楊何寶， 郭世奇， 尹守亮， 楊 明， 耿曉然*

利用強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)纖維二糖酶基因在里氏木霉中進(jìn)行異源表達(dá)

楊何寶1， 郭世奇1， 尹守亮2， 楊 明1， 耿曉然3*

（1. 中溶科技股份有限公司，河北 唐山 063000；2. 華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063000；3. 河北兆惠恒美檢測(cè)技術(shù)有限公司，河北 唐山 063000）

為提高里氏木霉中纖維二糖酶的表達(dá)量，構(gòu)建了含有不同強(qiáng)啟動(dòng)子的纖維二糖酶基因重組質(zhì)粒，以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將表達(dá)元件整合到里氏木霉基因組中，獲得了高效表達(dá)纖維二糖酶基因的里氏木霉優(yōu)勢(shì)菌株。采用反轉(zhuǎn)錄的方法從黑曲霉RNA中克隆得到纖維二糖酶基因（cb）的編碼序列，并以啟動(dòng)子Pcbh1和Pxyn1控制cb基因的表達(dá)，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，成功將表達(dá)元件整合到里氏木霉基因組中。通過(guò)對(duì)不同啟動(dòng)子控制下的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵篩選，纖維二糖酶活性最高比對(duì)照分別提高了376%和323%。通過(guò)水解纖維素實(shí)驗(yàn)，重組菌株表達(dá)的纖維素酶能更好的對(duì)纖維素進(jìn)行水解，水解率比對(duì)照菌株分別高出了29.73%和26.78%。該研究成果對(duì)解決里氏木霉表達(dá)纖維二糖酶低的問(wèn)題具有一定的指導(dǎo)意義。

啟動(dòng)子；纖維二糖酶；里氏木霉；根癌農(nóng)桿菌；異源表達(dá)

纖維二糖酶，又稱(chēng)β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21），是纖維素酶系的成分之一，其作用是將由內(nèi)切葡聚糖酶（EG）和外切葡聚糖酶（CBH）作用產(chǎn)生的纖維二糖和其他寡糖分解成葡萄糖和其他單糖[1]。然而，纖維二糖酶僅占里氏木霉總分泌蛋白的1%[2]。低濃度的纖維二糖酶限制了纖維二糖等其他纖維寡糖向葡萄糖的轉(zhuǎn)化，而纖維二糖和纖維寡糖的積累會(huì)導(dǎo)致對(duì)纖維素酶反應(yīng)的反饋抑制[3-4]。因此，纖維二糖酶在纖維素降解過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，提高纖維素酶體系中纖維二糖酶的表達(dá)是提高纖維素糖化率的關(guān)鍵。

為了提高纖維二糖酶的表達(dá)量，有學(xué)者嘗試對(duì)不同來(lái)源的纖維二糖酶基因在細(xì)菌、酵母和真菌中進(jìn)行了異源表達(dá)[5]。Zhang等將纖維二糖酶基因在里氏木霉中進(jìn)行表達(dá)，纖維二糖酶活力比對(duì)照提高了5.7倍，但仍處于降低的水平不能滿(mǎn)足生產(chǎn)需要[6]。有研究表明，里氏木霉中的纖維二糖酶活性與濾紙酶活性的比值達(dá)到0.05以上才能表現(xiàn)出較好的水解性能[7]。王冰冰等[8]通過(guò)將來(lái)源于黑曲霉的纖維二糖酶基因在里氏木霉中進(jìn)行異源表達(dá)，提高了纖維二糖酶活性與濾紙酶活性的比值，最高達(dá)到了1.22，重組纖維二糖酶活力為5.3 IU/mL，雖然較對(duì)照菌株有很大的提高，但酶活力仍然較低。

