李 洋 郝雅芹 高 倩 李云霞 張 顏

(保定市第二中心醫(yī)院產(chǎn)科，河北省保定市 072750)

子癇前期的發(fā)生率和病死率極高，可影響2%～8%的妊娠婦女，是發(fā)展中國家孕產(chǎn)婦死亡的重要原因[1-2]。臨床上，常根據(jù)臨床體征和癥狀的嚴重程度將子癇前期分為輕度子癇前期和重度子癇前期，同時可根據(jù)臨床體征和癥狀出現(xiàn)的時期將其分為早發(fā)型子癇前期(妊娠34周及之前出現(xiàn))和晚發(fā)型子癇前期(妊娠34周之后出現(xiàn))[3]。目前子癇前期的病因尚不完全清楚，有研究表明子癇前期的潛在發(fā)病機制可能是滋養(yǎng)細胞重鑄障礙造成了胎盤缺氧，導(dǎo)致多種炎性因子進入母體血液循環(huán)，最終引發(fā)血管內(nèi)皮損傷和全身系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[4]。巨噬細胞抑制因子-1(macrophage inhibitory cytokine-1，MIC-1)是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員之一，位于合體滋養(yǎng)細胞和蛻膜，在胎盤功能維持和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，有研究表明在炎癥、急性損傷、腫瘤等病理狀態(tài)下其表達水平增高[5]。而子癇前期會引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，提示MIC-1可能與子癇前期的發(fā)生有關(guān)。乳腺癌Ⅰ型易感基因(breast cancer typeⅠ susceptibility gene，BRCA1)是一種抑癌基因，在乳腺癌、卵巢癌等疾病中表達異常[6]，且在調(diào)控細胞增殖、DNA修復(fù)及誘導(dǎo)損傷細胞凋亡等過程中起關(guān)鍵作用[7]。而胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡及侵襲力異常被認為是子癇前期的重要發(fā)病機制[4]，由此推測BRCA1可能也參與子癇前期的發(fā)病過程。因此，本研究通過檢測子癇前期孕婦胎盤中BRCA1、MIC-1的表達情況，探討二者在子癇前期孕婦中的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2021年1月在保定市第二中心醫(yī)院產(chǎn)科經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩的子癇前期孕婦80例，納入標準：(1)符合第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》中子癇前期的診斷和分度標準[8]。(2)有剖宮產(chǎn)術(shù)指征，且患者及家屬同意接受剖宮產(chǎn)術(shù)；(3)單胎妊娠；(4)接受子癇前期常規(guī)治療，且分娩出活胎。排除標準：(1)有免疫性疾病、高血壓、慢性肝炎、慢性腎炎、糖尿病等疾??；(2)既往有子癇前期史或有家族史；(3)合并其他妊娠并發(fā)癥；(4)術(shù)中發(fā)現(xiàn)有胎盤粘連、胎盤植入等導(dǎo)致胎盤滯留超過30 min；(5)臨床資料不完整。將80例子癇前期孕婦分為輕度子癇前期組和重度子癇前期組，各40例。輕度子癇前期組孕婦年齡22～33(26.63±4.52)歲，分娩孕周為37～40(38.35±1.33)周，孕前體質(zhì)指數(shù)(22.58±3.25)kg/m2；重度子癇前期組孕婦年齡24～35(26.63±4.52)歲，分娩孕周為37～41(38.13±1.04)周，孕前體質(zhì)指數(shù)(23.20±2.56)kg/m2。另外選取同期因社會因素或頭盆不稱而在本院行剖宮產(chǎn)的40例正常孕婦為對照組，年齡23～36(26.24±5.35)歲，分娩孕周為37～41(38.12±1.45)周，孕前體質(zhì)指數(shù)(22.01±2.83)kg/m2。3組一般資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準，所有孕婦均自愿參與本研究并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集：于胎盤娩出后15 min內(nèi)快速收集組織樣本，于胎盤母體面中央取2份體積約為1 cm3的胎盤組織(約2 g)。用PBS快速反復(fù)沖洗其中一份組織，直至無血殘留，然后放入液氮中快速冷凍，保存于-80 ℃冰箱；用福爾馬林固定另一份胎盤組織后，行石蠟包埋。所有操作都盡可能快地在冰桶上進行，盡量減少樣品的反復(fù)凍融次數(shù)。于剖宮產(chǎn)前采集兩組孕婦晨起空腹靜脈血4 mL，以4 000 r/min離心10 min后取血清(離心半徑15 cm)。

