李旭東，吳靜瀾，2，3▲，郭 兵，聶 倩，謝朝宇

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025；3貴州中藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025)

隨著社會(huì)發(fā)展，糖尿病已經(jīng)成為人們健康的巨大隱患，不僅給患者自身帶來極大的痛苦，也給家庭帶來巨大負(fù)擔(dān)。Ⅱ型糖尿病作為日常生活中常見的一種內(nèi)分泌科代謝性疾病，其患者主要集中在中老年人中，其病因有遺傳、環(huán)境、生活習(xí)慣等，主要表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞功能障礙及胰島素抵抗，常伴隨多種并發(fā)癥[1-2]。目前對(duì)糖尿病的治療主要為藥物治療，雖然能顯著降低患者的血糖水平，但需要長(zhǎng)期不間斷用藥，且效果并不是特別理想，給人們的生活帶來了極大的苦惱。

高粱泡葉是薔薇科植物高粱泡(RubuslambertianusSer)的干燥葉，其藥味甘、苦，性平，具有清熱涼血、解毒消瘡等功效，可應(yīng)用于治療感冒發(fā)熱、咳、皮膚糜爛、黃水瘡等[3]。前期實(shí)驗(yàn)對(duì)高粱泡葉提取物借助UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)分析其化學(xué)成分，在此基礎(chǔ)上，本研究通過結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)高粱泡葉中成分及其相關(guān)靶點(diǎn)、信號(hào)通路進(jìn)行分析，構(gòu)建高粱泡葉“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，最終獲得治療Ⅱ型糖尿病的相關(guān)化合物。為高粱泡葉在后期新藥研發(fā)中提供新理論、開發(fā)高粱泡葉的新用途。

1 方法

1.1 高粱泡葉活性成分的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在課題組前期對(duì)高粱泡葉乙醇提取物化學(xué)成分進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析的基礎(chǔ)上，通過查閱中外關(guān)于高粱泡葉研究的相關(guān)文獻(xiàn)，搜索高粱泡葉化學(xué)成分，通過 ETCM(http：//www.tcmip.cn/ETCM/)數(shù)據(jù)庫對(duì)已經(jīng)檢索到的高粱泡葉化學(xué)成分進(jìn)行篩選，篩選出Druglikeness Weight >0.49、Druglikeness Grading為中等(Moderate)或好(Good)的化合物。如果有的化合物不能在ETCM 數(shù)據(jù)庫檢索到，可通過TCMSP(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫查詢OB(OB≥30%)和DL(DL≥0.18)信息進(jìn)行高粱泡葉化學(xué)成分篩選[4-5]。通過SwissTarget Prediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫和Similarity ensemble approach(SEA)(https：//sea.bkslab.org/)數(shù)據(jù)庫檢索高粱泡葉活性成分相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 Ⅱ型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)

通過OMIM(http：//https：//omim.org/)、genecard(http：//www.genecard.org/)數(shù)據(jù)庫，以“type 2 diabetes mellitus ”關(guān)鍵檢索詞查找治療Ⅱ型糖尿病的相關(guān)靶點(diǎn)。將高粱泡葉相關(guān)成分靶點(diǎn)和Ⅱ型糖尿病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線平臺(tái)分析取靶點(diǎn)交集，并繪制韋恩圖。

1.3 構(gòu)建“高粱泡葉-化合物-活性靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)得到的相關(guān)交集靶點(diǎn)及活性成分，通過表格建立“高粱泡葉-化合物-活性靶點(diǎn)”一一對(duì)應(yīng)關(guān)系網(wǎng)，將表格導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制“中藥-化合物-活性靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用圖構(gòu)建及靶點(diǎn)分析

借助STRING((https：//string-db.org/)分析平臺(tái)，輸入篩選出來的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，選擇“Homosapiens”，分析完成后以“tsv”格式文件輸出，將文件Cytoscape 3.7.2(http：//www.cytoscape.org/)軟件中，安裝“cytoHubba”插件對(duì)靶點(diǎn)的度值進(jìn)行計(jì)算，得到核心預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.5 核心靶點(diǎn)的功能富集分析和通路富集分析

采用Metascape(http：//metascape.org/)數(shù)據(jù)庫，對(duì)篩選得到的高粱泡葉治療糖尿病靶點(diǎn)進(jìn)行基因生物過程(GO)富集分析與信號(hào)通路(KEGG)富集分析，利用微生信在線平臺(tái)進(jìn)行可視化分析并作KEGG氣泡圖和GO氣泡圖及柱狀圖。設(shè)置P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 分子對(duì)接和靶點(diǎn)驗(yàn)證