因此，增強(qiáng)纖維二糖酶活力是提高纖維素酶水解率和葡萄糖產(chǎn)量的關(guān)鍵措施之一。有研究結(jié)果表明，用黑曲霉分泌的纖維二糖酶酶制劑補(bǔ)充到里氏木霉的纖維素酶制劑中可以顯著提高纖維素水解產(chǎn)率[9-10]。在前期的研究中，本團(tuán)隊(duì)已篩選到一株高產(chǎn)纖維二糖酶的黑曲霉菌株。本文將從此黑曲霉菌株中克隆纖維二糖酶基因，采用基因工程技術(shù)，利用里氏木霉中的cbh1和xyn1基因的啟動(dòng)子對(duì)纖維二糖酶進(jìn)行表達(dá)，并以此構(gòu)建并篩選出高產(chǎn)纖維二糖酶的里氏木霉生產(chǎn)菌株。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（DH5α）和根癌農(nóng)桿菌AGL1購(gòu)自北京聚合美公司，里氏木霉（KQ）和黑曲霉（）為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

pPK2質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

黑曲霉誘導(dǎo)培養(yǎng)基：蛋白胨1 g，纖維二糖0.4 g，MgSO40.05 g，KH2PO40.1 g，定容至100 mL，115℃滅菌30 min。此培養(yǎng)基用來(lái)誘導(dǎo)黑曲霉表達(dá)纖維二糖酶。

里氏木霉種子培養(yǎng)基：葡萄糖 2.5 g，玉米漿粉1.25 g，種液營(yíng)養(yǎng)鹽溶液100 mL，置于500 mL三角瓶，磁力攪拌下充分溶解，用20%氫氧化鈉調(diào)pH 4.8，115℃滅菌30 min。

里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉稀酸水解液3.5%（未過(guò)濾，115℃滅菌20 min，滅菌后合瓶），玉米漿干粉0.8%，酵母粉0.5%，乳清粉2%，微晶纖維素粉1.0%，大豆皮0.8%，玉米皮1.2%，玉米芯粉1%，豆粕0.5%，磷酸0.25%，硫酸鉀0.17%，七水硫酸鎂0.17%，硫酸銨0.4%，氯化鈣0.41%，微量元素0.2%，吐溫-80 0.1%，pH4.3，裝量100 mL/500 mL三角瓶，121℃滅菌30 min，接種量10%，25.0℃，185 r/min培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑和儀器

DNA mix聚合酶，購(gòu)自北京蘭博利德公司；限制性?xún)?nèi)切酶、Gibson組裝試劑、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、去磷酸化試劑購(gòu)自NEB公司；真菌基因組提取試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR&DNA片段純化試劑盒購(gòu)自北京聚合美公司；DNA maker、Protein maker 購(gòu)自康為世紀(jì)公司；Yeast和Tryptone 購(gòu)自O(shè)XOID公司；其他為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；PCR儀購(gòu)伯樂(lè)公司；核酸電泳儀、蛋白電泳儀和凝膠成像儀購(gòu)自北京六一公司。

1.1.4 PCR 引物

本實(shí)驗(yàn)所用PCR引物如表1所示。

表1 引物序列

1.2 方法

常規(guī)分子生物學(xué)操作參照《分子克隆手冊(cè)》。

1.2.1 提取黑曲霉總RNA

將黑曲霉孢子接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h，菌絲體經(jīng)液氮冷凍研磨后，采用RNA提取試劑盒提取黑曲霉總RNA，提取后進(jìn)行核酸電泳，電泳條件為160 V，10 min。

1.2.2 黑曲霉纖維二糖酶基因（cb）的克隆

采用快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA文庫(kù)，然后以cDNA為模版，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，最終獲得纖維二糖酶基因編碼序列cb；再以cb為模版，設(shè)計(jì)用來(lái)構(gòu)建不同啟動(dòng)子和終止子的引物cb-F1&R1和cb-F2&R2進(jìn)行PCR，分別獲得cb1和cb2基因片段。

PCR反應(yīng)體系：DNA mix 10 μL，上、下游引物（10 ng/μL）各0.4 μL，DNA模版（10 ng/μL）0.2 μL，DMSO 0.8 μL，滅菌水8.2 μL，總體積為20 μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變形30 s，50℃退火1 min，72℃延伸10 min，循環(huán)20次，72℃再延伸20 min，4℃保存。