1.2.2 生化指標的檢測和血壓的測量：采用Microlab 300全自動生化分析儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)檢測血清總膽固醇、三酰甘油、LDL-C、HDL-C水平及24 h尿蛋白含量。采用電子血壓計(OMRON公司，型號：HEM-7012)測量孕婦產(chǎn)前收縮壓和舒張壓，均于早上9點且孕婦處于安靜狀態(tài)下進行測量。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測胎盤中BRCA1和MIC-1 mRNA表達水平：使用TRIzol試劑(Invitrogen公司，貨號：15596026)提取胎盤組織中的總RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司)測定RNA的濃度和純度。以1 μg總RNA為模板，經(jīng)16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min等步驟反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京伊塔生物科技有限公司(貨號：YT9036)。使用TaqMan? Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems公司，貨號：4369016)，通過實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司，型號：ABI 7500)擴增目的基因。反應(yīng)體系包括cDNA 4 μL，正向、反向引物各1 μL，TaqMan? Gene Expression Master Mix 10 μL，無RNA酶的滅菌水4 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃、 5 min； 94 ℃、 30 s，61 ℃、 30 s，72 ℃、 1 min，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，所有引物序列均由合肥知恩生物技術(shù)有限公司合成。采用2-ΔΔCt法分析BRCA1、MIC-1 mRNA相對表達水平。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.4 免疫組化法檢測胎盤組織中BRCA1、MCI-1蛋白表達：將石蠟包埋的胎盤組織常規(guī)脫蠟水化，PBS洗滌3次，高溫高壓修復(fù)抗原5 min。自然冷卻后，用PBS洗滌胎盤組織，加入一抗BRCA1抗體或MIC-1抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：ab191042-BRCA1、bs-9676R-2；稀釋比例為1 ∶1 000,)室溫孵育1 h，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗IgG(北京博爾西科技有限公司，貨號：BHR201；稀釋比例為1 ∶2 500)室溫孵育15 min。DAB染色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，將出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒的細胞判定為陽性細胞。隨機選擇10個不重復(fù)視野，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)并計算陽性細胞率，陽性細胞率<10%記為陰性表達，若陽性細胞率≥10%但<30%記為弱陽性表達，若陽性細胞率≥30%但<70%記為中等強度陽性表達，若陽性細胞率≥70%記為強陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用(x±s)表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，等級資料的比較采用秩和檢驗；采用Pearson檢驗分析BRCA1 mRNA表達水平與MIC-1 mRNA表達水平之間，及BRCA1、MIC-1 mRNA表達水平與臨床指標之間的相關(guān)性。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組孕婦血壓和生化指標的比較 重度子癇前期組和輕度子癇前期組孕婦收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、24 h尿蛋白、總膽固醇水平、LDL-C水平較對照組升高，且重度子癇前期組孕婦收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、24 h尿蛋白、LDL-C水平均高于輕度子癇前期組孕婦(均P<0.05)；重度子癇前期組和輕度子癇前期組孕婦中HDL-C水平較對照組降低，且重度子癇前期組孕婦HDL-C水平低于輕度子癇前期組孕婦(均P<0.05)。見表2。

表2 3組孕婦血壓和生化指標的比較(x±s)

2.2 3組孕婦胎盤組織中BRCA1、MIC-1蛋白表達情況的比較 在BRCA1蛋白陽性表達方面，重度子癇前期組<輕度子癇前期組<對照組(P<0.05)；在MIC-1蛋白陽性表達方面，重度子癇前期組>輕度子癇前期組>對照組(P<0.05)。見表3和圖1。

表3 3組孕婦胎盤組織中BRCA1、MIC-1蛋白表達情況的比較(n)

圖1 3組胎盤組織中BRCA1、MIC-1蛋白的表達情況(免疫組織化學(xué)染色，×400)

2.3 3組孕婦胎盤組織中BRCA1和MIC-1 mRNA表達水平的比較 重度子癇前期組和輕度子癇前期組孕婦胎盤組織中BRCA1 mRNA表達水平低于對照組，且重度子癇前期組低于輕度子癇前期組(均P<0.05)；重度子癇前期組和輕度子癇前期組孕婦胎盤組織中MIC-1 mRNA表達水平高于對照組，且重度子癇前期組高于輕度子癇前期組(均P<0.05)。見表4。

