方遠鵬 韋建明 李云洲

（貴州大學農(nóng)學院植物病理教研室，貴州貴陽 550025）

番茄褐色皺果病毒（Tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV）屬于帚狀病毒科（Virgaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）［1-2］。2014年首次在以色列報道，目前該病毒已逐步擴散到包括我國在內(nèi)的多個國家［1-4］。2021年4月，ToBRFV被我國列為檢疫性病毒，嚴重威脅我國乃至世界番茄的安全生產(chǎn)［5］。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在植物細胞抵御病原侵染的免疫過程中發(fā)揮重要作用，其中，質(zhì)膜受體是植物響應(yīng)外界病原侵染進而產(chǎn)生免疫過程中的重要成分，如受體類蛋白（receptor-like proteins，RLPs）、細胞內(nèi)核綁定富亮氨酸重復(fù)蛋白（nucleotide-binding leucine-rich repeat proteins，NB-LRRs）［6-7］。利用細胞膜識別受體，植物可以識別細胞內(nèi)外的各種病原激發(fā)子。其中識別受體與病原物激發(fā)子的相互作用在植物葉片將介導(dǎo)植物細胞壞死或過敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR）導(dǎo)致的植物免疫反應(yīng)，從而促進植株對病原的抗性作用的形成［8］。

胞外信號通?？赏ㄟ^磷脂跨膜信號受體蛋白感知外界信號［9］，并在外界信號刺激下直接或間接激活磷脂酶，通過激活磷脂酶使第二信使分子大量橫向擴散，例如促進鈣離子（Ca2+）的大量增加。此外，受激活的磷酸肌醇特異性磷脂酶C（phosphati-dylinositol-specific phospholipase C，PI-PLC）可導(dǎo)致磷脂酰肌醇（4，5）-二磷 酸［phosphatidylinositol（4，5）-bisphosphate，PIP2］水解轉(zhuǎn)化為二?；视停╠iacyl-glycerol，DAG）和三磷酸肌醇（inositol trisphosphate，IP3）［10-12］。在動物細胞中發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇（4，5）-二磷酸（PIP2）是肌動蛋白（actin）組織和膜運輸?shù)年P(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可與多種蛋白質(zhì)相互結(jié)合。同時，PIP2濃度的降低及其反應(yīng)產(chǎn)物DAG和IP3濃度的增加均可影響信號分子的功能。其中，DAG可從細胞質(zhì)膜上對蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）進行激活，IP3則被釋放到細胞質(zhì)中并與細胞內(nèi)膜中的配體門控Ca2+通道（IP3受體）結(jié)合，從而釋放細胞儲存的Ca2+。而在植物中，PIP2分子可發(fā)揮與動物細胞在細胞骨架和細胞膜中的相似功能，但是PLC的反應(yīng)產(chǎn)物DAG和IP3的功能卻有所差異［10-12］。由于植物信號中包括PKC和IP3受體的等效物的大量缺乏，現(xiàn)有研究認為在植物中可能轉(zhuǎn)變?yōu)榱字幔╬hosphatidic acid，PA）和二?；视徒沽姿帷⒓〈剂姿幔↖P6）作為該信號系統(tǒng)的主要第二信使分子［13-17］。多種植物基因組可以編碼PI-PLC，并由PI-PLC的激活響應(yīng)外界多種信號（如高溫、低溫、鹽和滲透脅迫）或內(nèi)源信號物質(zhì)（如脫落酸）［13-20］。因此，探明植物磷脂酶C以及其信號功能存在重要的意義。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在植物響應(yīng)外界生物脅迫（如真菌、細菌、病毒）或非生物脅迫（如低溫、高溫、干旱以及鹽脅迫）過程中發(fā)揮著重要的作用［21-24］。而Ca2+、DAG、IP3是植物細胞中重要的信號分子，可被磷脂酶C進行直接或間接的調(diào)控。其中，植物磷脂酶C包括磷脂酰肌醇特異性結(jié)合的PI-PLC蛋白，其核心結(jié)構(gòu)為PLCXc域、PLCYc域和C2結(jié)構(gòu)域，可介導(dǎo)IP3/Ga2+及DAG/PA信號傳導(dǎo)；磷脂酰肌醇非特異性結(jié)合的NPC蛋白，其核心結(jié)構(gòu)為Phosphoesterase結(jié)構(gòu)域，可介導(dǎo)DAG/DGK（DAG kinase）信號傳導(dǎo)［25-27］。近期研究表明，植物磷脂酶C可直接介導(dǎo)植物-病原的抗性反應(yīng)，例如擬南芥（Arabidopsis thaliana）PLC基因可受丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的兩種效應(yīng)因子AvrRpm1和AvrRpt2誘導(dǎo)表達，其NPC基因也受丁香假單胞菌（P.syringae）所誘導(dǎo)［28］；番茄PI-PLC基因可以被葉霉病菌（Cladosporium fulvum）誘導(dǎo)表達［29］；水稻（Oryza sativa）PI-PLC1參 與 水 稻 黃 單 胞 菌（Xanthomonas oryzae）誘 導(dǎo)的防御反應(yīng)［30］。另外，DGK或IP3信號物質(zhì)可以間接介導(dǎo)植物天然免疫系統(tǒng)，例如水稻DGK下游基因-甘油二酯激酶基因1OsBIDK1的轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana benthamiana）可提高對煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的 抗 性［31］；擬南芥AtIPS2（myo-inositol 3-phosphate synthase）下調(diào)導(dǎo)致植株對TMV的抗性下降［32］。

