江 輝 陳小枚 邱 泱 吳森超 王福珍（福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院腎內(nèi)科，龍巖 364000）

糖尿病腎病是糖尿病全身微血管病并發(fā)癥之一，通常合并其他器官或系統(tǒng)微血管病，如糖尿病視網(wǎng)膜病變和外周神經(jīng)病變［1-2］。1型糖尿病并發(fā)糖尿病腎病多發(fā)生于發(fā)病10~15年，而2型糖尿病并發(fā)糖尿病腎病時(shí)間較短，與患者年齡較大、合并較多其他基礎(chǔ)疾病有關(guān)［3-4］。大蒜素是從蔥科蔥屬植物大蒜的鱗莖（大蒜頭）中提取的一種有機(jī)硫化合物，也存在于洋蔥和其他蔥科植物，具有抗炎、抗菌、抗高血壓、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等作用［5-6］。miR-27a是一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的單鏈RNA分子，在多種疾病中發(fā)揮重要作用。研究顯示，糖尿病腎病中miR-27a表達(dá)上調(diào)［7-8］。大蒜素能否通過miR-27a影響高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子和纖維化成分表達(dá)尚不清楚。本研究擬探究大蒜素通過調(diào)控miR-27a表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子和纖維化成分表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 大蒜素購自中國藥品生物制品鑒定所，用DMSO稀釋為100 mmol/L儲(chǔ)備液，?20℃保存?zhèn)溆?；人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購自美國ATCC公司（批號(hào)：FS-0054）；DMEM低糖培養(yǎng)基（批號(hào)：SH-10354）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：AAF201832）、胎牛血清（FBS，批號(hào)：SV26052）、胰蛋白酶（批號(hào)：SH-25213）購自美國Hyclone公司；MTT試劑盒（批號(hào)：AR0953）購自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol試劑（批號(hào)：15575012）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：13268052）購自美國Invitrogen公司；ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；PVDF膜（批號(hào)：20201204）購自北京索萊寶生物科技公司；一抗、二抗購自北京天根生化科技有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2，37℃、5%CO2中培養(yǎng)，細(xì)胞90%左右融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，分為NG組（含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM低糖培養(yǎng)基）、HG組（含25 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基）、HG+不同劑量大蒜素處理組（HG+2.5、5.0、10.0、20.0 μg/ml大蒜素）；將miR-NC、miR-27a、anti-miR-NC、anti-miR-27a轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞進(jìn)行高糖處理，作為HG+miR-NC組、HG+miR-27a組、HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-27a組；將大蒜素與miR-NC、大蒜素與miR-27a共轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞并進(jìn)行高糖處理，作為HG+大蒜素+miR-NC組、HG+大蒜素+miR-27a組。培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞活性 取生長狀態(tài)良好的各組細(xì)胞，制成密度為1×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液并接種至96孔板，20μl/孔加入MTT試劑（5 mg/ml）37℃孵育4 h，150 μl/孔加入DMSO反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處OD值，以O(shè)D值換算表示細(xì)胞活性。

1.2.3 RT-qPCR檢測細(xì)胞miR-27a表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的各組細(xì)胞，總RNA試劑盒提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRTPCR反應(yīng)，2?ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)。反應(yīng)條件為：95℃1 min，94℃15 s，58℃20 s，72℃45 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-27a以U6為內(nèi)參。miR-27a正向引物：5'-CGGCGGTTTCACAGTGGCTAAG-3'，反向引物5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.4 ELISA檢測細(xì)胞IL-1β、IL-8和MCP-1炎癥因子水平 取生長狀態(tài)良好的各組細(xì)胞，取上清，按照ELISA試劑盒說明檢測上清中IL-1β、IL-8和MCP-1炎癥因子水平。

1.2.5 Western blot檢測細(xì)胞E-cadherin、α-SMA蛋白表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的各組細(xì)胞，細(xì)胞裂解法提取總蛋白，BCA檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉3 h，加入一抗（E-cadherin 1∶1 000稀釋、α-SMA 1∶800稀釋）4℃封閉過夜，加入二抗（β-actin 1∶2 000）37℃孵育1 h。以β-actin為內(nèi)參，分析條帶灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0和Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2活性的影響 與NG組比較，HG組細(xì)胞活性顯著降低（P<0.05）；與HG組比較，HG+2.5、5.0、10.0、20.0 μg/ml Allicin組細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)（P<0.05，表1）。選取20.0μg/ml大蒜素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同劑量大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2活性的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of different doses of Allicin on activity of hu?man renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9）

表1 不同劑量大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2活性的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of different doses of Allicin on activity of hu?man renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05.