表4 3組孕婦胎盤組織中BRCA1和MIC-1 mRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.4 子癇前期孕婦胎盤組織中BRCA1和MIC-1 mRNA表達水平與臨床指標的相關(guān)性 子癇前期孕婦胎盤組織中BRCA1 mRNA表達水平與收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、24 h尿蛋白水平、總膽固醇水平、三酰甘油水平、LDL-C水平呈負相關(guān)，與HDL-C水平呈正相關(guān)(均P<0.05)；子癇前期孕婦胎盤組織中MIC-1 mRNA表達水平與收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、24 h尿蛋白水平、總膽固醇水平、三酰甘油水平、LDL-C水平呈正相關(guān)，與HDL-C水平呈負相關(guān)(均P<0.05)。見表5。

表5 子癇前期孕婦胎盤組織中BRCA1、MIC-1 mRNA表達水平與臨床指標的相關(guān)性

2.5 子癇前期孕婦胎盤組織中BRCA1、MIC-1 mRNA表達水平的相關(guān)性 子癇前期孕婦胎盤中BRCA1 mRNA、MIC-1 mRNA表達水平呈負相關(guān)(r=-0.436，P<0.001)。

3 討 論

子癇前期是妊娠20周后發(fā)生的一種特發(fā)性高血壓綜合征，表現(xiàn)為多系統(tǒng)損傷，臨床表現(xiàn)包括蛋白尿、血小板減少、腎功能不全、肝功能受損、肺水腫等癥狀[9]。在發(fā)展中國家，子癇前期的發(fā)生率為4%～18%，病死率高達10%～15%[10]，是死產(chǎn)和嬰兒過早死亡的第二大原因[11]，嚴重威脅母嬰的健康和生命安全。相關(guān)研究表明，炎癥反應(yīng)、滋養(yǎng)細胞異常凋亡、血流灌注異常等均可能是導(dǎo)致子癇前期發(fā)生的主要原因[12]，但具體作用機制尚不清楚。本研究旨在探討子癇前期患者胎盤組織中BRCA1、MIC-1的表達情況及臨床意義，為子癇前期發(fā)病機制的研究提供參考依據(jù)。

BRCA1基因定位于人類染色體17q21，所編碼的蛋白的相對分子量為220 000[13-14]。研究表明BRCA1可以干擾細胞周期，抑制細胞增殖，促進DNA的損傷修復(fù)[15]，在多種腫瘤疾病中發(fā)揮重要作用[16]。滋養(yǎng)細胞具有侵襲性強、增長率高等特點，這與腫瘤細胞十分相似[17]，因此我們推測BRCA1可能與子癇前期的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，子癇前期孕婦胎盤中BRCA1蛋白及mRNA表達水平較健康孕婦下降(P<0.005)。這提示BRCA1表達水平下降可能與子癇前期的發(fā)生有關(guān)，原因可能是BRCA1參與胎盤滋養(yǎng)細胞的增殖、侵襲及凋亡的過程，其低表達水平可能引起胎盤血液供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致患者的胎盤功能下降，促進子癇前期的發(fā)生和發(fā)展。另外，我們還發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦胎盤組織中BRCA1 mRNA表達水平與收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、24 h尿蛋白水平、總膽固醇水平、三酰甘油、LDL-C水平呈負相關(guān)，與HDL-C水平呈正相關(guān)，進一步表明了BRCA1的表達水平與子癇前期的發(fā)生相關(guān)，或可作為診斷子癇前期的潛在指標。

MIC-1又稱為生長分化因子-15，在除胎盤和前列腺外的大多數(shù)正常組織中表達較低[18]，但其在腫瘤、炎癥發(fā)生時大量表達，廣泛參與細胞凋亡、分化、增殖及機體炎癥反應(yīng)信號傳遞[19]。本研究中子癇前期孕婦胎盤組織中MIC-1蛋白及mRNA表達水平高于健康孕婦，且MIC-1 mRNA表達水平與收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、24 h尿蛋白、總膽固醇、三酰甘油水平、LDL-C水平呈正相關(guān)，與HDL-C水平呈負相關(guān)，提示其與子癇前期的發(fā)生有關(guān)，推測MIC-1可能通過參與胎盤滋養(yǎng)細胞的凋亡過程導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。本研究結(jié)果還提示子癇前期患者胎盤組織中BRCA1 mRNA與MIC-1 mRNA表達水平呈明顯負相關(guān)，但二者的關(guān)聯(lián)機制尚不清楚，有待進一步探究。

綜上所述，子癇前期孕婦胎盤中BRCA1呈低表達而MIC-1呈高表達，兩者可能共同參與子癇前期的發(fā)生，有可能成為治療子癇前期的新靶點。