選取“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的靶點(diǎn)與相應(yīng)活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。在PDB數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org/)搜索并下載靶點(diǎn)的pdb格式文件，在PubChem數(shù)據(jù)庫下載活性成分的sdf格式文件，并借助軟件OpenBabel2.4.1轉(zhuǎn)化為mol2格式文件。利用PyMOL軟件去除蛋白結(jié)構(gòu)的水分子及小分子配體，并導(dǎo)入AutoDock軟件進(jìn)行加氫等預(yù)處理。對(duì)受體和配體進(jìn)行分子對(duì)接，分析其結(jié)合活性。并利用 PyMOL軟件將分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過在“1.1”條件下對(duì)高粱泡葉化學(xué)成分的篩選，得到12個(gè)符合化合物，通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫和Similarity ensemble approach(SEA)數(shù)據(jù)庫檢索高粱泡葉活性成分相關(guān)靶點(diǎn)，共得到靶點(diǎn)169個(gè)。

表1 篩選得到的12個(gè)活性成分Tab.1 Twelve active ingredients screened out

2.2 高粱泡葉成分靶點(diǎn)與Ⅱ型糖尿病靶點(diǎn)交集

在“1.2”條件下檢索得到的糖尿病靶點(diǎn)共2026(Relevance score≥20)個(gè)，通過Venny 2.1在線平臺(tái)分析73交集靶點(diǎn)，韋恩圖如圖1所示。

圖1 成分靶點(diǎn)與燙傷作用靶點(diǎn)Venn圖Fig.1 Venn diagram of component targets and disease targets

2.3 中藥-化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

按“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，結(jié)果如圖所示，圖中共有73個(gè)節(jié)點(diǎn)，537條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為14.7。將得到的PPI網(wǎng)絡(luò)信息以TSV格式文件下載并保存圖片格式，將數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中進(jìn)行分析，選擇“Degree”并進(jìn)行值的計(jì)算，節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性和Degree值相對(duì)應(yīng)，因此得到的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖如圖2所示。由圖可知AKT1、EGFR、SRC、ESR1、ERBB2、MMP9、CCND1、MMP2等為關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。

圖2 靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)和核心成分網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Interaction network of targets and network of core components

2.4 高粱泡葉-成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-成分-活性靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)有85個(gè)節(jié)點(diǎn)和126條邊，外圈為高粱泡葉成分靶點(diǎn)和Ⅱ型糖尿病靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)(預(yù)測(cè)靶點(diǎn))，中圈代表的是篩選得到的高粱泡葉活性成分，圓心即代表的是高粱泡藥材(圖3)。

圖3 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Drug-active ingredients-targets network

2.5 核心靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析

在“1.3”進(jìn)行靶點(diǎn)通路富集分析共得到KEGG 富集結(jié)果23條，根據(jù)P 選取排名前10的結(jié)果繪制高級(jí)氣泡圖，高粱泡葉治療Ⅱ型糖尿病主要涉及癌癥的途徑(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、化學(xué)致癌作用(Chemical carcinogenesis - receptor activation)、膀胱癌(Bladder cancer)、黏著小帶(Adherens junction)、癌癥中小分子核糖核酸(MicroRNAs in cancer)、5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse)、卵巢類固醇生成(Ovarian steroidogenesis)等通路。GO富集分析主要包括細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)和生物過程(BP)三個(gè)方面，通過GO富集分析，共得到MF富集結(jié)果22個(gè)、BP 富集結(jié)果62個(gè)、CC富集結(jié)果19個(gè)，選擇富集前十名進(jìn)行優(yōu)化并作氣泡圖及柱狀圖，如圖5所示，MF蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性(protein serine/threonine/tyrosine kinase activity)、芳香化酶活性(aromatase activity)、激酶結(jié)合(kinase binding)、胰島素結(jié)合(insulin binding)等。BP主要包括跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路(transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway)、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)(cellular response to nitrogen compound)、對(duì)無機(jī)物的反應(yīng)、(成纖維細(xì)胞增殖的正調(diào)控(positive regulation of fibroblast proliferation)、對(duì)UV-A的反應(yīng)(response to UV-A)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)(regulation of cellular response to stress)、腺體發(fā)育(gland development)等。CC主要包括受體復(fù)合物(receptor complex)、細(xì)胞頂端部分(apical part of cell)、膜側(cè)(side of membrane)、蛋白激酶復(fù)合物(protein kinase complex)、細(xì)胞前緣(cell leading edge)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)(perinuclear region of cytoplasm)、細(xì)胞間連接(cell-cell junction)、膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)(cytoplasmic side of membrane)等。