反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收PCR擴(kuò)增的纖維二糖酶基因序列。

1.2.3 啟動(dòng)子Pcbh1和Pxyn1及其對(duì)應(yīng)的終止子Tcbh1和Txyn1的克隆

利用真菌基因組提取試劑盒提取里氏木霉基因組，以里氏木霉基因組為模版，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，然后采用PCR&DNA 片段純化試劑盒回收目的基因。

PCR反應(yīng)體系和條件同“1.2.1”。

1.2.4 pPK2質(zhì)粒線(xiàn)性化

pPK2質(zhì)粒用Hind Ⅲ酶進(jìn)行單酶切及去磷酸化。

單酶切體系：酶5 μL，Buffer 5 μL，DNA 2 μg（依濃度計(jì)算）水補(bǔ)齊至50 μL，37℃，3 h。

去磷酸化體系：去磷酸化酶0.5 μL，Buffer 5 μL，酶切產(chǎn)物30 μL，DDW補(bǔ)齊至50 μL。

1.2.5 重組質(zhì)粒構(gòu)建

重組質(zhì)粒構(gòu)建采用Gibson組裝試劑盒對(duì)片段和載體進(jìn)行組裝。載體為線(xiàn)性化的pPK2質(zhì)粒，片段為纖維二糖酶基因、不同的啟動(dòng)子和終止子。

Gibson連接組裝體系：組裝mix酶5 μL，載體和片段共5 μL，比例為1∶3-5，金屬浴50℃，孵育1 h。

1.2.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α

將10 μL連接產(chǎn)物與100 μL的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30 min，42℃熱激90 s，立即重置于冰上3～5 min，再加入700 μL LB液體培養(yǎng)基，37℃、160r/min培養(yǎng)50～60 min；涂布于LB固體平板（含10 μg/mL卡納霉素），37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.7 菌液PCR鑒定

在超凈臺(tái)中挑取若干單菌落至 LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)6～8 h后，以引物cb-F1、Tcbh1-R和引物cb-F2、Txyn1-R分別作為鑒定引物，進(jìn)行菌液PCR，驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化情況。

1.2.8 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒構(gòu)建的準(zhǔn)確性，選擇合適的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。酶切體系：內(nèi)切酶1 μL，Buffer 2 μL，DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL，37℃金屬浴，酶切1 h。

1.2.9 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌

采用凍融法將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌中[11]。

1.2.10 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌液PCR驗(yàn)證

驗(yàn)證方法同“1.2.7”。

1.2.11 里氏木霉孢子萌發(fā)液的制備

將新鮮培養(yǎng)的里氏木霉用無(wú)菌水將孢子洗下，稀釋到1.0×106個(gè)/mL，28℃培養(yǎng)6 h備用。

1.2.12 根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)

1）將驗(yàn)證正確的含有載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株AGL1在含有50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平的YEB液體培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)速為200 r/min；

2）取1.5 mL過(guò)夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌培養(yǎng)菌液，2 400 g，離心5 min，IM液體洗滌兩次接種到5 mL含有乙酞丁香酮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（200 μM乙酰丁香酮AS）中，28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，直到達(dá)到期望的OD 600 nm下的0.6～0.8。

1.2.13 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化里氏木霉

將100 μL經(jīng)誘導(dǎo)后的農(nóng)桿菌培養(yǎng)菌液與100 μL里氏木霉孢子萌發(fā)液混合，均勻涂布到覆蓋有大小適中經(jīng)滅菌后的玻璃紙的含有200 μM乙酰丁香酮的IM瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2～3天。

1.2.14 里氏木霉轉(zhuǎn)化子篩選及單菌落傳代培養(yǎng)

為了進(jìn)一步篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將含有轉(zhuǎn)化子的玻璃紙倒扣到含有100 μg/mL潮霉素和200 μM頭孢噻肟的PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1天后小心撕掉玻璃紙，再培養(yǎng)1～2天。小心地挑取轉(zhuǎn)化子劃線(xiàn)于抗性PDA平板上，待長(zhǎng)滿(mǎn)板可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.15 里氏木霉轉(zhuǎn)化子發(fā)酵驗(yàn)證及酶活檢測(cè)

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量均為50 mL/250 mL，將重組菌株和對(duì)照菌株的孢子分別接入種子培養(yǎng)基，28℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。按10%的接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min，發(fā)酵48 h。檢測(cè)發(fā)酵液的纖維二糖酶及濾紙酶活力。