目前兩種類型磷脂酶C基因家族已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［32］、水稻［33］、玉米（Zea mays）［34］、陸 地 棉（Gossypium hirsutum）、木 本 棉（Gossypium arboreum）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）［35］中分別鑒定，其中PI-PLC分別有9、4、5、12、9、9個，而NPC基因分別有6、5、4、9、6、6個。然而，關(guān)于番茄（Solanumlycopersicum）磷脂酶C基因的系統(tǒng)鑒定尚不完整［25］，并且其參與植株抗病毒防御反應(yīng)中的作用仍不明確。鑒于此，本研究鑒定番茄基因組中磷脂酶C基因，并分析不同類型磷脂酶C基因的理化性質(zhì)、進化特征以及表達特征。然后基于轉(zhuǎn)錄組進一步篩選鑒定PLC基因是否參與番茄植株抗ToBRFV防御反應(yīng)，以期為開展番茄磷脂酶C（PLC）抗病毒、育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 番茄PLC基因家族的鑒定

基于擬南芥磷脂酶C蛋白序列及隱馬科夫模型（C2結(jié)構(gòu)域PF00168或Phosphoesterase結(jié)構(gòu)域PF04185）采用EnsemblPlant（http：//plants.ensembl.org/index.html）和Sol Genomics Network（https：//solgenomics.net/）數(shù)據(jù)庫對番茄基因組進行Blast和Hmmer搜索［36］，所獲結(jié)果置于SMART和PFAM數(shù)據(jù)庫進行結(jié)構(gòu)域的確認，保留所有編碼蛋白具備典型結(jié)構(gòu)域的基因［37］?；诜鸦蚪M注釋文件獲得PLC基因的基本信息后利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）和PSORT（http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html）進行基礎(chǔ)理化性質(zhì)和亞細胞定位分析［38］。

1.2 番茄PLC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

擬南芥、水稻、玉米、大豆（Glycine max）和棉花序列分別來自TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）、水稻基因組數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）、EnsemblPlant、Phytozome基 因 組 數(shù) 據(jù) 庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）及Cottongen（https：//www.cottongen.org/）［32，34-35，39-40］。

根據(jù)各物種PLC基因家族蛋白序列通過Clustal W方法對齊，并利用MEGA 7.0構(gòu)建進化樹，建樹方法為相鄰連接法（Neighbor-Joining，NJ），bootstrap=1 000［41］，參照其與擬南芥PLC蛋白的同源性進行命名。多序列比對分析由DNAMAN5.0軟件完成。

1.3 保守基序的鑒定及蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用MEME（http：//meme.Nbcr.net/meme/intro.html）［42］、SOPMA 2.0（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.plpage=npsa-sopma.html）［43］對番茄PLC蛋白最保守的10個保守基序以及二級結(jié)構(gòu)進行分析。Swiss Model（https：//swissmodel.expasy.org/）及PyMOL軟件完成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測與繪圖。

1.4 基因結(jié)構(gòu)和進化特征分析

基于MC sanX軟件對番茄及其他植物PLC家族基因的種間共線性情況進行分析，并利用TBtools v1.064對其基因結(jié)構(gòu)和共線性關(guān)系進行繪制［44-45］。擬南芥、水稻、雷蒙德式棉花的基因組序列來自TAIR、EnsemblPlant、Cottongen網(wǎng)站。

