趙昕悅，孟祥偉，劉 妍，李 航，李 備，李春艷

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.長(zhǎng)春長(zhǎng)光辰英生物科學(xué)儀器有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130033)

養(yǎng)豬廢水是農(nóng)業(yè)污染的重要源頭，同時(shí)也被認(rèn)為是地表水富營(yíng)養(yǎng)化的主要原因.養(yǎng)豬廢水是一種典型的低C/N廢水(COD濃度400～20 000 mg/L，總N濃度200～16 000 mg/L)，具有水質(zhì)波動(dòng)大、有機(jī)物濃度高等特點(diǎn)，威脅水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和人類健康，因此，如何經(jīng)濟(jì)有效地處理養(yǎng)豬廢水成為急需解決的重要問題.

微藻是一種低等的古老生物，具有高效地獲取和利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的能力.它們自身攜帶葉綠體能進(jìn)行光合作用，部分微藻還能利用有機(jī)物進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng).與光合植物相比，微藻生長(zhǎng)速度快，對(duì)外界的環(huán)境有較高耐受性，在實(shí)現(xiàn)廢水凈化方面具有巨大潛力[1].微藻用于養(yǎng)豬廢水的處理，不僅可以讓微藻利用廢水中高濃度的碳、氮、磷等元素作為營(yíng)養(yǎng)來源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，同時(shí)還可以合成蛋白質(zhì)、油脂、多糖等生物質(zhì)，并在細(xì)胞內(nèi)大量富集[2].而且，微藻細(xì)胞富含的多種高價(jià)值生物質(zhì)在食品、醫(yī)藥、工業(yè)材料等方面都有著重要的應(yīng)用潛力.基于此，可以在利用微藻降解廢水中有機(jī)物的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)廢水的資源化利用.近年來，隨著全球資源與能源危機(jī)問題的逐步凸顯，微藻的開發(fā)與利用已成為環(huán)境治理和生物質(zhì)能源生產(chǎn)關(guān)注的焦點(diǎn).由于微藻對(duì)廢水的凈化能力比較依賴微藻自身的生長(zhǎng)狀況，所以，篩選出對(duì)于廢水具有優(yōu)良凈化效果的藻種，在后續(xù)廢水治理方面將有重大的研究意義[3].當(dāng)前最常用的微藻篩選方式是基于三區(qū)畫線操作的平板分選方法，這種方法雖然操作要求簡(jiǎn)單，但多次劃線增大了染菌概率，分選效率極低，且不適用于從環(huán)境背景復(fù)雜的樣本中分離出目標(biāo)微藻[4].

單細(xì)胞分離培養(yǎng)法是通過一定的單細(xì)胞分選設(shè)備，從群體中分離出來單個(gè)生物細(xì)胞，再對(duì)得到的單細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，這種分選方法可直接實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞的原位研究[5].傳統(tǒng)的單細(xì)胞分選包括熒光激活細(xì)胞分選和磁激活細(xì)胞分選等，這些基于外部基因編碼的熒光蛋白標(biāo)記或磁性分子和化合物標(biāo)記進(jìn)行的細(xì)胞預(yù)分選方法，由于外加標(biāo)記或修飾，可能會(huì)影響甚至改變細(xì)胞原本的狀態(tài)[6-7].Yuan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行單細(xì)胞分選工作時(shí)產(chǎn)生的激光輻射可對(duì)一些細(xì)胞造成損傷，這種損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無法進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng).此外，傳統(tǒng)的單細(xì)胞分選方法還有流式細(xì)胞術(shù)、激光顯微切割等，但由于微生物通常形態(tài)較小，難以使用這些方法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確分離[9-10].不可視、準(zhǔn)確性低、識(shí)別方式單一、分選尺寸受限、上樣量大等問題都是傳統(tǒng)單細(xì)胞分選技術(shù)所遇到的瓶頸.因此，尋找無損、可視化、能夠精準(zhǔn)定位目標(biāo)細(xì)胞并廣泛適用的細(xì)胞分選技術(shù)平臺(tái)是發(fā)展單細(xì)胞分析科學(xué)的必要條件.相比傳統(tǒng)單細(xì)胞分選方法，基于激光誘導(dǎo)向前轉(zhuǎn)移(LIFT)的單細(xì)胞分選技術(shù)可以免標(biāo)記、非接觸、精準(zhǔn)無損地分離出單個(gè)目標(biāo)微藻細(xì)胞.此技術(shù)基于激光與物質(zhì)相互作用的原理，具有獨(dú)特的可視化分選功能，所見即所得，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜生物樣本中單細(xì)胞的逐一精準(zhǔn)分離，其操作簡(jiǎn)單，能夠廣泛適用于不同尺寸、形態(tài)細(xì)胞的分離[11-12].具體而言，此分選技術(shù)集顯微成像與細(xì)胞分離為一體，可基于細(xì)胞形態(tài)識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞，分選過程中光與細(xì)胞不發(fā)生直接作用，不會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生影響；具有高精度多維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)亞微米級(jí)微生物細(xì)胞的精準(zhǔn)定位，配合圖像算法，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)聚焦、多細(xì)胞自動(dòng)識(shí)別、高通量自動(dòng)分選等功能，因此能夠保證純度，避免雜細(xì)胞污染；具有全自動(dòng)細(xì)胞接收系統(tǒng)，定位精度可達(dá)100 nm，確保單細(xì)胞準(zhǔn)確接收.

