張婷婷

江蘇省連云港市中醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇連云港 222004

對(duì)于生物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，核苷類(lèi)成分是其維持生命的一種重要物質(zhì)，可發(fā)揮出免疫調(diào)節(jié)作用，具有多種藥理、生理活性，如對(duì)中樞神經(jīng)產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用、對(duì)腦細(xì)胞代謝產(chǎn)生改善作用等。目前，核苷制做為多種藥品、食品添加劑及保健品等，于市場(chǎng)上進(jìn)行銷(xiāo)售。同時(shí)，在多種補(bǔ)益中藥中，如冬蟲(chóng)夏草、靈芝等，核苷類(lèi)物質(zhì)是一項(xiàng)重要的質(zhì)量控制指標(biāo)[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在多種補(bǔ)益中藥中，核苷類(lèi)成分可能是藥物共有的物質(zhì)基礎(chǔ)，但相關(guān)研究較少[2]。故本次應(yīng)用高效液相色譜（high performance liquid chro?matography, HPLC）法對(duì)熟地黃、當(dāng)歸、人參、麥冬、黃芪及肉蓯蓉這6種補(bǔ)益中藥中腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥(niǎo)苷含量進(jìn)行測(cè)定，以明確各成分在藥物中的實(shí)際含量，進(jìn)而探究補(bǔ)益中藥中核苷類(lèi)成分的重要作用。本研究于2021年1月采用HPLC法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)益中藥中各成分含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜儀選用Aglent 1100型設(shè)備，包括化學(xué)工作站、自動(dòng)進(jìn)樣器、四元泵等；超純水制備系統(tǒng)選用Millipore Milli-Q Plus型；平行反應(yīng)器。

麥冬（生產(chǎn)批號(hào) 121013-200908）、黃芪（生產(chǎn)批號(hào) 0011024）、熟地黃（生產(chǎn)批號(hào) 121196-201406）及肉蓯蓉（生產(chǎn)批號(hào) 121276-201102）均于藥店購(gòu)買(mǎi)，當(dāng)歸（生產(chǎn)批號(hào) 120927-201516）于甘肅岷縣購(gòu)買(mǎi)，人參（生產(chǎn)批號(hào) 121586-201202）于吉林撫松縣購(gòu)買(mǎi)，藥材經(jīng)專(zhuān)業(yè)人士鑒定，分別為地黃、膜莢黃芪、麥冬、當(dāng)歸、人參、管花肉蓯蓉的藥用部位。水選取Milli-Q水；由Sigma公司提供對(duì)照品，包括腺苷（生產(chǎn)批號(hào) 110879-201703）、腺嘌呤（生產(chǎn)批號(hào)110886-201102）、鳥(niǎo)苷（生產(chǎn)批號(hào) 111977-201501）及尿苷（生產(chǎn)批號(hào) 110887-200202），各對(duì)照品純度均>98%。由Merck公司提供乙腈（生產(chǎn)批號(hào)130103-201902），且為色譜純；由廣東省光華化學(xué)有限公司提供甲酸（生產(chǎn)批號(hào) 101414-201902），且為分析純。

1.2 方法

1.2.1 制備對(duì)照品儲(chǔ)備液 稱(chēng)取適量對(duì)照品包括腺苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷及尿苷，注意精準(zhǔn)稱(chēng)量，并將其分別放置于量瓶（容量為5 mL）中，將適量水加入溶解對(duì)照品，溶解后繼續(xù)加水稀釋濃度，直至達(dá)到刻度，充分搖勻后制備對(duì)照品儲(chǔ)備液，其中腺嘌呤（58.29 μg/mL）、鳥(niǎo)苷（90.73 μg/mL）、尿 苷（77.32 μg/mL）及 腺 苷（157.07 μg/mL）。

1.2.2 制備供試品溶液 精密稱(chēng)定5 g干燥藥材粉末（60目篩），準(zhǔn)確加入15 ml水后稱(chēng)重，設(shè)置平行反應(yīng)器為100℃，提取時(shí)間為90 min，對(duì)于失重用水補(bǔ)足，提取液離心處理（轉(zhuǎn)速為13 000 r/min，離心時(shí)間為5 min）后將上清液取出，濾過(guò)處理所選用濾膜為0.45 μm微孔濾膜，供試品溶液則稱(chēng)取適量續(xù)濾液。