Groups NG HG HG+2.5μg/ml Allicin HG+5.0μg/ml Allicin HG+10.0μg/ml Allicin HG+20.0μg/ml Allicin F P Cell viability（%）100.23±9.02 46.92±4.381）65.42±5.802）73.16±6.602）82.01±7.712）89.62±6.082）350.127<0.001

2.2 大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2炎癥水平的影響 與NG組比較，HG組炎癥因子IL-1β、IL-8、MCP-1水平顯著上調(diào)（P<0.05）；與HG組比較，HG+Allicin組炎癥因子IL-1β、IL-8、MCP-1水平顯著下調(diào)（P<0.05，表2）。

表2 大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2炎癥因子水平的影響（±s，n=9，ng/L）Tab.2 Effect of Allicin on inflammation levels of human renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9，ng/L）

表2 大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2炎癥因子水平的影響（±s，n=9，ng/L）Tab.2 Effect of Allicin on inflammation levels of human renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9，ng/L）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group 2）P<0.05.，

Groups NG HG HG+Allicin F P IL-1β 9.32±1.03 23.09±3.211）13.82±2.222）264.038<0.001 IL-8 9.38±1.18 26.78±4.281）14.68±3.702）283.097<0.001 MCP-1 18.62±4.81 68.92±6.511）25.62±4.482）255.573<0.001

2.3 大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與NG組比較，HG組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，α-SMA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）；與HG組比較，HG+Allicin顯著上調(diào)E-cad‐herin蛋白表達(dá)；顯著下調(diào)α-SMA蛋白表達(dá)（P<0.05，圖1、表3）。

表3 大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of Allicin on related protein expressions in hu?man renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9）

表3 大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of Allicin on related protein expressions in hu?man renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05.

Groups NG HG HG+Allicin F P E-cadherin protein 0.98±0.09 0.24±0.021）0.78±0.072）173.252<0.001 α-SMA protein 0.96±0.09 2.68±0.671）1.15±0.452）192.317<0.001

圖1 大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 E-cadherin α-SMA蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of Allicin on E-cadherin and α-SMA protein expressions in human renal tubular epithelial cells HK-2、

2.4 大蒜素對(duì)miR-27a表達(dá)的影響 與NG組比較，HG組細(xì)胞miR-27a表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）；與HG組比較，HG+Allicin組細(xì)胞miR-27a表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05，表4）。

表4 大蒜素對(duì)miR-27a表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of allicin on miR-27a expression（±s，n=9）

表4 大蒜素對(duì)miR-27a表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of allicin on miR-27a expression（±s，n=9）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05.

Groups NG HG HG+Allicin F P miR-27a 1.02±0.10 3.82±0.671）1.44±0.162）167.035<0.001

2.5 miR-27a對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2活性、炎癥和纖維化的影響 與HG+miR-NC組比較，HG+miR-27a組細(xì)胞活性、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，IL-1β、IL-8、MCP-1炎癥因子水平及α-SMA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）；與HG+anti-miR-NC組比較，HG+anti-miR-27a組細(xì)胞活性、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，IL-1β、IL-8、MCP-1炎癥因子水平及α-SMA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05，圖2、表5）。

圖2 miR-27a對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 E-cadherin、α-SMA蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of miR-27a on E-cadherin and α-SMA pro?tein expressions in human renal tubular epithelial cells HK-2

表5 miR-27a對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2活性、炎癥和纖維化的影響（±s，n=9）Tab.5 Effect of miR-27a on activity，inflammation and fibrosis of human renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9）

表5 miR-27a對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2活性、炎癥和纖維化的影響（±s，n=9）Tab.5 Effect of miR-27a on activity，inflammation and fibrosis of human renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9）

Note：Compared with HG+miR-NG group，1）P<0.05；compared with HG+anti-miR-NC group，2）P<0.05.

