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        泛素調(diào)控蛋白A20對慢性乙肝患者單核細胞活性的影響①

        2023-01-17 11:55:56王佳斌李英蘭張希功馬燕春青海省人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科西寧810007
        中國免疫學(xué)雜志 2022年20期
        關(guān)鍵詞:乙肝患者單核細胞緩沖液

        王佳斌 李英蘭 張希功 馬燕春(青海省人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,西寧 810007)

        乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)可誘導(dǎo)機體免疫耐受及多種免疫細胞(包括T細胞、B細胞、單核細胞、自然殺傷細胞等)功能衰竭,機體無法清除病毒,導(dǎo)致持續(xù)感染和慢性化[1]。新型泛素調(diào)控蛋白A20也稱為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3,是一種重要的免疫抑制因子,在腫瘤、感染性疾病、自身免疫病中均發(fā)揮重要的抗炎和免疫調(diào)控功能[2-4]。A20在慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染中表達升高,對樹突狀細胞和單核/巨噬細胞功能發(fā)揮抑制作用[5-6]。但有關(guān)A20在慢性乙肝中的免疫調(diào)控作用鮮有報道。本研究主要觀察了A20在慢性乙型肝炎患者中的表達及其對CD14+單核細胞功能的調(diào)控作用。

        1 資料與方法

        1.1資料

        1.1.1一般資料 選取2019年3月至2019年9月于青海省人民醫(yī)院就診的慢性乙型肝炎患者47例作為HBV組,其中男性26例,女性21例,年齡23~44歲,平均(31.9±8.7)歲,所有患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[7]診斷標準,納入標準:①年齡>18歲且<65歲;②HBsAg陽性超過6個月且HBV DNA陽性;③入組前從未接受過抗病毒和/或免疫調(diào)節(jié)治療;④獲得患者知情同意。排除標準:①合并其他嗜肝病毒、人類免疫缺陷病毒感染;②合并自身免疫性疾??;③合并惡性腫瘤;④合并妊娠。所有患者均為HBeAg陽性,HBV DNA(6.22±1.08)log10拷貝/ml,ALT水平均高于2倍正常上限,平均(178.2±56.1)U/L。選取健康志愿者26例作為健康對照組,其中男性14例,女性12例,年齡26~47歲,平均(33.6±9.1)歲,ALT水平(20.4±6.8)U/L。本研究方案通過青海省人民醫(yī)院倫理委員會批準,入組患者和健康志愿者均簽署知情同意書。

        1.1.2主要儀器與試劑FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司);ABI7500實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司);微孔讀板儀(美國BioRad公司);Ficoll人淋巴細胞分離液(北京索萊寶公司);CD14 MicroBeads(貨號:130-050-201)、CD4 Micro-Beads(貨號:130-045-101,德國美天旎公司);A20小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA,貨號:sc-37655)、對照siRNA(貨號:sc-37007)、A20-PE(美國Santa Cruz公司);CD14-FITC、CD4-FITC、IFN-γ-PE、IL-17-APC(美國eBioscience公司);Trizol試劑(美國Invitrogen公司);PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenPremix Ex TaqⅡ(北京TaKaRa公司);IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、單 核 細 胞 趨 化 蛋 白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)ELISA檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)細胞毒性檢測試劑盒(武漢碧云天公司)。

        1.2方法

        1.2.1CD14+單核細胞和CD4+T細胞的純化 采集入組患者和健康志愿者的外周靜脈血30 ml,EDTA抗凝,采用Ficoll人淋巴細胞分離液、密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。分離的PBMC使用CD14 Micro-Beads純化CD14+單核細胞。取4×107個PBMCs,以300 r/min離心10 min,棄上清,加入320μl緩沖液重懸細胞,再加入80μl CD14 MicroBeads,混勻后4℃孵育15 min,加入4 ml緩沖液洗滌,300 r/min離心棄上清,加入500μl緩沖液重懸細胞。將分離柱置于MACS分離架,使用4 ml緩沖液浸潤分離柱,加入上述標記的細胞懸液,使細胞懸液穿過分離柱,使用2 ml緩沖液洗滌2次,收集穿過分離柱的細胞,即為去除單核細胞的PBMC。將分離柱從MACS分離架上取下,加入2 ml緩沖液,使用注射器活塞快速推注,收集的細胞即為CD14+單核細胞,計數(shù)備用。去除單核細胞的PBMC使用CD4 MicroBeads純化為CD4+T細胞。取3×107個去除單核細胞的PBMCs,300 r/min離心棄上清,加入240μl緩沖液重懸細胞,再加入60 μl CD4 MicroBeads,混勻后4℃孵育15 min,加入3 ml緩沖液洗滌,300 r/min離心10 min,棄上清,加入500μl緩沖液重懸細胞。將分離柱置于MACS分離架,使用3 ml緩沖液浸潤分離柱,加入上述標記的細胞懸液,使細胞懸液穿過分離柱,2 ml緩沖液洗滌2次,將分離柱從MACS分離架上取下,加入2 ml緩沖液,采用注射器活塞快速推注,收集細胞即為CD4+T細胞,計數(shù)備用。