1.3 色譜條件

分析柱設(shè)置為 250 mm×4.6 mm，5 μm；控制流速為0.5 mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為260 nm；進(jìn)樣量設(shè)置為15 μL；流動(dòng)相為0.05%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0~12 min，0%B；12~17 min，0%B~2%B；17~27 min，2%B；27~45 min，2%B~20%B）。于以上色譜條件下對(duì)腺苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷及尿苷進(jìn)行分離，均達(dá)到基線(xiàn)分離，在本研究分析中樣品中各個(gè)成分除麥冬外，均未對(duì)結(jié)果產(chǎn)生明顯影響，而麥冬成分可對(duì)腺嘌呤分析產(chǎn)生一定影響。

2 結(jié)果

2.1 考察線(xiàn)性關(guān)系

分別對(duì)對(duì)照品儲(chǔ)備液（腺苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷及尿苷）進(jìn)行準(zhǔn)確量取，加適量水進(jìn)行稀釋?zhuān)敝脸蔀?個(gè)濃度的混合溶液，過(guò)濾處理選取0.5 μm微孔濾膜，最后行HPLC分析。線(xiàn)性回歸取各對(duì)照品峰面積為Y，濃度（μg/mL）為X。各成分的線(xiàn)性關(guān)系見(jiàn)表1。

表1 腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥(niǎo)苷測(cè)定結(jié)果分析

2.2 考察精密度

于同一天內(nèi)選取同一份對(duì)照品混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣（次數(shù)為6次），計(jì)算出各峰面積，并考察日內(nèi)精密度。進(jìn)樣次數(shù)為2次/d，連續(xù)測(cè)定時(shí)間為3 d，計(jì)算出各峰面積，并對(duì)日間精密度進(jìn)行考察。分析結(jié)果顯示，腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥(niǎo)苷的日間精密度RSD（n=6）分別為0.2%、0.5%、1.0%及0.7%；日內(nèi)精密度RSD（n=6）分別為0.1%、0.1%、0.1%、0%。

2.3 考察重復(fù)性

對(duì)同一當(dāng)歸樣品粉末進(jìn)行精密稱(chēng)取，各稱(chēng)取0.25 g、0.5 g及0.75 g作為3份樣品，以供試品溶液制備方法為依據(jù)進(jìn)行制備，對(duì)峰面積進(jìn)行測(cè)定、計(jì)算，結(jié)果顯示，于低、中及高濃度下，腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥(niǎo)苷含量的平均值（n=3）分別為87 μg/g、151 μg/g、270 μg/g及 187 μg/g；RSD 分 別<2.7%、1.4%、2.1%及4.5%。

2.4 考察加樣回收率

對(duì)已知含量的當(dāng)歸粉末進(jìn)行精密稱(chēng)取，共稱(chēng)取3份樣品，每份劑量約為0.25 g，以原藥材中各成分的含有量作為依據(jù)，分別稱(chēng)取等量的對(duì)照品并加入，按供試品溶液制備方法為依據(jù)進(jìn)行制備，測(cè)定加樣回收率，結(jié)果顯示，腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥(niǎo)苷的平均加樣回收率（n=3）分別為103.4%、98.3%、97.2%及97.9%；RSD分別為1.7%、0.6%、1.8%及0.8%。

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

各樣品粉末均精密稱(chēng)取劑量為0.5 g，制備后將各樣品均平行制備2份，以外標(biāo)法測(cè)定腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥(niǎo)苷含量，見(jiàn)表2。

