譚 霖，龍 瀅

(黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 凱里 556000)

望江南子為豆科植物望江南CassiaoccidentalisL.的干燥成熟種子。秋季摘取果實(shí)，曬干，打下種子，除去雜質(zhì)，是中醫(yī)臨床的用藥之一。本品始載于《救荒本草》[1]，在我省為常用中藥，1975年始在羅甸、望謨等氣候較高地區(qū)發(fā)現(xiàn)野生?！顿F州省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》1988年版收載為“望江南”，最近的《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003版收載“望江南子”。主要成分為蒽醌類(lèi)及其苷類(lèi)成分：含有大黃素甲醚，大黃酸，大黃酚，蘆薈大黃素[4]；揮發(fā)性成分 ：水蒸氣蒸餾法提取望江南子中的揮發(fā)性成分的實(shí)驗(yàn)中，共分離了101個(gè)化學(xué)成分，鑒別出86個(gè)化學(xué)成分，占揮發(fā)油總量的90.07%，其主要成分為香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、葉綠醇、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮、法尼基丙酮、正己醛、α-紫羅酮，含量最多的是香葉基丙酮[5]。現(xiàn)我省使用的望江南子以野生為主，無(wú)規(guī)模化種植，經(jīng)過(guò)實(shí)地考察研究我省分布于羅甸、望謨、冊(cè)享、安龍等地。

按貴州省藥品監(jiān)督管理局對(duì)《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》換版要求，根據(jù)任務(wù)我組人員到安龍、冊(cè)亨、羅甸實(shí)地采集樣品，采集的臘葉標(biāo)本由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥實(shí)驗(yàn)室的孫慶文教授鑒定確認(rèn)，樣品來(lái)源見(jiàn)表1，原植物形態(tài)見(jiàn)圖1。

表1 樣品來(lái)源Tab.1 Sample sources

圖1 原植物形態(tài)Fig.1 Original plant morphology

將野外采集的3個(gè)藥材果實(shí)樣品曬干，打下種子，除去雜質(zhì)，按照《中藥鑒定學(xué)》[2]和《藥用植物學(xué)》[3]的性狀鑒定方法，對(duì)藥材樣品的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、斷面等特征進(jìn)行對(duì)比觀察和描述。發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的藥材除了在大小方面稍有差異，其他特征相對(duì)比較穩(wěn)定。該藥材的性狀鑒別特征，呈扁卵形，直徑3～4 mm，外表黃綠色、灰綠色或紫棕色，略有光澤，凹凸不平，兩面中央均有一橢圓形平坦的疤痕，疤痕四周有白色網(wǎng)紋。先端有一短尖突起，形似鳥(niǎo)喙，其內(nèi)側(cè)有點(diǎn)狀種臍。質(zhì)堅(jiān)硬，除去種皮后可見(jiàn)2片黃色或黃棕色的子葉。氣微，味微苦，嚼之有豆腥味。外觀見(jiàn)圖2。

圖2 藥材外觀Fig.2 Appearance of the medicinal material

1 顯微鑒別

將3個(gè)樣品分別粉碎，常規(guī)粉末制片。

1.1 儀器與試劑

萊卡DM2500顯微鏡和LAS V3.8顯像系統(tǒng)，以及常規(guī)顯微制片載玻片、蓋玻片、鑷子、水合氯醛、稀甘油、蒸餾水等。

1.2 方法

3個(gè)藥材樣品進(jìn)行常規(guī)粉末制片，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡對(duì)其組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、后含物等進(jìn)行觀察、測(cè)量和描述，并對(duì)具有代表性的特征進(jìn)行拍照和繪圖。

