高 倩， 潘飛兵

檳榔堿提取及檢測(cè)方法研究現(xiàn)狀及展望

高 倩， 潘飛兵

（海南華創(chuàng)檳榔研究院，海南 ?？?570208）

綜述了檳榔堿的提取技術(shù)，對(duì)溶劑提取法、熱回流提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、亞臨界水提取法、超臨界CO2萃取法進(jìn)行了介紹。并對(duì)檳榔堿的檢測(cè)方法進(jìn)行歸納總結(jié)，重點(diǎn)舉例闡述了高效液相色譜法、超高效液相色譜―質(zhì)譜聯(lián)用法、微芯片毛細(xì)管電泳―無接觸電導(dǎo)檢測(cè)法、氣相色譜―質(zhì)譜聯(lián)用法。鑒于傳統(tǒng)溶劑提取法、液相色譜檢測(cè)法使用有機(jī)試劑量較大，為了遵循環(huán)保理念，亞臨界水提取法作為一種環(huán)保技術(shù)可以有效解決有機(jī)試劑污染問題，氣相色譜―質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在檳榔堿含量檢測(cè)方面的應(yīng)用，可以減少有機(jī)試劑引入，簡化前處理過程。基于對(duì)檳榔堿提取及檢測(cè)方法研究的綜合分析，對(duì)未來檳榔中檳榔堿含量的研究提出了建議和思路。

檳榔；檳榔堿；提??；檢測(cè)方法；環(huán)保技術(shù)；氣相色譜―質(zhì)譜聯(lián)用法

檳榔（）是棕櫚科多年生常綠喬木，檳榔堿（）是從植物檳榔中提取的一種生物堿，對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)[1]、內(nèi)分泌系統(tǒng)[2]等有著廣泛的影響，高效提取和定量分析檳榔堿含量對(duì)開發(fā)其藥用價(jià)值具有重要意義。綜合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，主要應(yīng)用于檳榔堿的提取技術(shù)有溶劑提取法[3-5]、熱回流提取法[6]、超聲波輔助提取法[7]、超臨界CO2萃取法[8-9]等。溶劑提取法通常搭配微波輔助提取、超聲波輔助提取法使用，試劑污染嚴(yán)重，危害人體健康，而超臨界CO2萃取法設(shè)備造價(jià)成本較高。常用的檳榔堿的檢測(cè)方法有分光光度法[10-11]、滴定法[12]、高效液相色譜法[13-14]、超高效液相色譜―串聯(lián)質(zhì)譜法[15]等。

近幾年，隨著環(huán)保技術(shù)的快速發(fā)展，檳榔堿的提取和檢測(cè)技術(shù)也在日益更新，本文在現(xiàn)有綜述文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充說明了亞臨界水提取檳榔堿新技術(shù)，以及氣相色譜―質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)檳榔堿含量的定量檢測(cè)新方法，為檳榔堿的高效、環(huán)保提取和檢測(cè)提供新思路。

1 檳榔堿的特性

檳榔中至少含有6種生物堿，檳榔堿屬于其中一大類，因其在檳榔中含量占比較高，故命名為檳榔堿[16]。檳榔中除含量較高的檳榔堿外，還包含檳榔次堿、去甲基檳榔堿、去甲基檳榔次堿等，共占到檳榔總生物堿的90%以上[17]。據(jù)國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，檳榔堿具有一定的藥用價(jià)值，檳榔中的生物堿對(duì)于治療精神分裂癥和抑郁癥具有良好效果[18]，在大鼠實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，含檳榔堿類的藥物對(duì)于抗血管粥樣硬化具有顯著改善作用[19-20]。檳榔堿對(duì)大鼠的降血糖及調(diào)節(jié)血脂實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低濃度的檳榔堿可使2型糖尿病大鼠得到緩解[21-22]。同時(shí)檳榔堿可能具有一定的毒副作用，研究者在體外用不同濃度的3種生物堿評(píng)估精子活力的影響，發(fā)現(xiàn)檳榔堿對(duì)檳榔消費(fèi)者的性腺功能有不良影響[23]。

