王佳斌 李英蘭 張希功 馬燕春（青海省人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，西寧 810007）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）可誘導(dǎo)機體免疫耐受及多種免疫細胞（包括T細胞、B細胞、單核細胞、自然殺傷細胞等）功能衰竭，機體無法清除病毒，導(dǎo)致持續(xù)感染和慢性化［1］。新型泛素調(diào)控蛋白A20也稱為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3，是一種重要的免疫抑制因子，在腫瘤、感染性疾病、自身免疫病中均發(fā)揮重要的抗炎和免疫調(diào)控功能［2-4］。A20在慢性丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染中表達升高，對樹突狀細胞和單核/巨噬細胞功能發(fā)揮抑制作用［5-6］。但有關(guān)A20在慢性乙肝中的免疫調(diào)控作用鮮有報道。本研究主要觀察了A20在慢性乙型肝炎患者中的表達及其對CD14+單核細胞功能的調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2019年3月至2019年9月于青海省人民醫(yī)院就診的慢性乙型肝炎患者47例作為HBV組，其中男性26例，女性21例，年齡23～44歲，平均（31.9±8.7）歲，所有患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）》［7］診斷標準，納入標準：①年齡＞18歲且＜65歲；②HBsAg陽性超過6個月且HBV DNA陽性；③入組前從未接受過抗病毒和/或免疫調(diào)節(jié)治療；④獲得患者知情同意。排除標準：①合并其他嗜肝病毒、人類免疫缺陷病毒感染；②合并自身免疫性疾??；③合并惡性腫瘤；④合并妊娠。所有患者均為HBeAg陽性，HBV DNA（6.22±1.08）log10拷貝/ml，ALT水平均高于2倍正常上限，平均（178.2±56.1）U/L。選取健康志愿者26例作為健康對照組，其中男性14例，女性12例，年齡26～47歲，平均（33.6±9.1）歲，ALT水平（20.4±6.8）U/L。本研究方案通過青海省人民醫(yī)院倫理委員會批準，入組患者和健康志愿者均簽署知情同意書。

1.1.2主要儀器與試劑FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；ABI7500實時定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；微孔讀板儀（美國BioRad公司）；Ficoll人淋巴細胞分離液（北京索萊寶公司）；CD14 MicroBeads（貨號：130-050-201）、CD4 Micro-Beads（貨號：130-045-101，德國美天旎公司）；A20小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA，貨號：sc-37655）、對照siRNA（貨號：sc-37007）、A20-PE（美國Santa Cruz公司）；CD14-FITC、CD4-FITC、IFN-γ-PE、IL-17-APC（美國eBioscience公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenPremix Ex TaqⅡ（北京TaKaRa公司）；IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、單 核 細 胞 趨 化 蛋 白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）ELISA檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性檢測試劑盒（武漢碧云天公司）。

1.2方法

1.2.1CD14+單核細胞和CD4+T細胞的純化 采集入組患者和健康志愿者的外周靜脈血30 ml，EDTA抗凝，采用Ficoll人淋巴細胞分離液、密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。分離的PBMC使用CD14 Micro-Beads純化CD14+單核細胞。取4×107個PBMCs，以300 r/min離心10 min，棄上清，加入320μl緩沖液重懸細胞，再加入80μl CD14 MicroBeads，混勻后4℃孵育15 min，加入4 ml緩沖液洗滌，300 r/min離心棄上清，加入500μl緩沖液重懸細胞。將分離柱置于MACS分離架，使用4 ml緩沖液浸潤分離柱，加入上述標記的細胞懸液，使細胞懸液穿過分離柱，使用2 ml緩沖液洗滌2次，收集穿過分離柱的細胞，即為去除單核細胞的PBMC。將分離柱從MACS分離架上取下，加入2 ml緩沖液，使用注射器活塞快速推注，收集的細胞即為CD14+單核細胞，計數(shù)備用。去除單核細胞的PBMC使用CD4 MicroBeads純化為CD4+T細胞。取3×107個去除單核細胞的PBMCs，300 r/min離心棄上清，加入240μl緩沖液重懸細胞，再加入60 μl CD4 MicroBeads，混勻后4℃孵育15 min，加入3 ml緩沖液洗滌，300 r/min離心10 min，棄上清，加入500μl緩沖液重懸細胞。將分離柱置于MACS分離架，使用3 ml緩沖液浸潤分離柱，加入上述標記的細胞懸液，使細胞懸液穿過分離柱，2 ml緩沖液洗滌2次，將分離柱從MACS分離架上取下，加入2 ml緩沖液，采用注射器活塞快速推注，收集細胞即為CD4+T細胞，計數(shù)備用。