歸納總結(jié)得粉末顯微特征為：本品粉末黃棕色。種皮柵狀細(xì)胞成片，無(wú)色至淡黃色，橫面觀細(xì)胞1列，狹長(zhǎng)方形，壁較厚，光輝帶1條位于細(xì)胞近1/2處；表面觀呈類(lèi)多角形，壁皺縮，細(xì)胞被較厚角質(zhì)層。種皮支持細(xì)胞1列，斷面觀方形，三面增厚，長(zhǎng)10～25 μm；表面觀呈類(lèi)圓形或多角形，直徑20～50 μm，并可見(jiàn)上下兩層同心圓圈。角質(zhì)層碎片表面觀可見(jiàn)多角形網(wǎng)脈樣紋理。內(nèi)胚乳細(xì)胞壁粘液質(zhì)化，胞腔內(nèi)物質(zhì)為黃棕色至紅棕色(圖3)。由于本品橫切面組織特征在鑒別上意義不大，故不予列出，列于此以供參考。

圖3 粉末顯微特征(10×40倍)Fig.3 Microscopic characteristics of the powder(10×40 times)

2 薄層色譜

根據(jù)望江南子的主要成分，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)望江南子貴州產(chǎn)3個(gè)地方樣品進(jìn)行了試驗(yàn)，該方法色譜斑點(diǎn)清晰，易于檢出，重現(xiàn)性好。

供試品溶液制備：取藥材粉末約0.5 g，加入鹽酸-甲醇(1∶10)混合溶液25 mL，置水浴鍋上加熱回流30分鐘，取下放冷，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)尤胍宜嵋阴? mL溶解即得。對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)定大黃素甲醚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院 批號(hào)：110758-200509 含量95.6%)，加乙酸乙酯溶解使?jié)舛燃s為0.5 mg/mL。薄層板：青島海洋化工有限公司制造硅膠H板(批號(hào)：20170811)。點(diǎn)樣：對(duì)照品2 μL，供試品5 μL。展開(kāi)劑：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶2∶0.5∶0.05)。顯色及檢視：置氨蒸汽中熏。結(jié)果：供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)(圖4)。

圖4 薄層色譜圖Fig.4 TLC

2.1 薄層條件選擇

2.1.1 提取溶劑的考察

望江南子中含有大黃素甲醚、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素等有效成分，這些蒽醌類(lèi)有效成分大多都是游離型蒽醌，一般選用乙醇、甲醇作為提取溶劑，可以把不同類(lèi)型、性質(zhì)互異的蒽醌類(lèi)成分提取出來(lái)，由于甲醇的溶解度大于乙醇，本次實(shí)驗(yàn)的提取溶劑為甲醇。

2.1.2 提取方法的考察

提取游離型蒽醌，可以用稀酸水解后，用有機(jī)溶劑提取。比較了加熱回流和超聲提取后，發(fā)現(xiàn)加熱回流更適于本實(shí)驗(yàn)，層析后的斑點(diǎn)更清晰。

2.1.3 水解時(shí)間的考察

本實(shí)驗(yàn)對(duì)鹽酸水解的時(shí)間在對(duì)比試驗(yàn)中分別設(shè)計(jì)了三個(gè)時(shí)間段。分別為30 min、60 min以及120 min，多次實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)這三個(gè)時(shí)間段所提取的有效成分在色譜圖效果無(wú)明顯差異，所以本次實(shí)驗(yàn)所取時(shí)間為30 min。

2.1.4 展開(kāi)劑的選擇

本試驗(yàn)對(duì)望江南子的展開(kāi)劑進(jìn)行了比較和研究[6]，文獻(xiàn)報(bào)道的展開(kāi)劑為石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)，因望江南子與決明子同為豆科植物又同為決明屬，因此也參考了決明子的薄層鑒別的展開(kāi)劑石油醚(30～60℃)-丙酮(2∶1)，經(jīng)過(guò)多次反復(fù)研究，最終選用了正己烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶2∶0.5∶0.05)的比例作為望江南子薄層定性鑒別的展開(kāi)劑。

2.1.5 薄層板的選擇

比較了硅膠G薄板，H板，結(jié)果表明，鑒別望江南子中大黃素甲醚的薄層鑒別實(shí)驗(yàn)，使用硅膠H板作為吸附劑時(shí)，色譜圖上的斑點(diǎn)清晰、集中、重現(xiàn)性好、所提供的信息量大。