本文利用單細(xì)胞分選儀(PRECI SCS)，基于LIFT技術(shù)從哈爾濱周邊某養(yǎng)豬場(chǎng)附近的人工濕地水體中直接分選目標(biāo)——單細(xì)胞微藻，對(duì)篩選后的微藻單細(xì)胞進(jìn)行了富集、擴(kuò)大培養(yǎng)，以用于后續(xù)的廢水處理及資源化產(chǎn)物分析；通過對(duì)分選微藻進(jìn)行鑒定、生長(zhǎng)特性及理化性質(zhì)分析，探討了微藻對(duì)蛋白質(zhì)、油脂、多糖的積累性能，以及微藻在不同溫度、pH、廢水濃度、光照時(shí)間、光照強(qiáng)度的條件下對(duì)養(yǎng)豬廢水中COD、總氮、總磷降解能力的影響，以為實(shí)現(xiàn)微藻處理污水并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)儲(chǔ)備和理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)試劑：重鉻酸鉀、硫酸、鉬酸銨、酒石酸銻氧鉀、抗壞血酸、過硫酸鉀、氫氧化鈉、氯化氫等，其中所用化學(xué)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水.

實(shí)驗(yàn)儀器：?jiǎn)渭?xì)胞分選儀器(HOOKE PRECI SCS)、生化培養(yǎng)箱(BSP-100)、可見分光光度計(jì)(UV-1800PC)、磁力攪拌器(MSB-1C)、COD消解儀(58-3C)、高溫滅菌鍋(LDZX-30KBS)等.

樣品采集：實(shí)驗(yàn)所用微藻源取自哈爾濱周邊某養(yǎng)豬場(chǎng)附近人工濕地的水體.

微藻培養(yǎng)基：采用BG11培養(yǎng)基，組分為：NaNO31.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.04 g/L，MgSO4·7H2O 0.075 g/L，CaCl2·2H2O 0.036 g/L，C6H8O70.006 g/L，C6H8FeNO70.006 g/L，EDTA 0.001 g/L，Na2CO30.02 g/L，H3BO30.002 86 g/L，MnCl2·H2O 0.001 81 g/L，ZnSO4·7H2O 0.000 222 g/L，CuSO4·5H2O 0.000 079 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.000 39 g/L，Co(NO3)2·6H2O 0.000 049 g/L.