        1.2.2A20 siRNA轉(zhuǎn)染 取1×105個單核細胞,加入2 ml RPMI1640培養(yǎng)液+10%胎牛血清于6孔板中培養(yǎng),將2 μl siRNA雙鏈體溶于100 μl siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液(A溶液),將2μl siRNA轉(zhuǎn)染試劑溶于100μl siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液(B溶液),將A溶液和B溶液混合后室溫靜置30 min,采用2 ml siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液洗滌細胞,加入800μl siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液和200μl A+B混合溶液,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h,然后加入RPMI1640培養(yǎng)液+20%胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

        1.2.3細胞培養(yǎng) ①2.5×104個轉(zhuǎn)染后的單核細胞與1×105個HepG2.2.15細胞共培養(yǎng),培養(yǎng)液中加入1×脂多糖,培養(yǎng)24 h后收集上清;②2.5×104個轉(zhuǎn)染后的單核細胞與5×104個自體CD4+T細胞共培養(yǎng),培養(yǎng)液中加入1×脂多糖和抗CD3/CD28(1 μg/ml),在培養(yǎng)的最后6 h加入佛波酯(50 ng/ml)、伊烏諾霉素(1 μg/ml)和布雷菲德菌素A(10 μg/ml),培養(yǎng)24 h后收集細胞。

        1.2.4流式細胞術(shù)檢測A20表達及IFN-γ、IL-17分泌 取分離的PBMC,加入CD14-FITC進行表面染色,洗滌后加入100 μl固定破膜液A,室溫孵育15 min,加入3 ml流式染色緩沖液,300 r/min離心5 min,棄上清,加入100μl固定破膜液B和A20-PE,室溫避光孵育15 min,洗滌后使用FACS Calibur流式細胞儀分析。取單核細胞和CD4+T細胞共培養(yǎng)的細胞,加入CD4-FITC進行表面染色,洗滌后加入100μl固定破膜液A,室溫孵育15 min,加入3 ml流式染色緩沖液,300 r/min離心5 min,棄上清,加入100 μl固定破膜液B和IFN-γ-PE、IL-17-APC,室溫避光孵育15 min,洗滌后使用FACS Calibur流式細胞儀分析。使用FlowJo V10軟件分析流式結(jié)果。

        1.2.5實時定量PCR檢測A20、Fas配體(Fas ligand,F(xiàn)asL)和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)mRNA相對表達量Trizol試劑提取單核細胞中的總RNA。取1μg總RNA,以PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:5×PrimeScript Buffer 2μl、PrimeScript RT Enzyme MixⅠ

        0.5μl、Oligo dT Primer(50μmol/L)0.5μl、Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μl、總RNA 1 μg、加 入RNase Free dH2O至10 μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37℃15 min,85℃5 s。使用TB GreenPremix Ex TaqⅡ進 行 實 時 定 量PCR反 應(yīng),PCR反 應(yīng) 體 系:2×TB GreenPremix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)10 μl、PCR正向引物(10 μmol/L)0.8 μl、PCR反向引物(10μmol/L)0.8μl、50×ROX ReferenceDyeⅡ0.4μl、RT反應(yīng)液(cDNA溶液)2μl、滅菌水6μl,總體積為20μl。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃30 s,1個循環(huán),PCR反應(yīng),95℃5 s、60℃30 s,40個循環(huán)。使用ABI7500實時定量PCR儀進行PCR反應(yīng),引物序列參考文獻[5,8]合成,采用2-ΔΔCt法對目的基因進行半定量分析。

        1.2.6ELISA法檢測細胞因子分泌 采用ELISA雙抗體夾心法檢測細胞因子水平。將樣本和標準品以100 μl/孔加入相應(yīng)孔,采用封板膜封住反應(yīng)孔,室溫孵育120 min,使用洗滌液(含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液,pH=7.4)洗板5次。每孔中加入100μl生物素化抗體,封板膜封住反應(yīng)孔,室溫孵育60 min,洗板5次。每孔中加入100 μl辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素,封板膜封住反應(yīng)孔,室溫孵育20 min,洗板5次。每孔加入100 μl顯色劑TMB溶液,封板膜封住反應(yīng)孔,室溫孵育20 min。每孔中加入50 μl終止液,混勻后立即在450 nm波長下測定OD值,繪制標準曲線,計算待測樣本濃度。