2.1.6 檢視條件

望江南子的主要成分是羥基蒽醌類(lèi)，其在堿性條件下顯色，故選擇用氨蒸汽熏顯色檢視。

2.2 耐用性考察

2.2.1 不同薄層板的比較

青島海洋化工有限公司制造硅膠H板(批號(hào)：20170811)與青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司制造硅膠H板(批號(hào)：20150319)，分別按擬定的試驗(yàn)方法試驗(yàn)。結(jié)果表明，兩種薄層板斑點(diǎn)均清晰且分離較好。

2.2.2 不同溫度的比較

取點(diǎn)樣于青島海洋化工有限公司制造硅膠H板(批號(hào)：20170811)后的薄層板，分別在5℃和28℃的溫度環(huán)境下進(jìn)行展開(kāi)。結(jié)果表明該方法對(duì)不同溫度的適應(yīng)性較好。

2.2.3 不同濕度的比較

取點(diǎn)樣于青島海洋化工有限公司制造硅膠H板(批號(hào)：20170811)后的薄層板，分別在28%和88%的濕度中展開(kāi)。結(jié)果表明該方法對(duì)低濕環(huán)境的適應(yīng)性較好。

經(jīng)上述方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明薄層板方面，青島海洋化工有限公司制造硅膠H板與青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司制造硅膠H板均可達(dá)到分離效果，且分離效果好、斑點(diǎn)集中；不同溫度濕度變化可導(dǎo)致色譜效果略有不同，均能達(dá)到鑒別需要。驗(yàn)證及復(fù)核實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜉^好重現(xiàn)，因此本方法耐用性良好。

3 水分

依照《中國(guó)藥典》2015版第四部通則0832水分測(cè)定法第二法，分別取三個(gè)地區(qū)的望江南子藥材測(cè)定水分。其值得9.80%～10.5%，均值為10.2%(結(jié)果見(jiàn)表2)，根據(jù)藥材測(cè)得的水分范圍和浮動(dòng)20%，建議將藥材水分定為不得過(guò)13.0%。

表2 水分、總灰分、浸出物檢測(cè)數(shù)據(jù)Tab.2 Detection data of moisture，total ash and extract

望江南子為種子類(lèi)藥材，含有少量揮發(fā)性物質(zhì)，因甲苯法適用于含有揮發(fā)性的物質(zhì)，烘干法適用于不含或少含揮發(fā)性的物質(zhì)，本次試驗(yàn)比較了四部通則0832水分測(cè)定法的第四法(甲苯法)和第二法(烘干法)測(cè)定望江南子的水分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法下測(cè)出來(lái)的水分含量差異不大(見(jiàn)表2)，又因甲苯法需要的甲苯較多且甲苯本身對(duì)人體的中樞神經(jīng)傷害很大，烘干法簡(jiǎn)便，對(duì)人體無(wú)明顯傷害，所以結(jié)合經(jīng)濟(jì)及健康情況考慮，本次實(shí)驗(yàn)的水分含量的測(cè)定方法選用了烘干法。

4 總灰分

依照《中國(guó)藥典》2015版第四部通2302，分別取三個(gè)地方的望江南子藥材測(cè)定總灰分。其值得3.5%～3.8%，均值為3.6%(結(jié)果見(jiàn)表2)，根據(jù)藥材測(cè)得的總灰分范圍和浮動(dòng)20%，建議將藥材總灰分定為不得過(guò)5.0%。

5 浸出物

依照《中國(guó)藥典》2015版第四部通則2201中的醇性浸出物熱浸法，以乙醇為溶劑，取三個(gè)地區(qū)的望江南子藥材測(cè)定浸出物，以干燥品計(jì)算浸出量其值得8.1%～8.8%，均值為8.4%(結(jié)果見(jiàn)表2)。根據(jù)藥材測(cè)得的范圍和浮動(dòng)20%，建議將藥材浸出物定為不低于6.0%。

