劉慧，徐薇，王永生

(南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南衡陽 421001)

鳥苷是嘌呤核苷類物質(zhì)的一種，在藥品和食品行業(yè)中是一種非常重要的中間體，并且它在制造無環(huán)鳥苷、三氮唑核苷、三磷酸鳥苷鈉等藥物當中充當主要原料。同時，鳥苷還在當今一些癌癥的確診中也突顯出了其重要意義［1-2］。目前，檢測鳥苷的主要手段有高效液相色譜法［3］、分子印跡固相微萃?。?］、毛細管電泳法［5］、薄層掃描法［6］等。雖然這些方法都有其優(yōu)點，但普遍存在操作費時和設備昂貴等缺點。本研究基于鳥苷與金納米間的相互作用可改變吸光度的原理，建立了檢測鳥苷的金納米分光光度的新方法。該方法不僅操作簡單，而且還具備快速、廉價等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

鳥苷、氯金酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉、Britton-Robinson(BR)緩沖溶液等試劑均為分析純;實驗用水為雙蒸滅菌水。

島津UV2550紫外-可見分光光度計;TG16-WS離心機;AB204-S電子分析天平;PB-20酸度計。

1.2 金納米粒子制備

根據(jù)文獻［7-8］，金納米粒子可用檸檬酸還原法制得，再用0.22 μm的濾膜過濾。紫外-可見吸收光譜下520 nm 處消光系數(shù)為2.7 ×108(mol·cm－1)，濃度約為8.1 nmol/L，粒徑大小約(15±2)nm。

1.3 實驗方法

在2 mL EP管中，依次加入pH 3.6 BR緩沖液100 μL，金納米溶液 40 μL，放置 10 min，待反應完全后，加入鳥苷及氯化鈉70 μL，并用雙蒸滅菌水加至500 μL，放置5 min。在UV-2550紫外可見分光光度計上200～700 nm進行掃描，得到紫外吸收光譜。取λ630和λ530處的吸光度比值為檢測信號，用ΔA630/A530與不同濃度鳥苷建立標準曲線進行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜特征

圖1b為制得金納米粒子(AuNPs)溶液的吸收光譜，其溶液為酒紅色，最大吸收峰在530 nm附近加入鳥苷后，溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{紫色，530 nm吸收強度減小，而在630 nm處出現(xiàn)一個新的吸收峰(見圖1c)。將鳥苷加入AuNPs溶液后，引起了AuNPs的聚集，從而在630 nm出現(xiàn)了一個新的吸收峰。

圖1 鳥苷檢測體系的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra of guanosine system

圖2為鳥苷-AuNPs體系紫外-可見圖譜。

圖2 AuNPs中加入不同濃度鳥苷的吸收光譜圖Fig.2 Absorption spectra of AuNPs with different concentration of guanosinea.金納米 +鳥苷1.41 ×10－6mol/L;b.金納米 +鳥苷1.13 ×10－6mol/L;c.金納米 +鳥苷8.47 ×10－7mol/L;d.金納米 +鳥苷5.64 ×10－7mol/L;e.金納米 + 鳥苷2.82 ×10－7mol/L;f.金納米 +鳥苷1.76 ×10－7mol/L;g.金納米

由圖2可知，在pH 3.6 BR緩沖液中，隨著加入鳥苷的體積增加，不同濃度鳥苷體系ΔA630/A530比值也不斷增加且在一定范圍內(nèi)與吸收強度成線性關(guān)系。金納米粒子由帶負電荷的檸檬酸根保護，使得金納米粒子在溶液中均勻分散。加入鳥苷后，金納米粒子間的靜電斥力減弱，使得金納米粒子聚集，粒徑增大，導致溶液顏色發(fā)生變化，同時體系的吸收光譜也發(fā)生變化。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1 體系酸度及用量的優(yōu)化 由圖3可知，在BR緩沖液中，隨著pH增大，ΔA630/A530也相應增大，當pH在3.0～4.0時ΔA630/A530先緩慢增加后又會降低，當pH 達到3.6時，ΔA630/A530也達到最大，故本研究選定pH為3.6的BR緩沖溶液控制體系的酸度。另外，用量為100 μL時，ΔA630/A530最大。因此，本實驗中我們選定BR緩沖液用量為100 μL。