圖4 GO富集分析和KEGG富集分析氣泡圖(排名前10)Fig.4 Bubbles of GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis(top 10)

圖5 GO富集分析柱狀圖和KEGG帶色彩梯度條形圖(排名10)Fig.5 Histogram of GO enrichment analysis and bar graph of KEGG band color gradient(top 10)

2.6 分子對(duì)接

根據(jù)靶點(diǎn)和相關(guān)成分的重要性，選擇AKT1、SRC、EGFR三個(gè)核心靶點(diǎn)與Quercetin、Genistein、Ellagic acid三個(gè)相對(duì)應(yīng)核心成分，根據(jù)化合物-靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表2。

表2 分子對(duì)接結(jié)果Tab.2 Molecular docking results

3 討論

本研究通過采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探索高粱泡葉對(duì)治療糖尿病可行性分析。通過在前期本課題對(duì)高粱泡葉采用液質(zhì)聯(lián)用對(duì)其提取物進(jìn)行化學(xué)成分分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)查閱高粱泡有葉的化學(xué)成分，通過數(shù)據(jù)庫篩選得到12個(gè)符合化合物，通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫和Similarity ensemble approach(SEA)數(shù)據(jù)庫檢索高粱泡葉活性成分相關(guān)靶點(diǎn)，共得到靶點(diǎn)169個(gè)。通過OMIM、genecard數(shù)據(jù)庫，以“type 2 diabetes mellitus ”關(guān)鍵詞共檢索得到2026符合條件的相關(guān)靶點(diǎn)。

通過Cytoscape 軟件的“cytoHubba”插件對(duì)靶點(diǎn)度值進(jìn)行計(jì)算，篩選得到AKT1、EGFR、SRC、ESR1、ERBB2、MMP9、CCND1、MMP2等核心靶點(diǎn)基因和鞣花酸、槲皮素、山奈酚、染料木素等核心活性成分。研究表明，可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路，保護(hù)大鼠免受糖尿病所致的腎臟損傷[6]，糖尿病患者的再生受損、焦慮情緒等表現(xiàn)與ErbB2受體的功能減弱有關(guān)[7]。鞣花酸通過糾正糖尿病小鼠胰島素在脂肪組織中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙和促進(jìn)肝臟自噬流，從而達(dá)到改善糖尿病小鼠癥狀[8-9]，另外有研究，染料木素對(duì)糖尿病大鼠的骨膜反應(yīng)具有很好的改善作用[10]。

GO富集分析表明，高粱泡通過蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、成纖維細(xì)胞增殖的正調(diào)控、胰島素結(jié)合、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子激活受體活性等多種生物學(xué)過程來抵抗糖尿病。

圖6 分子對(duì)接結(jié)果Fig.6 Molecular docking results

KEGG富集分析結(jié)果表明：高粱泡葉治療Ⅱ型糖尿病主要涉及癌癥的途徑(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、ErbB信號(hào)通路等。研究表明，通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路可以減輕糖尿病腎病引起的炎癥和氧化應(yīng)激[11]。ErbB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過對(duì)TGF-β1的表達(dá)抑制，從而能間接達(dá)到抑制糖尿病心肌病大鼠心肌組織纖維化的作用[12]。這些結(jié)果可能為進(jìn)一步研究高粱泡葉治療Ⅱ型糖尿病提供相應(yīng)理論基礎(chǔ)，后期研究我們還將進(jìn)行高粱泡葉治療Ⅱ型糖尿病的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為高粱泡葉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供更有力的依據(jù)。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)和相應(yīng)化合物之間結(jié)合自由能≤-1.2 kcal/mol，對(duì)接效果良好，表明核心靶點(diǎn)與其相對(duì)應(yīng)的高粱泡葉化學(xué)成分有較強(qiáng)的親和關(guān)系，本研究中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果具有一定的合理性。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，高粱泡葉具有治療Ⅱ型糖尿病的可能性。為證明此結(jié)果，后期將會(huì)進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。