Groups HG+miR-NC HG+miR-27a HG+anti-miR-NC HG+anti-miR-27a F P Cell viability（%）88.62±8.33 42.31±2.801）45.62±4.09 90.85±5.572）489.035<0.001 IL-1β/（ng·L?1）8.20±1.27 25.62±4.901）27.06±5.22 7.05±0.942）402.318<0.001 IL-8/（ng·L?1）8.83±1.26 24.68±3.071）25.85±3.01 10.36±1.002）392.079<0.001 MCP-1/（ng·L?1）17.20±3.33 65.08±5.571）62.09±6.66 15.06±0.582）452.019<0.001 E-cadherin protein 0.88±0.10 0.28±0.031）0.32±0.03 0.90±0.082）285.741<0.001 α-SMA protein 0.89±0.09 2.53±0.401）2.49±0.22 0.91±0.112）293.854<0.001

2.6 miR-27a過表達(dá)逆轉(zhuǎn)大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2活性、炎癥和纖維化的影響 與HG+Alli‐cin+miR-NC組比較，HG+Allicin+miR-27a組細(xì)胞活性、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，IL-1β、IL-8、MCP-1炎癥因子水平及α-SMA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05，圖3、表6）。

圖3 miR-27a過表達(dá)逆轉(zhuǎn)大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 E-cadherin、α-SMA蛋白表達(dá)的影響Fig.3 miR-27a over-expression reverses effect of Allicin on E-cadherin and α-SMA proteins expressions in human renal tubular epithelial cells HK-2

表6 miR-27a過表達(dá)逆轉(zhuǎn)大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2活性、炎癥和纖維化的影響（±s，n=9）Tab.6 miR-27a over-expression reverses effect of allicin on activity，inflammation and fibrosis of human renal tubular epi?thelial cells HK-2（±s，n=9）

表6 miR-27a過表達(dá)逆轉(zhuǎn)大蒜素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2活性、炎癥和纖維化的影響（±s，n=9）Tab.6 miR-27a over-expression reverses effect of allicin on activity，inflammation and fibrosis of human renal tubular epi?thelial cells HK-2（±s，n=9）

Note：Compared with HG+Allicin+miR-NC group，1）P<0.05.

Groups HG+Allicin+miR-NC HG+Allicin+miR-27a t P Cell viability（%）89.62±6.08 40.36±2.501）153.247<0.001 IL-1β/（ng·L?1）10.30±1.54 25.55±2.211）172.017<0.001 IL-8/（ng·L?1）11.44±1.28 28.89±3.191）179.435<0.001 MCP-1/（ng·L?1）16.69±3.33 72.31±7.771）126.941<0.001 E-cadherin protein 0.95±0.08 0.29±0.031）98.089<0.001 α-SMA protein 0.97±0.09 2.52±0.411）86.667<0.001

3 討論

糖尿病腎臟病是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是糖尿病的微血管并發(fā)癥，主要為糖尿病性腎小球硬化癥（一種以血管損害為主的腎小球病變），早期多無癥狀，血壓正?；蚱?，發(fā)生率隨糖尿病病程延長而增高［9-10］。

本研究通過高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組細(xì)胞活性顯著下調(diào)；與HG組比較，HG+2.5、5.0、10.0、20.0μg/ml Allicin組細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)。與NG組比較，HG組炎癥水平顯著上調(diào)；與HG組比較，HG+Allicin組炎癥水平顯著下調(diào)。與NG組比較，HG組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，α-SMA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；與HG組比較，HG+Allicin組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，α-SMA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，與既往研究結(jié)論一致［11］。提示大蒜素通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路活化從而抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞分化。

miRNA在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中起促癌或抑癌作用，研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a高表達(dá)促進(jìn)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞纖維化［12］。曹旭等［13］研究發(fā)現(xiàn)，miR-503通過靶向調(diào)控Bcl-2介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡。糖尿病腎病小鼠模型顯示，miR-25-3p呈低表達(dá)，miR-25-3p通過靶向TLR4減輕糖尿病腎病小鼠炎癥反應(yīng)，保護(hù)腎臟［14］。鄒美娜等［15］研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下miR-324-3p表達(dá)明顯增加，miR-324-3p可能通過降低Bcl-2/Bax增加cleaved caspase-3表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。付婷婷等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-223靶向NLRP3影響高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT發(fā)生。李鍇等［17］研究發(fā)現(xiàn)，miR-93-3p通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷及炎癥因子分泌，提示miRNA與糖尿病腎病密切相關(guān)。本研究中，與NG組比較，HG組細(xì)胞miR-27a表達(dá)顯著上調(diào)，與HG組比較，HG+大蒜素組miR-27a表達(dá)顯著下調(diào)，說明大蒜素可調(diào)控miR-27a表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示，與HG+大蒜素+miR-NC組比較，HG+大蒜素+miR-27a組細(xì)胞活性、E-cad‐herin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，炎癥水平及α-SMA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，說明大蒜素可調(diào)控miR-27a表達(dá)在糖尿病腎病中發(fā)揮作用。

綜上，大蒜素通過下調(diào)miR-27a表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥和纖維化成分表達(dá)。