1.5 PLC基因的組織表達與病毒侵染表達分析

基于TomExpress（http：//tomexpress.toulouse.inra.fr/）檢查番茄PLC基因在不同組織的表達特征［46］。ToBRFV來自貴州大學農(nóng)學院植物病理教研室番茄抗病抗逆研究課題組，ToBRFV接種試驗在封閉的植物培養(yǎng)間進行，嚴格執(zhí)行檢疫標準。處理組和對照組均進行3次重復(fù)，記為R1～R3，其中處理組和對照組分別摩擦接種ToBRFV、水后14 d待植株生長點顯現(xiàn)病癥，采集生長點病樣0.5 g送往上海美吉生物公司測序。PLC基因表達數(shù)據(jù)是來自本課題組所測轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，最終將數(shù)據(jù)在TBtools v1.064中繪制熱圖（采用log2與row scale標準化）。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄PLC基因家族鑒定及基本理化性質(zhì)分析

基于磷脂酶C的核心結(jié)構(gòu)域進行鑒定，共獲得7個PI-PLC和3個NPC。采用系統(tǒng)發(fā)育樹進行分類，結(jié)果顯示，番茄的3個NPC基因分別為擬南芥NPC1、NPC2、NPC6的直系同源基因。而PI-PLC基因可大致劃分為五大類，即PI-PLC1/3/8/9、PI-PLC2/7、PI-PLC6、PI-PLC4/5及單子葉PI-PLC分支，番茄的7個PI-PLC基因分別具備1、3、1、2、0個不同類別的PI-PLC基因（圖1）。同時，這些番茄PLC蛋白大多處于500 aa附近，部分PI-PLC蛋白達605 aa（SlPLC2a）和884 aa（SlPLC6 a）。分子量多在50～70 kDa之間，僅SlPLC6a超過100 kDa。在等電點方面，3個NPC蛋白分別為8.53、6.97、7.33，7個PI-PLC蛋白均處于5～8之間。

圖1 番茄、擬南芥、水稻、玉米、棉花、大豆PLC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of PLC proteins in tomato，Arabidopsis，rice，maize，cotton and soybean

表1 番茄PLC基因家族基本理化性質(zhì)Table 1 The Basic physical and chemical properties of PLC gene family in tomato

2.2 番茄PLC基因的基因結(jié)構(gòu)、保守基序分析

基于MEME網(wǎng)站預(yù)測PLC蛋白的保守基序顯示，PI-PLC和NPC蛋白均具備豐富的保守區(qū)域，其中NPC蛋白預(yù)測出3個motif，即motif 3、motif 7、motif 8，且均在各NPC蛋白中保守存在；另外，PI-PLC蛋白預(yù)測獲得7個motif，即moif 1/2/4/5/6/9/10。其中，番茄PLC6類蛋白具備更多的motif 10片段，SlPLC6a、SlPLC6b分別具備4、2個motif 10區(qū)域（圖2-A、B）。如圖3所示，motif 10處于PLC_Yc區(qū)域前端，具備兩個核心保守區(qū)域：YxxLI、RxSxxE。

基于注釋信息進行基因結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示NPC類基因與PI-PLC類基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜度差異較大，但其內(nèi)部的不同亞類差異較小。NPC基因內(nèi)含子多為0～4個，而PI-PLC基因內(nèi)含子數(shù)多超過7個。值得注意的是，番茄PLC基因內(nèi)含子數(shù)與水稻、擬南芥相似，但其內(nèi)含子區(qū)域相對更長（圖2-A、C）。

圖2 番茄、擬南芥、水稻PLC基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析Fig.2 Structure and motif analysis of PLC gene in tomato，Arabidopsis and rice

2.3 番茄PLC高級結(jié)構(gòu)分析

對其氨基酸序列進行分析結(jié)果顯示，番茄PLC蛋白的亞細胞定位中，不同類的NPC和PI-PLC間存在差異，其中NPC1蛋白和PI-PLC2主要位于線粒體，而NPC2位于高爾基體，NPC6定位于胞外，PI-PLC3、PIPLC4類蛋白主要位于細胞質(zhì)中。另外，不同蛋白間可能存在更多樣的潛在定位，例如SlPLC6a較SlPLC6b具備多線粒體的潛在定位（表2）。

基于SOPMA 2.0算法對番茄磷脂酶C的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示番茄PLC以無規(guī)則卷曲為主，其次是α-螺旋，再次是延伸鏈。同時，在不同亞類和不同磷脂依賴性的PLC中，三種二級元件的占比相對類似（表2）。進一步采用同源建模法對10個PLC蛋白進行建模，結(jié)果顯示，三級結(jié)構(gòu)的結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)基本一致，但不同PI-PLC蛋白亞類間的空間結(jié)構(gòu)差異較大，且在同類PI-PLC蛋白間也存在一定差異（圖3、4）。

表2 PLC家族蛋白二級結(jié)構(gòu)及亞細胞定位分析Table 2 Analysis of the secondary structure and subcellular localization of PLC family proteins