圖3 pH值對體系的影響Fig.3 The effect of pH value on the system

2.2.2 AuNPs用量的優(yōu)化 實驗證實，隨著AuNPs用量的增加，體系的吸光度也會隨之發(fā)生一系列變化。當加入40 μL的金納米時，ΔA630/A530最大。因此，本研究選定金納米的加入量為40 μL。

2.2.3 反應時間的優(yōu)化 將鳥苷加入金納米溶液后，每間隔2 min用紫外分光光度計掃描一次。當兩者反應10 min時，溶液顏色不再改變，再加入一定量的 NaCl溶液，并靜置6 min，ΔA630/A530比值以及金納米粒子顏色變化趨于穩(wěn)定。因此，選擇金納米與鳥苷的反應時間為10 min，加入氯化鈉靜置時間為6 min。

2.2.4 試劑加入順序的優(yōu)化 在優(yōu)化的實驗條件下，做試劑加入順序?qū)Ψ磻w系影響的實驗。結(jié)果表明，以BR→AuNPs→鳥苷→NaCl的加入順序所得實驗結(jié)果最好，且穩(wěn)定時間長，故本實驗選用BR→AuNPs→鳥苷→NaCl加入順序。

2.3 干擾實驗

在優(yōu)化的實驗條件下，鳥苷濃度為2.58×10－6mol/L，實驗了可能共存的多種離子和物質(zhì)對體系的影響。結(jié)果表明，當相對標準偏差≤±5%時，50 倍的 Al3+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Cu2+、F－、Cl－、Br－、HC、N、HS、S、腺苷、葡萄糖、EDTA，10倍的脫氧鳥苷等對本體系沒有影響。說明這種方法有良好的選擇性，取樣后只需通過離心去除大分子物質(zhì)便能夠進行實時檢測分析。

2.4 標準曲線、檢出限及精密度

在優(yōu)化實驗條件下，通過加入不同體積的鳥苷標準溶液，繪制校正工作曲線。當鳥苷濃度在1.75×10－8～6.27 ×10－6mol/L 時，與體系 ΔA630/A530有較好的線性關(guān)系，線性方程為ΔA630/A530=1.33c×10－6mol/L+0.017 5，相關(guān)系數(shù) r=0.997。根據(jù)11次空白樣品的平行測定，按公式LOD=3Sb/k(Sb和k分別為空白管的標準差和直線回歸方程的斜率)計算可得本研究的檢出限為5.26×10－9mol/L。在最佳條件下，平行配制11管濃度分別為1.372×10－7，2.744 ×10－7，1.098 ×10－6mol/L 的鳥苷標準溶液進行精密度實驗，相對標準偏差(RSD)分別為3.75%，2.98%和 1.42%。

2.5 樣品分析

采集衡陽市南華大學第二附屬醫(yī)院尿樣3份和南華大學健康學生尿樣1份，樣品通過離心機(2 000 r/min)離心10 min，取上清液測定樣品中的鳥苷含量和加標回收率，結(jié)果見表1。

表1 尿樣分析結(jié)果(n=6)Table 1 The determination results of guanosine in human urine samples

3 結(jié)論

在本實驗條件下，鳥苷與AuNPs結(jié)合，屏蔽了金納米粒子間的靜電斥力，使金納米聚集，導致體系的顏色及吸光度值發(fā)生變化，且在一定的濃度范圍，體系吸光度比值與鳥苷的濃度具有良好的線性關(guān)系，據(jù)此建立了金納米分光光度法測定尿樣中痕量鳥苷的新方法。該新方法具有簡單、快速、廉價、選擇性好的優(yōu)點。

［1］鄭育杰，陳英杰，逢濤.腸癌患者尿中排放鳥苷的高效液相色譜法研究［J］.色譜，2002，20(2):43-46.

［2］陳英杰，鄭育芳，王凝芳.尿中核苷檢測在胃癌診斷中的意義［J］.癌癥，2003，3(5):537-540.

［3］趙楊，靳鳳云，伍慶，等.高效液相色譜法測定貴州不同產(chǎn)地半夏藥材中鳥苷和腺苷的含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18(1):23-24.

［4］陳雙喜，蔡顯鵬，王仲石，等.鳥苷發(fā)酵的優(yōu)化研究［J］.微生物學通報，2002，29(5):65-69.

［5］王祝偉，孫毓慶.毛細管電泳法測定紅毛五加莖皮中鳥苷的［J］.應用化學，2004，21(1):32-34.

［6］高道俠，許敏.薄層掃描法測定金水寶膠囊中鳥苷的含量［J］.江西中醫(yī)學院學報，1998，10(3):131.

［7］Qian Q M，Wang Y S，Yang H X，et al.Colorimetric detection of metallothioneins using a thymine-rich oligonucleotide-Hg complex and gold nanoparticles［J］.Anal Biochem，2013，436(1):45-52.

［8］Zhou B，Shi L F，Wang Y S，et al.Resonance light scattering determination of uranyl based on labled DNAzymegold nanoparticle system［J］.Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2013，110(6):419-424.