養(yǎng)豬廢水配方：實(shí)驗(yàn)所用養(yǎng)豬廢水配方及成分見表1

表1 不同初始COD濃度的養(yǎng)豬廢水指標(biāo) g

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單細(xì)胞分選

分選操作前，將收集的水樣充分搖勻并混合均勻，取 2 μL樣品于分選芯片上，通過單細(xì)胞分選儀對(duì)樣品中的細(xì)胞進(jìn)行顯微成像.其后，在顯微成像中定位目標(biāo)——微藻單細(xì)胞并進(jìn)行單細(xì)胞分離和接收.將接收器接收的微藻單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有3.0 g/L葡萄糖的BG11液體培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)管中，置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件30℃、24 h光照、轉(zhuǎn)速400 r/min.若單細(xì)胞可成功進(jìn)行增殖，則將此藻液繼續(xù)轉(zhuǎn)移到含有3.0 g/L葡萄糖的BG11液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng).從擴(kuò)大培養(yǎng)后的藻液中轉(zhuǎn)移15 μL藻液于BG11固體培養(yǎng)基中進(jìn)行三區(qū)劃線直至出現(xiàn)單藻落.

1.2.2 目標(biāo)微藻的18SrRNA鑒定

三代純化后，挑取含有BG11固體培養(yǎng)基的平板中的單藻落，提取微藻總DNA，并采用通用引物18SF(5′-CCTGGTTGATCCTGCCAG-3′)和18SR(5′-TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行18SrRNA測(cè)序.測(cè)序結(jié)果通過比對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，基于分子生物學(xué)手段判斷目標(biāo)藻樣品的種屬水平分類學(xué)信息，并采用MEGA7平臺(tái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13].

1.2.3 微藻理化性質(zhì)測(cè)定

(1)油脂的測(cè)定：利用干重法對(duì)微藻的油脂含量進(jìn)行測(cè)定.用移液槍吸取20 mL藻液至50 mL離心管中，8 000 r/min條件下離心10 min；倒掉上清液后，用去離子水反復(fù)清洗3次并收集藻樣，將收集的藻樣轉(zhuǎn)移至新的10 mL離心管中.加入2 mL的氯仿和4 mL的甲醇，以超聲功率400 W工作5 s 間歇2 s的破碎條件超聲破碎10 min，4 500 r/min離心10 min，用新的離心管收集上清液.最后，在含有上清液的離心管中加入2 mL 1% 的氯化鈉溶液，靜置分層，下層液體即為油脂和氯仿的混合物，將下層混合物吸取到已經(jīng)稱過重的空試管中.在含有藻液的離心管中繼續(xù)加入2 mL氯仿和4 mL甲醇，重復(fù)上述步驟，直至藻體顏色變白.將空白試管的質(zhì)量記為m1，將裝有油脂和氯仿混合物的試管置于65℃水浴鍋中蒸干，蒸干后對(duì)試管進(jìn)行稱量，質(zhì)量記為m2，油脂的最終質(zhì)量即為m2-m1.

(2)多糖的測(cè)定：采用改良的蒽酮-硫酸法對(duì)微藻中的多糖進(jìn)行測(cè)定.首先，以葡萄糖為對(duì)照品繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取干燥的葡萄糖0.1 g，將其定容至100 mL后混勻；從中分別取 0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，5.0，7.5 mL并定容至50 mL，配制成5，10，20，40，80，100，150 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；再分別從中取1 mL，加入4 mL的蒽酮-硫酸溶液，混勻后置于沸水浴 10 min，冰浴后于 620 nm條件下測(cè)吸光值；以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.然后，稱取微藻干粉1 g，先使用 80%的乙醇去除葉綠素，再使用高氯酸水解淀粉和多糖，離心.此過程重復(fù)3次，合并收集上清液.以4倍體積向提取的濃縮液中加入Sevage試劑(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)進(jìn)行脫蛋白處理，再加入無水乙醇使得乙醇終濃度為80%，4℃條件下放置24 h后離心.向沉淀中加入80%的乙醇溶液進(jìn)行洗滌并離心，重復(fù)3次.最后，所得沉淀復(fù)溶后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法測(cè)定樣品620 nm下的吸光值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算提取的微藻產(chǎn)多糖的質(zhì)量.

(3)蛋白質(zhì)的測(cè)定：采用Bradford法對(duì)微藻中的蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定.將微藻細(xì)胞用1× PBS稀釋，按照Bradford測(cè)定法的蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(中國(guó)生工生物工程有限公司)說明書操作測(cè)定.