2 檳榔堿的提取方法

2.1 溶劑提取法

溶劑提取法是檳榔堿提取方法中應(yīng)用最廣泛的方法，由于檳榔堿溶于水、脂溶性溶劑和乙醇中，故常用的溶劑主要有水、乙醇、乙醚、氯仿[3]。在溶劑提取法提取檳榔堿時(shí)，考察了不同溶劑的提取情況，結(jié)果乙醚提取率較低，水和乙醇提取的雜質(zhì)較多，色譜峰分離度不好，可加入氨水、碳酸鹽緩沖液等堿化試劑提高提取效率[4]。除了不同溶劑對(duì)檳榔堿提取率有較大影響，堿化時(shí)pH值的大小、提取溫度、提取次數(shù)等因素都直接影響檳榔堿提取率。陳娟等以檳榔核為原料，采用酸水提取法提取檳榔堿，發(fā)現(xiàn)檳榔粉碎粒度、提取時(shí)間及溫度、料液比、鹽酸濃度對(duì)檳榔堿提取量的影響都極為顯著（P＜0.01），影響大小依次為：鹽酸質(zhì)量濃度＞提取時(shí)間＞提取溫度，采用條件優(yōu)化后的酸水提取法提取檳榔堿與傳統(tǒng)乙醇提取法相比，提取率提高約6.43 mg/g[5]。溶劑提取法是檳榔堿提取的主流方法，通常需與超聲波輔助提取、熱回流輔助提取等方式結(jié)合使用。

2.2 超聲波輔助提取法

超聲波提取法是采用超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取，一般作為輔助浸提方法與溶劑提取法結(jié)合使用，有助于提高檳榔堿的提取率。超聲波輔助提取法從檳榔中提取檳榔堿，檳榔堿的得率受浸提液乙醇、料液比、提取溫度、純化過程中pH值等因素影響，通過正交試驗(yàn)得出，在超聲波頻率40 kHZ，超聲功率300 W條件下，檳榔堿提取最佳工藝為：濃度85%乙醇，料液比1∶8，堿化pH值為8，提取溫度65℃，檳榔得率最高為（0.1987±0.05）%[7]。超聲波提取率比傳統(tǒng)工藝提取率顯著提高，適用范圍廣，提取工藝運(yùn)行成本低，操作簡單。

2.3 亞臨界水提取法

亞臨界水萃取技術(shù)是近年來新型技術(shù)，應(yīng)用于檳榔堿提取研究較少，由于亞臨界水的極性變化，實(shí)現(xiàn)了天然產(chǎn)物中活性成分的連續(xù)提取和選擇性提取[24-25]。亞臨界水提取檳榔堿的實(shí)驗(yàn)裝置主要由高溫反應(yīng)釜、加熱系統(tǒng)、控溫系統(tǒng)組成，將2.0 g檳榔粉末放入反應(yīng)釜中，并加入60 mL蒸餾水，提取溫度設(shè)為144℃，料液比35∶1，提取時(shí)間43 min，此條件下檳榔堿的提取率可達(dá)4.25 mg/g。由于亞臨界水是一種廉價(jià)、無污染的萃取劑，所以，亞臨界水提取技術(shù)被認(rèn)為是一種綠色、環(huán)保的加工技術(shù)[26]。

2.4 超臨界CO2萃取法

超臨界CO2萃取法主要是利用超臨界流體，在特定溫度和壓力下將待分離物質(zhì)選擇性的萃取出來，影響檳榔堿提取率的主要因素包括CO2流量、溫度和壓力、夾帶劑用量。韓志萍等在研究中確定了超臨界CO2萃取法最佳工藝參數(shù)為：壓力20 MPa、溫度50℃、時(shí)間120 min、CO2流量25 kg/h、無水乙醇夾帶劑用量為175 mL時(shí)萃取效果最好[8]。隨后幾年，吳清波等通過微波預(yù)處理技術(shù)結(jié)合超臨界CO2萃取法提取檳榔堿，微波預(yù)處理可以明顯提高檳榔堿得率，微波輻射功率升高，檳榔堿得率明顯提高。通過響應(yīng)面分析得出最佳工藝條件為萃取壓力33 MPa、萃取溫度63℃、微波功率480 W，在此條件下檳榔堿得率為（0.448±0.007）%[9]。