1.2.2A20 siRNA轉(zhuǎn)染 取1×105個單核細胞，加入2 ml RPMI1640培養(yǎng)液+10%胎牛血清于6孔板中培養(yǎng)，將2 μl siRNA雙鏈體溶于100 μl siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液（A溶液），將2μl siRNA轉(zhuǎn)染試劑溶于100μl siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液（B溶液），將A溶液和B溶液混合后室溫靜置30 min，采用2 ml siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液洗滌細胞，加入800μl siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液和200μl A+B混合溶液，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h，然后加入RPMI1640培養(yǎng)液+20%胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3細胞培養(yǎng) ①2.5×104個轉(zhuǎn)染后的單核細胞與1×105個HepG2.2.15細胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入1×脂多糖，培養(yǎng)24 h后收集上清；②2.5×104個轉(zhuǎn)染后的單核細胞與5×104個自體CD4+T細胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入1×脂多糖和抗CD3/CD28（1 μg/ml），在培養(yǎng)的最后6 h加入佛波酯（50 ng/ml）、伊烏諾霉素（1 μg/ml）和布雷菲德菌素A（10 μg/ml），培養(yǎng)24 h后收集細胞。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測A20表達及IFN-γ、IL-17分泌 取分離的PBMC，加入CD14-FITC進行表面染色，洗滌后加入100 μl固定破膜液A，室溫孵育15 min，加入3 ml流式染色緩沖液，300 r/min離心5 min，棄上清，加入100μl固定破膜液B和A20-PE，室溫避光孵育15 min，洗滌后使用FACS Calibur流式細胞儀分析。取單核細胞和CD4+T細胞共培養(yǎng)的細胞，加入CD4-FITC進行表面染色，洗滌后加入100μl固定破膜液A，室溫孵育15 min，加入3 ml流式染色緩沖液，300 r/min離心5 min，棄上清，加入100 μl固定破膜液B和IFN-γ-PE、IL-17-APC，室溫避光孵育15 min，洗滌后使用FACS Calibur流式細胞儀分析。使用FlowJo V10軟件分析流式結(jié)果。

1.2.5實時定量PCR檢測A20、Fas配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）mRNA相對表達量Trizol試劑提取單核細胞中的總RNA。取1μg總RNA，以PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×PrimeScript Buffer 2μl、PrimeScript RT Enzyme MixⅠ

0.5μl、Oligo dT Primer（50μmol/L）0.5μl、Random 6 mers（100 μmol/L）0.5 μl、總RNA 1 μg、加 入RNase Free dH2O至10 μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃5 s。使用TB GreenPremix Ex TaqⅡ進 行 實 時 定 量PCR反 應(yīng)，PCR反 應(yīng) 體 系：2×TB GreenPremix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）10 μl、PCR正向引物（10 μmol/L）0.8 μl、PCR反向引物（10μmol/L）0.8μl、50×ROX ReferenceDyeⅡ0.4μl、RT反應(yīng)液（cDNA溶液）2μl、滅菌水6μl，總體積為20μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30 s，1個循環(huán)，PCR反應(yīng)，95℃5 s、60℃30 s，40個循環(huán)。使用ABI7500實時定量PCR儀進行PCR反應(yīng)，引物序列參考文獻［5，8］合成，采用2-ΔΔCt法對目的基因進行半定量分析。

1.2.6ELISA法檢測細胞因子分泌 采用ELISA雙抗體夾心法檢測細胞因子水平。將樣本和標準品以100 μl/孔加入相應(yīng)孔，采用封板膜封住反應(yīng)孔，室溫孵育120 min，使用洗滌液（含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液，pH=7.4）洗板5次。每孔中加入100μl生物素化抗體，封板膜封住反應(yīng)孔，室溫孵育60 min，洗板5次。每孔中加入100 μl辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，封板膜封住反應(yīng)孔，室溫孵育20 min，洗板5次。每孔加入100 μl顯色劑TMB溶液，封板膜封住反應(yīng)孔，室溫孵育20 min。每孔中加入50 μl終止液，混勻后立即在450 nm波長下測定OD值，繪制標準曲線，計算待測樣本濃度。