        1.2.7HepG2.2.15細胞死亡比例檢測 使用LDH細胞毒性檢測試劑盒檢測培養(yǎng)上清中LDH水平。以HepG2.2.15細胞培養(yǎng)液中LDH水平為“低水平對照”,以Triton X-100處理的HepG2.2.15細胞培養(yǎng)液中LDH水平為“高水平對照”,死亡細胞比例(%)=(樣本LDH值-低水平對照)/(高水平對照-低水平對照)×100%。

        1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以±s表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析、SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1慢性乙肝患者外周血CD14+單核細胞中A20的變化 根據(jù)FCS和SSC對單核細胞圈門,CD14+單核細胞中A20陽性細胞比例和平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)的典型流式檢測圖如圖1。慢性乙肝患者外周血CD14+A20+細胞比例、CD14+單核細胞中A20 MFI及A20 mRNA相對表達高于健康對照者,見表1。

        表1 健康對照者和慢性乙肝患者CD14+單核細胞中A20表達比較Tab.1 Comparison of A20 expression in CD14+monocytes of healthy controls and chronic hepatitis B patients

        圖1 健康對照者和慢性乙肝患者CD14+單核細胞中A20細胞比例和MFI典型流式分析圖Fig.1 Representative flow cytometric plots of percentage of A20 cell and MFI of CD14+monocytes of healthy controls and chronic hepatitis B patients

        2.2抑制A20對慢性乙肝患者CD14+單核細胞殺傷功能的影響A20 siRNA轉(zhuǎn)染所有入組慢性乙型肝炎患者純化的CD14+單核細胞后,其分泌炎癥細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1水平均高于未轉(zhuǎn)染細胞和對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞(P均<0.05),上述細胞因子在未轉(zhuǎn)染細胞和對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。CD14+單核細胞中FasL和TRAIL mRNA相對表達量在未轉(zhuǎn)染、對照siRNA轉(zhuǎn)染和A20 siRNA轉(zhuǎn)染細胞間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。CD14+單核細胞與HepG2.2.15細 胞 共 培 養(yǎng) 后,A20 siRNA轉(zhuǎn) 染 的CD14+單核細胞誘導(dǎo)靶細胞死亡比例高于未轉(zhuǎn)染細胞和對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞(P均<0.05),但靶細胞死亡比例在未轉(zhuǎn)染細胞和對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.152)。見表2。

        表2 抑制A20對慢性乙型肝炎患者CD14+單核細胞殺傷功能的影響(±s,n=47)Tab.2 Effect of inhibiting A20 on killing function of CD14+monocytes in patients with chronic hepatitis B(±s,n=47)

        表2 抑制A20對慢性乙型肝炎患者CD14+單核細胞殺傷功能的影響(±s,n=47)Tab.2 Effect of inhibiting A20 on killing function of CD14+monocytes in patients with chronic hepatitis B(±s,n=47)

        Note:Compared with untransfected and control siRNA transfected groups,1)P<0.05.

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        2.3抑制A20對慢性乙肝患者CD14+單核細胞誘導(dǎo)CD4+T細胞活化的影響 慢性乙型肝炎患者純化的CD14+單核細胞與CD4+T細胞共培養(yǎng)后,CD4+T細胞分泌IFN-γ和IL-17的典型流式散點圖如圖2。A20 siRNA轉(zhuǎn)染的CD14+單核細胞誘導(dǎo)CD4+T細胞分泌IFN-γ和IL-17的比例高于未轉(zhuǎn)染和對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞(P均<0.05),但IFN-γ+CD4+和IL-17+CD4+細胞比例在未轉(zhuǎn)染和對照siRNA轉(zhuǎn)染間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

        圖2 未轉(zhuǎn)染、對照siRNA轉(zhuǎn)染和A20 siRNA轉(zhuǎn)染慢性乙肝患者CD14+單核細胞誘導(dǎo)CD4+T細胞分泌IFN-γ和IL-17的典型流式散點圖Fig.2 Representative flow cytometric plots of effect of untransfected,control siRNA transfected and A20 siRNA transfected on CD14+monocytes in HBV patients inducing CD4+T cells to secrete IFN-γ and IL-17 cytokines

        表3 抑制A20對慢性乙型肝炎患者CD14+單核細胞誘導(dǎo)CD4+T細胞活化的影響(±s,n=47,%)Tab.3 Effect of inhibiting A20 on CD14+monocyte-induced CD4+T cell activation in chronic hepatitis B patients(±s,n=47,%)

        表3 抑制A20對慢性乙型肝炎患者CD14+單核細胞誘導(dǎo)CD4+T細胞活化的影響(±s,n=47,%)Tab.3 Effect of inhibiting A20 on CD14+monocyte-induced CD4+T cell activation in chronic hepatitis B patients(±s,n=47,%)

        Note:Compared with untransfected and control siRNA transfected groups,1)P<0.05.