圖3 基序10的標志Fig.3 Logo of motif 10

2.4 番茄PLC基因的復(fù)制模式分析

基于番茄PLC基因在水稻、擬南芥、棉花基因組中尚存的共線性關(guān)系進行分析，以揭示其功能相似性和進化歷程。結(jié)果顯示，3個番茄PI-PLC基因（SlPLC2a、SlPLC3、SlPLC4）同水稻OsPLC4存在共線性。而在番茄和擬南芥、番茄與雷蒙德式棉PLC基因間分別存在12、16對共線性關(guān)系，包括2對（AtNPC2-SlNPC2、AtNPC6-SlNPC6）、1對（GrNPC1-SlNPC6）NPC基因的共線性關(guān)系和10對（SlPLC2a-AtPLC6、SlPLC2b-AtPLC6、SlPLC3-AtPLC1、SlPLC3-AtPLC6、SlPLC4-AtPLC1、SlPLC4-AtPLC9、SlPLC6a-AtPLC6、SlPLC6b-AtPLC6、SlPLC6a-AtPLC7、SlPLC6b-AtPLC7）、15對（SlPLC2a-GrPIPLC9、SlPLC2b-GrPIPLC8、SlPLC2b-GrPIPLC9、SlPLC3-GrPIPLC1、SlPLC3-GrPIPLC2、SlPLC3-GrPIPLC6、SlPLC3-GrPIPLC8、SlPLC3-GrPIPLC9、SlPLC4-GrPIPLC2、SlPLC6a-GrPIPLC6、SlPLC6a-GrPIPLC8、SlPLC6a-GrPIPLC9、SlPLC6b-GrPIPLC6、SlPLC6b-GrPIPLC8、SlPLC6b-GrPIPLC9）PI-PLC基因的共線性關(guān)系（圖5）。

圖5 番茄PLC基因在水稻（A）、擬南芥（B）、雷蒙德式棉（C）基因組中的共線性關(guān)系Fig.5 Collinearity of tomato PLC genes in rice（a），Arabidopsis（b）and Raymond cotton（c）genomes

由于PI-PLC基因在番茄和水稻間的共線性信息相互支撐，表明PI-PLC基因的潛在演化路徑為單子葉，PI-PLC4基因演化為雙子葉PI-PLC6基因的PIPLC分支基因。另外，番茄NPC基因可能來源于NPC亞類基因，而PI-PLC基因的豐富與不同亞類基因的擴展有關(guān)。

2.5 番茄PLC基因組織表達分析

基于番茄PLC基因的組織表達數(shù)據(jù)，對單一基因及PLC整體的表達情況進行分析。結(jié)果顯示，各PLC基因在各組織的表達上存在明顯的組織表達特異性；NPC基因在果中表達水平最高，其次是葉、根，PI-PLC基因則在葉（SlPLC2a、SlPLC2b、SlPLC3）、根（SlPLC6a、SlPLC6b）、果（SlPLC2s、SlPLC4）、花（SlPLC2a、SlPLC2c、SlPLC6b）中表達水平較高。同亞類番茄PLC基因也存在明顯表達差異，例如SlNPC1和SlNPC2/6表達存在差異，前者以成熟果中表達水平最高，而后者以幼果表達最高（圖6-A～J）。另外，基于其整體的表達水平，發(fā)現(xiàn)SlPLC3、SlPLC6a基因表達水平最低，而SlNPC1、SlPLC2b、SlPLC4表達水平最高，其余基因表達水平居中。SlPLC2a在根、組織、種子、幼苗、花中表達水平達極高水平（圖6-K）。

圖6 番茄各PLC基因的組織表達（A-J）及整體的組織表達水平（K）分析Fig.6 Expression analysis of the PLC genes in different tissues for single（A-J）and all（K）genes

2.6 番茄PLC基因抗ToBRFV侵染響應(yīng)分析

基于接種ToBRFV的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)提取PLC基因的侵染響應(yīng)表達數(shù)據(jù)，對各PLC基因在病毒侵染中的作用進行分析。結(jié)果顯示，除SlPLC6b未獲得相關(guān)測序結(jié)果外，各PLC基因在ToBRFV侵染過程均存在一 定 的 響 應(yīng)。其 中，SlNPC1、SlNPC6、SlPLC4在ToBRFV接種的樣本中表達水平升高，而其他PLC基因則在ToBRFV接種后表達水平降低（圖7）。

圖7 番茄PLC基因家族接種ToBRFV的葉片表達分析Fig.7 Leaf expression analysis after the tomato PLC gene family was vaccinated against ToBRFV

圖4 番茄PLC蛋白三級結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Tertiary structure analysis of tomato PLC protein