1.2.7HepG2.2.15細胞死亡比例檢測 使用LDH細胞毒性檢測試劑盒檢測培養(yǎng)上清中LDH水平。以HepG2.2.15細胞培養(yǎng)液中LDH水平為“低水平對照”，以Triton X-100處理的HepG2.2.15細胞培養(yǎng)液中LDH水平為“高水平對照”，死亡細胞比例（%）=（樣本LDH值-低水平對照）/（高水平對照-低水平對照）×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析、SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1慢性乙肝患者外周血CD14+單核細胞中A20的變化 根據(jù)FCS和SSC對單核細胞圈門，CD14+單核細胞中A20陽性細胞比例和平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）的典型流式檢測圖如圖1。慢性乙肝患者外周血CD14+A20+細胞比例、CD14+單核細胞中A20 MFI及A20 mRNA相對表達高于健康對照者，見表1。

表1 健康對照者和慢性乙肝患者CD14+單核細胞中A20表達比較Tab.1 Comparison of A20 expression in CD14+monocytes of healthy controls and chronic hepatitis B patients

圖1 健康對照者和慢性乙肝患者CD14+單核細胞中A20細胞比例和MFI典型流式分析圖Fig.1 Representative flow cytometric plots of percentage of A20 cell and MFI of CD14+monocytes of healthy controls and chronic hepatitis B patients

2.2抑制A20對慢性乙肝患者CD14+單核細胞殺傷功能的影響A20 siRNA轉(zhuǎn)染所有入組慢性乙型肝炎患者純化的CD14+單核細胞后，其分泌炎癥細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1水平均高于未轉(zhuǎn)染細胞和對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞（P均＜0.05），上述細胞因子在未轉(zhuǎn)染細胞和對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。CD14+單核細胞中FasL和TRAIL mRNA相對表達量在未轉(zhuǎn)染、對照siRNA轉(zhuǎn)染和A20 siRNA轉(zhuǎn)染細胞間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。CD14+單核細胞與HepG2.2.15細 胞 共 培 養(yǎng) 后，A20 siRNA轉(zhuǎn) 染 的CD14+單核細胞誘導(dǎo)靶細胞死亡比例高于未轉(zhuǎn)染細胞和對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞（P均＜0.05），但靶細胞死亡比例在未轉(zhuǎn)染細胞和對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.152）。見表2。

表2 抑制A20對慢性乙型肝炎患者CD14+單核細胞殺傷功能的影響（±s，n=47）Tab.2 Effect of inhibiting A20 on killing function of CD14+monocytes in patients with chronic hepatitis B（±s，n=47）

表2 抑制A20對慢性乙型肝炎患者CD14+單核細胞殺傷功能的影響（±s，n=47）Tab.2 Effect of inhibiting A20 on killing function of CD14+monocytes in patients with chronic hepatitis B（±s，n=47）

Note：Compared with untransfected and control siRNA transfected groups，1）P＜0.05.

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2.3抑制A20對慢性乙肝患者CD14+單核細胞誘導(dǎo)CD4+T細胞活化的影響 慢性乙型肝炎患者純化的CD14+單核細胞與CD4+T細胞共培養(yǎng)后，CD4+T細胞分泌IFN-γ和IL-17的典型流式散點圖如圖2。A20 siRNA轉(zhuǎn)染的CD14+單核細胞誘導(dǎo)CD4+T細胞分泌IFN-γ和IL-17的比例高于未轉(zhuǎn)染和對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞（P均＜0.05），但IFN-γ+CD4+和IL-17+CD4+細胞比例在未轉(zhuǎn)染和對照siRNA轉(zhuǎn)染間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表3。

圖2 未轉(zhuǎn)染、對照siRNA轉(zhuǎn)染和A20 siRNA轉(zhuǎn)染慢性乙肝患者CD14+單核細胞誘導(dǎo)CD4+T細胞分泌IFN-γ和IL-17的典型流式散點圖Fig.2 Representative flow cytometric plots of effect of untransfected，control siRNA transfected and A20 siRNA transfected on CD14+monocytes in HBV patients inducing CD4+T cells to secrete IFN-γ and IL-17 cytokines

表3 抑制A20對慢性乙型肝炎患者CD14+單核細胞誘導(dǎo)CD4+T細胞活化的影響（±s，n=47，%）Tab.3 Effect of inhibiting A20 on CD14+monocyte-induced CD4+T cell activation in chronic hepatitis B patients（±s，n=47，%）

表3 抑制A20對慢性乙型肝炎患者CD14+單核細胞誘導(dǎo)CD4+T細胞活化的影響（±s，n=47，%）Tab.3 Effect of inhibiting A20 on CD14+monocyte-induced CD4+T cell activation in chronic hepatitis B patients（±s，n=47，%）

Note：Compared with untransfected and control siRNA transfected groups，1）P＜0.05.