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

提高微藻規(guī)模生產(chǎn)在經(jīng)濟(jì)上的可行性，微藻需具有較高的生長(zhǎng)速度和生物質(zhì)產(chǎn)量[14].在處理養(yǎng)豬廢水過程中，微藻的有效生長(zhǎng)與培養(yǎng)條件密切相關(guān)，例如：養(yǎng)豬廢水的濃度、pH、光照時(shí)間、光照強(qiáng)度、溫度和碳氮比等.然而，微藻在不同的培養(yǎng)條件下，其生長(zhǎng)與生物量的產(chǎn)生具有較大的差異，進(jìn)而對(duì)廢水的處理能力有著顯著的影響.因此，本文根據(jù)以上6種因素設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，分析微藻去除養(yǎng)豬廢水中COD及總N(TN)、總P(TP)的能力.

將150 mL養(yǎng)豬廢水分別裝至錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH，依次放入轉(zhuǎn)子后做好標(biāo)記，并在121℃條件下滅菌20 min.取10 mL藻液，離心處理后棄上清，將藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接到養(yǎng)豬廢水中.不同組單因素實(shí)驗(yàn)條件如下：

(1)設(shè)定養(yǎng)豬廢水COD初始濃度為200，400，600，800 mg/L，固定其他培養(yǎng)條件：pH=7，光照時(shí)間24 h，光照強(qiáng)度4 000 lx，溫度為30℃，碳氮比為8∶1.設(shè)置4組平行實(shí)驗(yàn).

(2)設(shè)定養(yǎng)豬廢水的pH分別為5，6，7，8，固定其他培養(yǎng)條件：初始COD濃度為400 mg/L，光照時(shí)間24 h，光照強(qiáng)度為4 000 lx，溫度為30℃，碳氮比為8∶1.設(shè)置4組平行實(shí)驗(yàn).

(3)設(shè)定光照時(shí)間為0，8，16，24 h，固定其他培養(yǎng)條件：初始COD濃度為400 mg/L，pH=7，光照強(qiáng)度為4 000 lx，溫度為 30℃，碳氮比為8∶1.設(shè)置4組平行實(shí)驗(yàn).

(4)設(shè)定光照強(qiáng)度為0，2 000，4 000，6 000 lx，固定其他培養(yǎng)條件：初始COD濃度為400 mg/L，光照時(shí)間 24 h，pH=7，溫度為 30℃，碳氮比為8∶1.設(shè)置4組平行實(shí)驗(yàn).

(5)設(shè)定培養(yǎng)溫度為20℃，25℃，30℃，35℃，固定其他培養(yǎng)條件：初始COD濃度為400 mg/L，pH=7，光照時(shí)間 24 h，光照強(qiáng)度為4 000 lx，碳氮比為8∶1.設(shè)置4組平行實(shí)驗(yàn).

(6)設(shè)定養(yǎng)豬廢水的碳氮比為1∶1，4∶3，8∶1，15∶1，固定其他培養(yǎng)條件：初始COD濃度為400 mg/L，pH=7，光照時(shí)間24 h，光照強(qiáng)度為4 000 lx，溫度為30℃.設(shè)置4組平行實(shí)驗(yàn).

待實(shí)驗(yàn)按照上述條件進(jìn)行時(shí)，分別于12，24，36，48，60 h 取樣20 mL，離心取上清液，上清液過0.22 μm濾膜后測(cè)定養(yǎng)豬廢水中COD及TN，TP的含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 微藻單細(xì)胞的分選

通過基于激光誘導(dǎo)向前轉(zhuǎn)移(LIFT)單細(xì)胞分選技術(shù)識(shí)別并分選樣品中的微藻，其過程原理如圖1(a)所示.應(yīng)用PRECI SCS單細(xì)胞分選儀，利用激光將微藻單細(xì)胞從分選芯片上分離至采集器中，以此來獲得微藻單細(xì)胞，這種方法保證了單細(xì)胞微藻純度以及分選的準(zhǔn)確性，防止雜菌污染.LIFT細(xì)胞分選作為一種非接觸性的分選方法，在最大程度上降低了分選過程對(duì)單細(xì)胞的影響，使單細(xì)胞后續(xù)可培養(yǎng)至單藻落.結(jié)合圖1(b)的顯微成像圖可以觀察到，分選前在芯片上可以清晰地觀察到目標(biāo)藻單細(xì)胞，且接收器視場(chǎng)中無任何細(xì)胞.分選后，可觀察到目標(biāo)藻細(xì)胞從芯片上消失，而視野中的其他非目標(biāo)藻細(xì)胞未發(fā)生變化，目標(biāo)藻細(xì)胞出現(xiàn)在收集器中，形態(tài)保持完整，且收集器中未混入其他細(xì)胞.