多種檳榔堿提取技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)比較如表1所示。

表1 檳榔堿提取技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)比較

3 檳榔堿的檢測(cè)方法

3.1 高效液相色譜法

液相色譜法是近代發(fā)展起來的新型高效分析技術(shù)，其分析對(duì)象包括高沸點(diǎn)、熱敏性高、分子量較大、極性差異較大的化合物及生物大分子物質(zhì)，其分析靈敏度高，準(zhǔn)確性好。生物堿能溶解在有機(jī)溶劑中，可直接經(jīng)液相色譜進(jìn)行分離檢測(cè)，此方法精密度、穩(wěn)定性均較好，是測(cè)定檳榔堿最為成熟的方法之一。高效液相色譜法中色譜柱通常采用SCX強(qiáng)陽離子交換柱進(jìn)行分離，流動(dòng)相的使用有些許差異，以乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫居多，濃氨試液調(diào)節(jié)pH至3.8，柱溫為30℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長為215 nm進(jìn)行測(cè)定，檳榔堿在215 nm處有紫外最大吸收值[27-31]。屈文佳等人將流動(dòng)相改為甲醇-0.02%磷酸鹽溶液（72∶28），等度洗脫，可以很好地將檳榔堿、檳榔次堿、去甲基檳榔堿、去甲基檳榔次堿分離，同時(shí)測(cè)定4種生物堿含量，加標(biāo)回收率分別達(dá)到99%～101%[32]。個(gè)別研究人員采用C18色譜柱，乙二胺、甲醇和乙腈作為流動(dòng)相，柱溫為30℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長215 nm，結(jié)果重現(xiàn)性較好，也適用于檳榔提取物中檳榔堿含量的測(cè)定[33-34]。

3.2 超高效液相色譜―串聯(lián)質(zhì)譜法

近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)在活性成分鑒定方面應(yīng)用廣泛。郭曉杰等采用超高效液相色譜―串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）建立檳榔籽中四種生物堿含量的檢測(cè)方法，并優(yōu)化了色譜條件和質(zhì)譜條件，采用Waters Atlantis T3色譜柱，選用0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液作為流動(dòng)相，流速0.5 mL/min，柱溫40℃，質(zhì)譜儀采用電噴霧離子源，MRM模式掃描，四種生物堿均呈現(xiàn)出良好線性，且加標(biāo)回收率均在70%～120%[15]。相比于高效液相色譜法檢測(cè)檳榔堿含量，UPLC-MS/MS法靈敏度更高，檢測(cè)時(shí)間更短，但設(shè)備成本費(fèi)較高。

3.3 微芯片毛細(xì)管電泳-無接觸電導(dǎo)檢測(cè)法

微芯片毛細(xì)管電泳是近年來迅速發(fā)展起來的一種現(xiàn)代分析技術(shù)[35]。它具有集成度高、分辨率高、分析速度快、試劑消耗低、運(yùn)行成本低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物學(xué)、藥物分析[36]、食品安全[37]等領(lǐng)域。Cai ZY等人開發(fā)了由高壓供體、非接觸式電導(dǎo)率檢測(cè)和薄芯片組成的自制微芯片毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，建立了一種毛細(xì)管電泳-無接觸電導(dǎo)率檢測(cè)（MCE-CCD）測(cè)定檳榔子飲片中檳榔堿含量的新方法，研究了不同電泳操作參數(shù)對(duì)檳榔堿分析的影響。在最佳條件下，檳榔堿可在1 min內(nèi)快速分離和檢測(cè)，在20～1 500 μM范圍內(nèi)線性良好（2＝0.999 1），檢出限為5 μM，本法測(cè)定檳榔堿的回收率為96.8%～104%[38]。楊秀娟等人在高電場(chǎng)強(qiáng)度下，利用芯片上微通道實(shí)現(xiàn)待測(cè)組分的分離，以非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，研究電泳介質(zhì)、進(jìn)樣時(shí)間和分離電壓等因素對(duì)分離檢測(cè)的影響，并對(duì)影響實(shí)驗(yàn)方法因素進(jìn)行優(yōu)化：緩沖溶液為2 mmol/L醋酸＋2 mmol/L醋酸鈉（pH＝4.7），進(jìn)樣時(shí)間10 s，分離電壓2.5 kV。建立了微流控芯片非接觸電導(dǎo)法檢測(cè)檳榔堿含量的分析方法[39]。使用微流控芯片非接觸電導(dǎo)法檢測(cè)檳榔堿含量的應(yīng)用較為新穎，在檳榔堿的傳統(tǒng)檢測(cè)方法之外提供了一種新型檢測(cè)方法。