1.2.16 發(fā)酵液水解纖維素驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以稀酸預(yù)處理后的玉米秸稈作為水解底物，底物濃度為25%，加酶量為反應(yīng)總體積的0.2%，52℃，300 r/min，反應(yīng)72 h。反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)還原糖、葡萄糖、木糖、纖維二糖的含量。

1.2.17 濾紙酶活和纖維二糖酶的檢測(cè)

根據(jù)中華人民共和國(guó)能源行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NB/T 13005-2016中檢測(cè)濾紙酶活和纖維二糖酶的方法對(duì)上清液的酶活進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.18 糖濃度的檢測(cè)

采用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)水解液中不同糖的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉總RNA提取及纖維二糖酶基因的克隆

利用“1.2.1”中所述方法提取黑曲霉總RNA，得到了具有三條帶（28S、18S、5S）的總RNA，如圖1所示。利用“1.2.2”中所述方法擴(kuò)增纖維二糖酶基因，得到大小約為2.3 kb的DNA片段，如圖2所示。DNA測(cè)序結(jié)果表明：該基因全長(zhǎng)為2 367 bp，通過(guò)在NCBI官網(wǎng)進(jìn)行序列比對(duì)，與黑曲霉CBS513.88的β-葡萄糖苷酶A基因有99.79%的同源性。

圖1 黑曲霉總RNA電泳圖

圖2 纖維二糖酶基因電泳圖

2.2 啟動(dòng)子Pcbh1和Pxyn1及其對(duì)應(yīng)的終止子Tcbh1和Txyn1的克隆

利用“1.2.3”中所述方法獲得兩對(duì)啟動(dòng)子和終止子，如圖3和圖4所示。

M為maker條帶，1為Pcbh1基因條帶，2為T(mén)cbh1基因條帶

M為maker條帶，1為Pxyn1基因條帶，2為T(mén)xyn1基因條帶

2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證

利用Gibson組裝試劑將線(xiàn)性化pPK2質(zhì)粒與片段進(jìn)行連接，得到兩個(gè)重組質(zhì)粒，分別命名為：pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1、pPK2-Pxyn1-cb-Txyn1，質(zhì)粒圖譜如圖5、6所示。

圖5 pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1質(zhì)粒圖譜

圖6 pPK2-Pxyn1-cb-Txyn1質(zhì)粒圖譜

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況如圖7所示。

對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1質(zhì)粒驗(yàn)證的條帶大小為3 005 bp，pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1質(zhì)粒驗(yàn)證的條帶大小為3 367 bp，電泳結(jié)果如圖8所示。

①為轉(zhuǎn)化pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子

M為maker條帶，1-3為pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1質(zhì)粒驗(yàn)證條帶，4為pPK2-Pxyn1-cb-Txyn1質(zhì)粒驗(yàn)證條帶

圖8 菌液PCR驗(yàn)證電泳圖

2.4 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證

選擇EcoRV酶切位點(diǎn)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，進(jìn)一步確定質(zhì)粒構(gòu)建的準(zhǔn)確性，結(jié)果如圖9所示，可見(jiàn)質(zhì)粒被準(zhǔn)確的切成兩條帶，經(jīng)比對(duì)，條帶位置正確。

M為maker條帶，1-3為pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1質(zhì)粒酶切電泳條帶，4為pPK2-Pxyn1-cb-Txyn1質(zhì)粒酶切電泳條帶

2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGL1及驗(yàn)證

利用“1.2.10”中所述方法將構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌AGL1中，轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況如圖10所示?？梢?jiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化情況較好，轉(zhuǎn)化子數(shù)量正常。

對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖11所示。通過(guò)比對(duì)，條帶位置和大小符合預(yù)期。

①為轉(zhuǎn)化pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子

M為maker條帶，1-5為pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1質(zhì)粒菌液PCR條帶，6-10為pPK2-Pxyn1-cb-Txyn1質(zhì)粒菌液PCR條帶