圖1 微藻單細(xì)胞分選原理(a)及微藻單細(xì)胞分選前后結(jié)果對(duì)比(b)

2.2 微藻種屬鑒定

通過單細(xì)胞分選儀收集的細(xì)胞經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后的顯微成像見圖2(a)，其中的微藻細(xì)胞呈現(xiàn)淺綠色，橢圓形，細(xì)胞壁光滑.根據(jù)18SrRNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)果(見圖2(b))，該株微藻與DesmodesmusabundansCCAP 258/213 相似性為99.94%，因此，確定該株微藻屬于Desmodesmusabundans，并將其命名為ZM-4.

圖2 微藻ZM-4光學(xué)顯微鏡成像圖(a)及基于18SrRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(b)

2.3 微藻ZM-4的理化性質(zhì)

微藻細(xì)胞內(nèi)含有豐富的生物質(zhì)能源，本文測(cè)得的實(shí)驗(yàn)微藻油脂產(chǎn)量為108.3 mg/g、蛋白質(zhì)產(chǎn)量為190.7 mg/g、多糖產(chǎn)量為126.3 mg/g，因此判斷本研究分選的微藻ZM-4偏向于產(chǎn)蛋白.這些產(chǎn)物后續(xù)均可以作為生物柴油生產(chǎn)來源、食品加工原料和養(yǎng)豬場(chǎng)部分蛋白飼料的替代品等用于人類生產(chǎn)生活[15].此外，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的3種成分在微藻中的含量占比均在 10%～20%，除上述已測(cè)成分外，微藻細(xì)胞也可產(chǎn)生不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的色素、維生素和礦物質(zhì)等資源化有機(jī)質(zhì)[16].

2.4 微藻ZM-4的生長(zhǎng)

以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，D(680)為縱坐標(biāo)，利用Origin軟件繪制微藻ZM-4生長(zhǎng)折線圖(見圖3).由圖3可見，微藻ZM-4在一個(gè)生長(zhǎng)周期中，D(680)=0.028～0.156.在前6 h，微藻ZM-4的D(680)由0.028增長(zhǎng)至0.035，此過程微藻ZM-4生長(zhǎng)緩慢；6 h后，D(680)迅速增加，微藻生長(zhǎng)速度明顯增大，在28 h時(shí)D(680)達(dá)到0.155；此后D(680)變化不大，微藻生長(zhǎng)速度開始減慢，在30 h時(shí)D(680)穩(wěn)定至0.156；隨后在34 h時(shí)微藻生物量開始降低，進(jìn)入衰亡期.

圖3 微藻ZM-4生長(zhǎng)曲線

2.5 不同條件下微藻ZM-4對(duì)養(yǎng)豬廢水降解能力

2.5.1 不同初始廢水濃度

養(yǎng)豬廢水的濃度對(duì)微藻ZM-4降解廢水中COD和TN，TP的能力有一定影響.由圖4可見，除12 h取樣時(shí)間點(diǎn)以外，其他時(shí)間的取樣點(diǎn)均呈現(xiàn)出廢水濃度越高、微藻降解能力越強(qiáng)的趨勢(shì).Converti等[17]的研究表明，氮含量的減少會(huì)抑制微擬球藻(Nannochloropsisoculata)的光合作用與呼吸作用.因此推測(cè)隨著養(yǎng)豬廢水中氮含量的增加，促進(jìn)了微藻的光合作用，導(dǎo)致微藻的光合作用能吸收更多的二氧化碳并提高微藻對(duì)于COD和TN，TP的去除效果[18].而在降解的前12 h，可能由于微藻生物量和光合效率較低，因此不具備降解高濃度廢水的能力.總的來說，ZM-4的降解能力隨著廢水濃度的增加而增加，當(dāng)廢水中COD濃度為800 mg/L時(shí)，微藻對(duì)COD和TN，TP的降解率呈現(xiàn)最高水平，分別為59.93%，61.5%，43.44%.