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3 討論

泛素調(diào)控蛋白A20主要表達于多種免疫器官和免疫細胞，其主要作用是一種去泛素化酶，由于蛋白泛素化在固有免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要作用，主要功能是調(diào)控免疫耐受、免疫細胞分化、細胞因子和Toll樣受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，A20的主要功能就是發(fā)揮去泛素化作用，增加IκB激酶活性，延長NF-κB活化，從而發(fā)揮負性免疫調(diào)控作用［9］。A20在病毒感染中亦發(fā)揮重要調(diào)控作用。甲型流感病毒NS1蛋白可誘導(dǎo)A20表達升高，通過抑制IFN介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答促進病毒復(fù)制，而抑制支氣管上皮細胞中A20表達則可增強細胞毒性T細胞功能和MCP-1表達，從而有效控制甲型流感病毒感染［10-11］。牛病毒性腹瀉病毒-1可通過增加A20表達抑制NF-κB活性，從而抑制IL-8的表達和活化［12］。HCV感染亦可誘導(dǎo)A20表達水平升高，抑制樹突狀細胞和單核/巨噬細胞活性，促進病毒感染慢性化［5-6，13］。既往研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝患者及乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭患者血清和PBMC中A20水平均顯著升高，與機體的免疫狀態(tài)、疾病預(yù)后均密切相關(guān)［14-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝患者CD14+單核細胞中A20水平升高，雖未發(fā)現(xiàn)A20與病毒學(xué)和生化學(xué)指標的顯著相關(guān)性，結(jié)合既往研究結(jié)果，提示A20參與慢性乙肝發(fā)病，但其對慢性乙肝患者CD14+單核細胞功能的調(diào)控仍有待進一步研究。

去泛素化酶在調(diào)控固有免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而A20是第一個被發(fā)現(xiàn)對固有免疫具有調(diào)控作用的去泛素化酶。CD14+單核細胞是重要的固有免疫細胞，主要發(fā)揮細胞毒性作用、間接抗原提呈作用和共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞［19-20］。CD14+單核細胞主要通過2條途徑發(fā)揮細胞毒性作用：一條途徑是分泌可溶性細胞因子，誘導(dǎo)靶細胞壞死和凋亡；另一條途徑是依賴細胞直接接觸，通過FasL和TRAIL介導(dǎo)的信號通路介導(dǎo)細胞凋亡［8，19］。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制慢性乙肝患者CD14+單核細胞中A20表達對FasL和TRAIL mRNA表達無顯著影響，但可增加多種炎癥細胞因子的分泌，同時，CD14+單核細胞誘導(dǎo)HepG2.2.15細胞死亡亦增加。提示A20并不影響慢性乙肝患者CD14+單核細胞中的促凋亡配體表達，而主要通過抑制可溶性細胞因子分泌，抑制其細胞毒性作用。另一方面，多個研究均發(fā)現(xiàn)CD14+單核細胞可誘導(dǎo)CD4+T細胞分化和激活，多種因素（如：細胞因子、Notch信號通路等）均參與了CD14+單核細胞抗原提呈功能的調(diào)控［8，21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制慢性乙肝患者CD14+單核細胞中A20表達可促進其誘導(dǎo)CD4+T細胞向Th1型（IFN-γ+CD4+）和Th17型（IL-17+CD4+）細胞的活化。提示A20可抑制慢性乙肝患者CD14+單核細胞對CD4+T細胞的活化作用，進而抑制固有免疫對適應(yīng)性免疫的調(diào)控功能。但本研究入組患者例數(shù)相對較少，且僅觀察到A20可調(diào)控慢性乙肝患者CD14+單核細胞的功能，但對其中的機制研究較少。有關(guān)A20對慢性乙肝CD14+單核細胞功能調(diào)控作用的機制還有待擴大樣本并進行動物實驗進行證實。

綜上所述，慢性乙肝患者CD14+單核細胞中高表達的A20有抑制細胞毒性及CD4+T細胞活化的作用，發(fā)揮負性免疫調(diào)控作用，可能與導(dǎo)致HBV感染慢性化相關(guān)。