5.1 浸出物提取溶劑的考查

根據(jù)望江南子藥材所含主要化學(xué)成分浸出物的測(cè)定，采用有機(jī)溶劑更具經(jīng)濟(jì)性、安全性和穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)比較了甲醇和乙醇這兩種有機(jī)溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溶劑為甲醇時(shí)，浸出物的含量要高于乙醇為溶劑的含量。但出于安全性方面考慮，甲醇具有毒性對(duì)人體易造成傷害，所以本次實(shí)驗(yàn)選用了乙醇作為提取溶劑。

5.2 浸出物提取方法的考察

實(shí)驗(yàn)比較了熱浸出物和冷浸出物這兩種方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱浸法更適于本實(shí)驗(yàn)，因?yàn)楹屠浣ū容^起來(lái)，熱浸法提取的含量更高、更穩(wěn)定。

6 揮發(fā)油

本品依照《中國(guó)藥典》2015版第四部通則2204中的甲法對(duì)3個(gè)樣品進(jìn)行揮發(fā)油測(cè)定，結(jié)果揮發(fā)油含量均低于0.1%，其不適合用于作質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

7 含量測(cè)定

試驗(yàn)試圖建立望江南子藥材所含化學(xué)成分較高的大黃素甲醚高效液相色譜法含量測(cè)定，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)供試品溶液制備后其中大黃素甲醚成分不穩(wěn)定，且回收率達(dá)不到要求，所以放棄建立高效液相色譜含量測(cè)定方法以建立浸出物測(cè)定方法代替。

8 結(jié)果和討論

經(jīng)過(guò)研究本品呈扁卵形，直徑3～4 mm，外表黃綠色、灰綠色或紫棕色，略有光澤，凹凸不平，兩面中央均有一橢圓形平坦的疤痕，疤痕四周有白色網(wǎng)紋；先端有一短尖突起，形似鳥(niǎo)喙，其內(nèi)側(cè)有點(diǎn)狀種臍；質(zhì)堅(jiān)硬，除去種皮后可見(jiàn)2片黃色或黃棕色的子葉；氣微，味微苦，嚼之有豆腥味。顯微特征，本品粉末黃棕色，種皮柵狀細(xì)胞成片，無(wú)色至淡黃色，橫面觀細(xì)胞1列，狹長(zhǎng)方形，壁較厚，光輝帶1條位于細(xì)胞近1/2處；表面觀呈類(lèi)多角形，壁皺縮，細(xì)胞被較厚角質(zhì)層；種皮支持細(xì)胞1列，斷面觀方形，三面增厚，長(zhǎng)10～25 μm；表面觀呈類(lèi)圓形或多角形，直徑20～50 μm，并可見(jiàn)上下兩層同心圓圈；角質(zhì)層碎片表面觀可見(jiàn)多角形網(wǎng)脈樣紋理；胚乳細(xì)胞壁粘液質(zhì)化，胞腔內(nèi)物質(zhì)為黃棕色至紅棕色。薄層鑒別，取藥材粉末0.5 g，加入鹽酸-甲醇(1∶10)混合溶液25 mL加熱回流30分鐘，取下放冷，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液；取大黃素甲醚對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作對(duì)照品溶液；吸取供試品溶液5 μL，對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶2∶0.5∶0.05)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干；置氨蒸汽中熏，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，呈相同顏色的斑點(diǎn)。水分，不得超過(guò)13.0%。總灰分，不得超過(guò)5.0%。浸出物，照醇溶性浸出物測(cè)定法的熱浸法測(cè)定，用乙醇作溶劑，不得少于6.0%。

因望江南的特殊生長(zhǎng)習(xí)性要求，在貴州省野生分布范圍較少，本次研究采集到的樣品有限，但也能基本代表貴州產(chǎn)望江南子藥材的質(zhì)量。本次研究沒(méi)有完成含量測(cè)定指標(biāo)，需要在今后的研究中找到代表成分進(jìn)一步完善。