圖11 菌液PCR電泳圖

2.6 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化里氏木霉

將制備好的里氏木霉孢子液與培養(yǎng)好的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，獲得里氏木霉轉(zhuǎn)化子，結(jié)果如圖12所示，圖中白色斑點(diǎn)為里氏木霉轉(zhuǎn)化子。

①為轉(zhuǎn)化pPK2-Pcbh1-cb-Tcbh1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，②為轉(zhuǎn)化pPK2-Pxyn1-cb-Txyn1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子

2.7 里氏木霉轉(zhuǎn)化子發(fā)酵驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)獲得的大量轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，篩選出以下高產(chǎn)菌株。結(jié)果如表2和表3所示。

表2 利用Pcbh1啟動(dòng)子表達(dá)cb基因轉(zhuǎn)化子發(fā)酵情況

表3 利用Pxyn1啟動(dòng)子表達(dá)cb基因轉(zhuǎn)化子發(fā)酵情況

由上述結(jié)果可知，重組菌株1-3和2-2均表現(xiàn)出較高的濾紙酶活和纖維二糖酶活性。纖維二糖酶活性分別為12.634 U/mL和11.226 U/mL，比對(duì)照菌株分別提高了376%和323%。

2.8 纖維素水解驗(yàn)證

以稀酸預(yù)處理后的秸稈纖維素作為底物，分別用1-3、2-2和對(duì)照菌株的發(fā)酵液上清進(jìn)行水解反應(yīng)，結(jié)果如表4所示。由結(jié)果可知，兩株重組菌株所產(chǎn)酶均表現(xiàn)出較好的水解性能，提高了糖濃度和水解率，水解率分別為85.51%和82.56%，比對(duì)照菌株高出了29.73%和26.78%。

表4 不同發(fā)酵液水解纖維素結(jié)果

2.9 本研究結(jié)果與其他相似研究對(duì)比

里氏木霉作為纖維素酶制劑的主要生產(chǎn)菌種，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。但商業(yè)化的纖維素酶制劑中，雖然內(nèi)切型及外切型葡聚糖酶的活力較高，但纖維二糖酶活力很低。這就導(dǎo)致了實(shí)際應(yīng)用中纖維二糖的積累而產(chǎn)生反饋抑制，影響水解效率。所以，提高里氏木霉產(chǎn)纖維二糖酶的能力，對(duì)于改善纖維素酶復(fù)合水解性能、提高纖維素酶的催化效率，從而提高纖維素原料的糖轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)纖維素酶在生物質(zhì)能研發(fā)方面的實(shí)際應(yīng)用，具有重要的意義。

本文所用的強(qiáng)啟動(dòng)子Pcbh1和Pxyn1，已被廣泛應(yīng)用于里氏木霉同源或異源的蛋白表達(dá)[17-18]。由表2和表3結(jié)果顯示，篩選出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌株的纖維二糖酶活性最高可達(dá)到12.634 U/mL和11.226 U/mL，比對(duì)照菌株分別提高了376%和323%。雖然，相比于商品化的纖維二糖酶產(chǎn)品，本研究中的纖維二糖酶活性仍偏低，但相比于商業(yè)化的酶制劑，其具有更多的實(shí)用性和可操作性，具體表現(xiàn)在：產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)離心或者板框過(guò)濾去除菌體后，發(fā)酵上清就可直接用于纖維素水解反應(yīng)，無(wú)需進(jìn)行濃縮等其他復(fù)雜處理，并能達(dá)到較高的水解效率。由表5對(duì)比可知，本研究中所采取的改造策略對(duì)里氏木霉的纖維二糖酶活性和濾紙酶活性均有很大的提高；如上文所述，酶活性雖不及有些研究結(jié)果，但此工程菌株實(shí)用性強(qiáng)，發(fā)酵液上清可直接用于水解實(shí)驗(yàn)，并可達(dá)到較高的水解效率。

