家族成員，具有25 kda的分子量和2個帶正電荷的核酸結(jié)合序列。細(xì)胞外的HMGB1作為一種損傷相關(guān)分子模式，會激活免疫系統(tǒng)并促進(jìn)炎癥發(fā)生[11]。有研究報道，活動性LN的SLE患者血液及尿液中HMGB1水平較健康者明顯升高[12-13]。本研究結(jié)果顯示，血漿HMGB1在SLE患者中明顯升高。這提示，HMGB1可能在SLE腎損傷中發(fā)揮重要作用。HMGB1可以與TOLL樣受體2和4結(jié)合，誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞的增殖[14-15]，沉默HMGB1基因可以減少過敏性紫癜患兒血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善血管的通透性[16-18]。HMGB1可能參與了SLE腎血管內(nèi)皮的病理過程[19-20]。為進(jìn)一步探討HMGB1在SLE腎損傷中對HRGEC單層通透性的影響，本研究應(yīng)用HMGB1中和抗體預(yù)處理細(xì)胞，然后再給予SLE腎損傷血漿刺激，結(jié)果顯示，HMGB1中和抗體部分逆轉(zhuǎn)了HRGEC單層的跨膜電阻及熒光通透率，改善了細(xì)胞間VE-cadherin的表達(dá)。

綜上所述，SLE患者血清中HMGB1水平明顯升高，且存在腎損傷者更為明顯，HMGB1中和抗體能夠部分逆轉(zhuǎn)HRGEC單層的通透性，改善細(xì)胞間的緊密連接，HMGB1可能參與了SLE的HRGEC損傷。