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        3 討論

        泛素調(diào)控蛋白A20主要表達于多種免疫器官和免疫細胞,其主要作用是一種去泛素化酶,由于蛋白泛素化在固有免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要作用,主要功能是調(diào)控免疫耐受、免疫細胞分化、細胞因子和Toll樣受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,A20的主要功能就是發(fā)揮去泛素化作用,增加IκB激酶活性,延長NF-κB活化,從而發(fā)揮負性免疫調(diào)控作用[9]。A20在病毒感染中亦發(fā)揮重要調(diào)控作用。甲型流感病毒NS1蛋白可誘導(dǎo)A20表達升高,通過抑制IFN介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答促進病毒復(fù)制,而抑制支氣管上皮細胞中A20表達則可增強細胞毒性T細胞功能和MCP-1表達,從而有效控制甲型流感病毒感染[10-11]。牛病毒性腹瀉病毒-1可通過增加A20表達抑制NF-κB活性,從而抑制IL-8的表達和活化[12]。HCV感染亦可誘導(dǎo)A20表達水平升高,抑制樹突狀細胞和單核/巨噬細胞活性,促進病毒感染慢性化[5-6,13]。既往研究發(fā)現(xiàn),慢性乙肝患者及乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭患者血清和PBMC中A20水平均顯著升高,與機體的免疫狀態(tài)、疾病預(yù)后均密切相關(guān)[14-18]。本研究發(fā)現(xiàn),慢性乙肝患者CD14+單核細胞中A20水平升高,雖未發(fā)現(xiàn)A20與病毒學(xué)和生化學(xué)指標的顯著相關(guān)性,結(jié)合既往研究結(jié)果,提示A20參與慢性乙肝發(fā)病,但其對慢性乙肝患者CD14+單核細胞功能的調(diào)控仍有待進一步研究。

        去泛素化酶在調(diào)控固有免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,而A20是第一個被發(fā)現(xiàn)對固有免疫具有調(diào)控作用的去泛素化酶。CD14+單核細胞是重要的固有免疫細胞,主要發(fā)揮細胞毒性作用、間接抗原提呈作用和共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞[19-20]。CD14+單核細胞主要通過2條途徑發(fā)揮細胞毒性作用:一條途徑是分泌可溶性細胞因子,誘導(dǎo)靶細胞壞死和凋亡;另一條途徑是依賴細胞直接接觸,通過FasL和TRAIL介導(dǎo)的信號通路介導(dǎo)細胞凋亡[8,19]。本研究發(fā)現(xiàn),抑制慢性乙肝患者CD14+單核細胞中A20表達對FasL和TRAIL mRNA表達無顯著影響,但可增加多種炎癥細胞因子的分泌,同時,CD14+單核細胞誘導(dǎo)HepG2.2.15細胞死亡亦增加。提示A20并不影響慢性乙肝患者CD14+單核細胞中的促凋亡配體表達,而主要通過抑制可溶性細胞因子分泌,抑制其細胞毒性作用。另一方面,多個研究均發(fā)現(xiàn)CD14+單核細胞可誘導(dǎo)CD4+T細胞分化和激活,多種因素(如:細胞因子、Notch信號通路等)均參與了CD14+單核細胞抗原提呈功能的調(diào)控[8,21-22]。本研究發(fā)現(xiàn),抑制慢性乙肝患者CD14+單核細胞中A20表達可促進其誘導(dǎo)CD4+T細胞向Th1型(IFN-γ+CD4+)和Th17型(IL-17+CD4+)細胞的活化。提示A20可抑制慢性乙肝患者CD14+單核細胞對CD4+T細胞的活化作用,進而抑制固有免疫對適應(yīng)性免疫的調(diào)控功能。但本研究入組患者例數(shù)相對較少,且僅觀察到A20可調(diào)控慢性乙肝患者CD14+單核細胞的功能,但對其中的機制研究較少。有關(guān)A20對慢性乙肝CD14+單核細胞功能調(diào)控作用的機制還有待擴大樣本并進行動物實驗進行證實。

        綜上所述,慢性乙肝患者CD14+單核細胞中高表達的A20有抑制細胞毒性及CD4+T細胞活化的作用,發(fā)揮負性免疫調(diào)控作用,可能與導(dǎo)致HBV感染慢性化相關(guān)。

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