表2 不同補(bǔ)益中藥中腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥(niǎo)苷含量分析

3 討論

隨著臨床醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展，中藥逐漸受到重視，并被廣泛應(yīng)用于多種疾病治療中，可取得良好效果。為實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化，核心就在于質(zhì)量控制，其中含量測(cè)定為關(guān)鍵部分，不僅可用于考察藥物內(nèi)在質(zhì)量，還能考察藥品穩(wěn)定性，以確保中藥制劑的質(zhì)量，進(jìn)而決定中藥功效[3-5]。中藥多數(shù)是來(lái)自于植物、礦物及動(dòng)物的非人工制品，且以植物來(lái)源最為常見(jiàn)，其化學(xué)成分較為復(fù)雜，目前多采用色譜法、光譜法測(cè)定含量，以HPLC法最為常用[6-8]。HPLC法具有高壓、高速、高效、消耗樣品少、高靈敏度及易回收等優(yōu)勢(shì)，可對(duì)藥物各成分含量進(jìn)行精準(zhǔn)測(cè)定[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在多種補(bǔ)益中藥中，核苷類(lèi)物質(zhì)均發(fā)揮著重要作用[10]。本研究采用HPLC法對(duì)不同補(bǔ)益中藥中腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥(niǎo)苷含量進(jìn)行測(cè)定，可取得精準(zhǔn)結(jié)果，結(jié)果顯示在0.30~77.32 μg/mL、0.35~90.73 μg/mL、0.23~58.29 μg/mL 及0.61~157.07 μg/mL范圍內(nèi)，腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥(niǎo)苷的線(xiàn)性關(guān)系均良好；加樣回收率分別為103.4%（RSD=1.7%）、98.3%（RSD=0.6%）、97.2%（RSD=1.8%）及97.9%（RSD=0.8%）；當(dāng)歸、人參、熟地黃、肉蓯蓉、黃芪及麥冬中均含有核苷類(lèi)成分，其中黃芪、人參及當(dāng)歸中均含有腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥(niǎo)苷成分，且具有較高含量。張文萌等[11]采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定熟地黃中尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷及腺嘌呤等成分含量，結(jié)果顯示，次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷和腺苷濃度分別在1.0~16.0 μg/mL(r=0.9999)、5.0~80.0 μ g/mL(r=0.9999)、1.0~16.0 μ g/mL(r=0.9997)、1.25~20.0 μg/mL(r=0.9999)、1.0~16.0 μg/(r=0.9999)范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。加樣回收率為98.1%～101.0%，與本研究結(jié)果一致。分析HPLC法測(cè)定補(bǔ)益中藥含量的優(yōu)勢(shì)如下。①優(yōu)化提取方法：用水煎煮是以往中藥最為常見(jiàn)的使用方法，本次研究中的提取方法也選用了水加熱法。在此基礎(chǔ)上，首先對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行考察，分別對(duì)當(dāng)歸樣品中提取30 min、60 min、90 min及120 min后，計(jì)算出各個(gè)待測(cè)成分的峰面積，并將其進(jìn)行比較可知，在90 min后各個(gè)待測(cè)成分的峰面積均未呈顯著增加趨勢(shì)，由此本實(shí)驗(yàn)選取90 min作為提取時(shí)間。對(duì)于溶劑使用量地選取，分別對(duì)10倍藥材重量、20倍藥材重量、30倍藥材重量及40倍藥材重量體積的溶劑進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在待測(cè)成分中30倍體積的提取效率最高，由此在樣本提取中，選取30倍體積作為溶劑量。②優(yōu)化色譜條件：研究發(fā)現(xiàn)，堿基類(lèi)化合物具有較大極性，而核苷類(lèi)化合物與其類(lèi)似，極性較大[12-13]。因此，在本研究中的色譜分離步驟中，選取Zorbax SB-Aq分析柱，優(yōu)勢(shì)在于該種分析柱以純水作為流動(dòng)相；同時(shí)，比較不同流動(dòng)相發(fā)現(xiàn)，分析物峰形最好的情況是將乙腈-甲酸水溶液作為流動(dòng)相[14-16]。

對(duì)于核苷與補(bǔ)益中藥的關(guān)系，本研究選取補(bǔ)血藥物當(dāng)歸、熟地黃，補(bǔ)氣藥物黃芪、人參，補(bǔ)陽(yáng)藥物肉蓯蓉及補(bǔ)陰藥物麥冬作為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以上補(bǔ)益中藥中，核苷類(lèi)化合物均大量存在，其中核苷類(lèi)成分含量最高的藥物包括當(dāng)歸、黃芪和人參。參照物選取冬蟲(chóng)夏草，以本研究測(cè)定結(jié)果為依據(jù)，結(jié)合相關(guān)藥典中對(duì)于各味藥材的用量進(jìn)行計(jì)算可見(jiàn)，與冬蟲(chóng)夏草相比較來(lái)說(shuō)，在藥典用量下本研究所選取的補(bǔ)益中藥所含有的尿苷總量均更高，黃芪中腺嘌呤、鳥(niǎo)苷含量均更高，當(dāng)歸中腺苷含量更高，且在同等用藥量情況下，人參中所含腺苷、鳥(niǎo)苷成分均更高[17-18]。

綜上所述，核苷類(lèi)成分屬于重要生命物質(zhì)的一種，具有免疫調(diào)節(jié)作用，藥理、生理活性較強(qiáng)，是多種補(bǔ)益中藥中含量較高的活性成分，在其他補(bǔ)益中藥如三七、人參、黃芪及當(dāng)歸中也發(fā)揮著重要作用，其與補(bǔ)益藥物的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。