表5 不同文獻(xiàn)結(jié)果對(duì)比

有研究表明[9]，在纖維素原料水解過(guò)程中，當(dāng)纖維二糖酶活性與濾紙酶活性的比值達(dá)到0.3以上時(shí)，纖維素二糖將有效地轉(zhuǎn)化為葡萄糖。由表2和表3結(jié)果顯示，篩選出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌株的濾紙酶活最高可達(dá)21.94 U/mL和20.56 U/mL，分別比對(duì)照菌株提高了26%和18%。重組里氏木霉菌株的纖維二糖酶活性與濾紙酶活性的比值最高可達(dá)0.58和0.55，均高于宿主菌株（0.15）。這說(shuō)明，重組菌株的纖維素酶系中存在更多的纖維二糖酶，改善了纖維素酶復(fù)合體系。

由表4可知，對(duì)照菌株的水解液中葡萄糖和木糖的濃度均較低，水解產(chǎn)率僅為55.78%。而纖維二糖和其他糖的濃度相對(duì)較高，說(shuō)明在反應(yīng)體系中纖維二糖酶活性偏低，從而導(dǎo)致纖維二糖和其他寡糖的積累。而對(duì)于重組里氏木霉菌株，纖維二糖被迅速水解，消除了纖維二糖積累引起的反饋抑制。因此，水解物中葡萄糖的濃度均明顯增加，水解率提高到85.51%和82.56%，比對(duì)照菌株高出了29.73%和26.78%。這些結(jié)果表明，重組里氏木霉菌株產(chǎn)生了更有效更協(xié)調(diào)的酶復(fù)合體系來(lái)水解纖維素底物。

3 結(jié)論

本研究中，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄手段從黑曲霉基因組中成功克隆到纖維二糖酶基因（cb）的編碼序列，通過(guò)ncbi官網(wǎng)比對(duì)，該序列與黑曲霉CBS513.88的β-葡萄糖苷酶A基因有99.79%的同源性。將cb基因編碼序列分別與里氏木霉的兩對(duì)啟動(dòng)子Pcbh1、終止子Tcbh1和啟動(dòng)子Pxyn1、終止子Txyn1重組構(gòu)成兩個(gè)不同的表達(dá)元件，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將兩個(gè)表達(dá)元件分別整合到里氏木霉基因組上，并使其進(jìn)行高效表達(dá)。發(fā)酵試驗(yàn)表明，纖維二糖酶基因在Pcbh1和Pxyn1兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子的作用下均可高效表達(dá)。發(fā)酵48 h，不同啟動(dòng)子重組菌株的纖維二糖酶活力可以高達(dá)12.634 U/mL和11.226 U/mL，是原始菌株的4.76和4.23倍。該項(xiàng)研究成果改善了里氏木霉的纖維素酶系，使可再生資源的酶法糖化得到長(zhǎng)足的進(jìn)展，從而將推動(dòng)纖維素乙醇的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

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Heterologous Expression ofGene inusing Strong Promoters

YANG He-bao1, GUO Shi-qi1, YIN Shou-liang2, YANG Ming1, GENG Xiao-ran3*

（1. Zhongrong Technology Co., Ltd, Tangshan 063000, China; 2. College of Life Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China;3. Hebei Zhaohuihengmei Testing Technology Co., Ltd, Tangshan 063000, China）

In order to increase the expression of cellobiase in, the target gene expression elements containing different promoters were integrated into the genome ofbymediated method, and dominant strains ofwith high expression ofgene were obtained. The coding sequence of the cellobiase gene (cb) was cloned fromRNA by reverse transcription method, and the cb gene expression was controlled by the promoters Pcbh1 and Pxyn1. The expression elements were successfully integrated into the genome ofthroughmediated transformation. By screening the positive transformants controlled by different promoters, theactivity was increased by 376% and 323% respectively compared with the control. Through the cellulose hydrolysis experiment, the cellulase expressed by the recombinant strain can better hydrolyze cellulose, and the hydrolysis rate is 29.73% and 26.78% higher than that of the control strain respectively. The research results have certain guiding significance for solving the problem of low expression ofby.

promoter;;;; heterologous expression

Q815

A

1004-8405(2022)04-0039-11

10.16561/j.cnki.xws.2022.04.07

2022-12-07

楊何寶（1987～），男，河北遷安人，碩士，助理研究員；研究方向：微生物。

通訊作者：耿曉然（1989～），女，河北遷安人，碩士，助理研究員；研究方向：微生物。122996365@qq.com