3.4 氣相色譜―質(zhì)譜聯(lián)用法

與液相色譜檢測(cè)檳榔堿的方法相比，氣相色譜―質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）檢測(cè)檳榔堿的前處理更簡單，根據(jù)檳榔堿易揮發(fā)的特性，可以避免使用大量溶劑提取檳榔堿，減少因引進(jìn)新雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)的準(zhǔn)確度，簡化了檢測(cè)過程。張鳳梅等采用外標(biāo)定量法，稱取0.5～1.5 g剪碎后的檳榔，加入10～15 mL無水乙醇超聲萃取，取上清液放入氣相色譜―質(zhì)譜聯(lián)用儀中進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱采用HP-5MS，進(jìn)樣口溫度為180～210℃，恒流模式。質(zhì)譜條件離子源溫度190～230℃，四級(jí)桿溫度為170～180℃，選擇離子監(jiān)測(cè)模式，檳榔堿定量離子140，定性離子為96或155，測(cè)得結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.05%～4.73%之間[40]。袁源等采用內(nèi)標(biāo)定量法，稱取粉碎處理后的檳榔放入進(jìn)樣瓶，將萃取頭老化，將進(jìn)樣瓶放入已經(jīng)達(dá)到萃取溫度的動(dòng)態(tài)加熱爐中進(jìn)行平衡，將老化后的萃取頭插入進(jìn)樣瓶中，并在萃取溫度下進(jìn)行萃取，將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口進(jìn)行解吸，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，進(jìn)行內(nèi)標(biāo)校正因子f的計(jì)算以及內(nèi)標(biāo)法含量的計(jì)算，無需溶劑進(jìn)行前處理，操作簡便[41]。

多種檳榔堿檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)比較如表2所示。

表2 檳榔堿檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

4 結(jié)論與展望

檳榔堿的提取方法有很多，實(shí)際應(yīng)用于檳榔堿提取的方法主要為溶劑提取法，但此方法處理過程較復(fù)雜，耗時(shí)長，毒性較大等問題，目前一些科研工作者將溶劑提取法與超聲波、微波輔助提取等技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，以提高檳榔提取率。近年來隨著新型技術(shù)的進(jìn)步，亞臨界水提取法等綠色、環(huán)保的提取技術(shù)在不斷發(fā)展，應(yīng)用于檳榔堿的提取中，可以解決有機(jī)試劑使用問題。

目前主要應(yīng)用于檳榔堿的檢測(cè)方法較為成熟的是高效液相色譜法。隨著高效液相色譜法不斷的發(fā)展，利用液相色譜儀器能將復(fù)雜混合物進(jìn)行分離的原理，出現(xiàn)了很多的聯(lián)用技術(shù)，用來定量與確定物質(zhì)結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜技術(shù)使得分析未知化合物的分子量成為可能，采用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以將結(jié)構(gòu)相似的不同物質(zhì)區(qū)分開來，因此該技術(shù)在檳榔堿分離檢測(cè)中應(yīng)用也較為廣泛。但無論是液相色譜或液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，都會(huì)引入大量有機(jī)試劑，危害實(shí)驗(yàn)人員健康，而氣相色譜―質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在檳榔堿含量檢測(cè)方面的應(yīng)用，直接消除了這一危害因素，不但簡化了前處理過程，還減少了有毒有機(jī)試劑的引入，且可以通過定性、定量離子對(duì)檳榔堿進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，但此方法目前應(yīng)用度不高，后續(xù)應(yīng)優(yōu)化氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的研發(fā)進(jìn)度，較多的應(yīng)用于檳榔堿的檢測(cè)方面。

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Progress of Extraction and Detection Methods of Arecoline

GAO Qian, PANFei-bing

（Hua Chuang Institute Of Areca Research-Hai Nan, Haikou 570208, China）

The progress of extraction technology of arecine was reviewed, and the extraction methods of solvent extraction, heat reflux extraction, ultrasonic extraction, microwave-assisted extraction, subcritical water extraction and supercritical CO2extraction were introduced. The detection methods of arecoline were summarized, and the methods of HPLC, UPLC-MS/MS, microchip capillary electrophoresis-contactless conductance detection and GC-MS were mainly illustrated. In view of the large amount of organic samples used by traditional solvent extraction methods and liquid chromatography detection methods, in order to comply with the concept of environmental protection, subcritical water extraction method, as an environmental protection technology, can effectively solve the problem of organic reagent pollution. The application of GC-MS in the detection of arecoline content can reduce the introduction of organic reagents and simplify the pre-treatment process. Based on the comprehensive analysis of the extraction and detection methods of arecoline, suggestions and ideas for the future study of arecoline content in arecoline were put forward.

Areca nut; arecoline; extract; detection method; environmental protection technology; GC-MS

O6-1

A

1004-8405(2022)04-0068-06

10.16561/j.cnki.xws.2022.04.09

2022-12-09

高倩（1990～），女，漢，遼寧營口人，碩士，工程師；研究方向：化學(xué)分析。