3 討論

發(fā)掘新的植物抗病毒基因是植物抗病毒研究和抗病毒育種的前提，也是病毒病防治最有效的方式［47］。早期研究認為，植物的天然抗病毒機制主要是R基因介導(dǎo)的抗病毒機制和RNA沉默機制［48-49］；近年來，病毒抗性與鈣依賴的Ca2+信號介導(dǎo)途經(jīng)的關(guān)系被大量報道［50］。然而，同樣作為重要信號通路的膜脂信號相關(guān)蛋白與抗病毒的研究甚少。本研究鑒定的番茄PCL家族屬于磷脂信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心組件，可介導(dǎo)DAG、PIP、Ga2+等多種第二信使分子［25-27］。但是，目前對于番茄磷脂酶C（PLC）的分布、結(jié)構(gòu)、抗病毒潛力等均不明確。為此，本研究對番茄中兩類PLC（NPC、PI-PLC）基因進行識別，共獲得10個PLC分子（7個PI-PLC和3個NPC），這一特征與其他雙子葉的PLC基因的分布基本相似，即PI-PLC分支基因多于NPC分支基因［32-35］。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，番茄具備擬南芥NPC1、NPC2、NPC6、PLC2、PLC3、PLC4、PLC6的同源蛋白，且番茄PLC2和PLC6分別具備3、2個拷貝。綜上，PCL在番茄中起重要作用，且該基因家族在進化過程中一直維持其同源性。

由于植物基因組豐富的演化，導(dǎo)致大部分基因家族成員之間的功能多樣性，包括組織特異性表達不同和逆境響應(yīng)的差異［32-35］。在先前的大豆PCL研究中發(fā)現(xiàn)達到磷脂酶C（GmPLC）基因同樣存在明顯的組織特異性表達；例如，大豆磷脂酶C7（GmPLC7）在根中表達最高，而大豆磷脂酶C5（GmPLC5）在根中表達最低，大豆磷脂酶C2/4/8（GmPLC2/4/8）在根中均不表達［40］。為此，本研究基于已經(jīng)公布的番茄基因表達譜，分析番茄PLC基因的組織特異性，結(jié)果顯示，NPC基因在番茄果實中的表達水平最高，其次是葉、根；而PI-PLC基因則 在 葉（SlPLC2a、SlPLC2b、SlPLC3）、根（SlPLC6a、SlPLC6b）、果（SlPLC2s、SlPLC4）、花（SlPLC2a、SlPLC2c、SlPLC6b）中的表達水平較高。由此推測NPC在番茄果實發(fā)育中發(fā)揮作用，而PI-PLC在葉片中發(fā)揮作用。

另外，有報道證明多種病原菌侵染可以誘導(dǎo)磷脂酶C的抗病防御反應(yīng)，如丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）、水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae）、葉霉病菌（Cladosporium fulvum）等多種病菌均可誘導(dǎo)寄主植物的PLC基因的表達或酶活性發(fā)生改變［28-29］。同時，一些磷脂酶C的下游信號分子與病毒侵染過程有著重要的作用，例如水稻BIDK1（OsBIDK1）的轉(zhuǎn)基因煙草具備更強的TMV抗性［31］，暗示過表達磷脂酶C下游信號分子相關(guān)基因可以提供植株對病毒的抗性；而下調(diào)擬南芥IPS2基因（AtIPS2）的擬南芥植株對TMV的抗性會下降［32］。這些結(jié)果表明磷脂酶C可能在植株抗病毒過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。為此，本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序分析番茄PLC基因受ToBRFV侵染的響應(yīng)表達情況，結(jié)果顯示SlNPC1、SlNPC6、SlPLC4可受ToBRFV接種誘導(dǎo)表達水平升高，其他PLC基因因ToBRFV侵染導(dǎo)致其表達受抑制，表明番茄部分PLC（SlNPC1、SlNPC6、SlPLC4）可能參與調(diào)控番茄對ToBRFV病毒的抗性，但番茄PCL的具體功能及抗病毒機制仍需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究鑒定出10個番茄PLC基因，可分為2個亞家族：PI-PLC和NPC。根據(jù)結(jié)構(gòu)相似度劃分為7個分支，分別為NPC1、NPC2、NPC6、PI-PLC2、PI-PLC3、PIPLC4、PI-PLC6。共線性分析顯示，番茄PLC基因與水稻、擬南芥、棉花PLC基因間分別存在3、12、16對共線性關(guān)系。番茄PLC基因中SlNPC1、SlNPC6、SlPLC4參與ToBRFV誘導(dǎo)防御反應(yīng)。