圖4 不同廢水濃度下Desmodesmus abundans ZM-4的COD降解效率(a)，TN降解效率(b)，TP降解效率(c)

2.5.2 不同pH

相關(guān)研究[19]表明，微藻生長(zhǎng)的最適pH范圍一般為6～8，圖5所示結(jié)果也符合這一規(guī)律，在pH=6～8時(shí)微藻對(duì)COD和TN，TP的降解效果更優(yōu).而在pH=5的偏酸環(huán)境中，微藻對(duì)污染物的降解效果略顯下降，但小范圍變化的酸堿度對(duì)微藻的生長(zhǎng)影響不大[20].此外，不同取樣時(shí)間對(duì)應(yīng)的降解率會(huì)隨時(shí)間呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì).在降解36 h時(shí)，微藻的降解能力最優(yōu).總體而言，當(dāng)pH=7時(shí)，微藻對(duì)COD和TN，TP的降解率呈現(xiàn)最高水平，分別為 43.06%，34.91%，30.46%.

圖5 不同pH條件下Desmodesmus abundans ZM-4的COD降解效率(a)，TN降解效率(b)，TP降解效率(c)

2.5.3 不同光照時(shí)間

由圖6可見，隨著光照時(shí)間的增長(zhǎng)，微藻降解能力整體呈現(xiàn)正增長(zhǎng)趨勢(shì).光照時(shí)間為24 h時(shí)，降解效果最優(yōu)，這可能是由于光照時(shí)間的增加促進(jìn)了微藻的光合作用.但在0 h光照條件下，微藻也存在著一定的降解COD和TN，TP的能力，推測(cè)可能是由于微藻在無光照環(huán)境下仍可進(jìn)行內(nèi)源呼吸代謝作用，因此對(duì)廢水中的COD和TN，TP存在著一定的降解能力.根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，微藻ZM-4的降解能力在光照時(shí)長(zhǎng)為24 h時(shí)呈現(xiàn)最高水平，COD降解率為 40.63%，TN降解率為 33.65%，TP降解率為 34.32%.

圖6 不同光照時(shí)間條件下Desmodesmus abundans ZM-4的COD降解效率(a)，TN降解效率(b)，TP降解效率(c)

2.5.4 不同光照強(qiáng)度

在其他環(huán)境因子和營(yíng)養(yǎng)源不限制微藻生長(zhǎng)的條件下，光照強(qiáng)度是影響藻細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的重要因子之一.由圖7可見，隨著光照強(qiáng)度的增加，微藻降解能力逐漸增強(qiáng).這是因?yàn)楣夂献饔玫脑鰪?qiáng)，刺激了微藻的呼吸作用，從而為碳、氮、磷等代謝過程提供了大量氧氣和能量，導(dǎo)致降解能力的提高.當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)到6 000 lx時(shí)，微藻ZM-4的生長(zhǎng)與降解在48 h和60 h出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象.光照強(qiáng)度直接影響微藻的光合作用進(jìn)而影響其降解能力，當(dāng)光照強(qiáng)度過飽和時(shí)，微藻生長(zhǎng)量過多，細(xì)胞間相互遮蔽反而抑制了光合作用[21]，這可能是微藻降解能力在48 h和60 h有所降低的原因.由圖7可知，微藻ZM-4的降解能力在光照強(qiáng)度為6 000 lx時(shí)呈現(xiàn)最高水平，COD降解率為40.63%，TN降解率為33.65%，TP降解率為34.32%.

圖7 不同光照強(qiáng)度下Desmodesmus abundans ZM-4的COD降解效率(a)，TN降解效率(b)，TP降解效率(c)

2.5.5 不同溫度

溫度直接影響微藻對(duì)廢水中COD和TN，TP的降解效果.在25℃～35℃范圍內(nèi)，污染物降解率較高，當(dāng)高于最適溫度，微藻的生長(zhǎng)將會(huì)減慢甚至停止生長(zhǎng)，微藻的降解能力相對(duì)減弱.當(dāng)溫度較低時(shí)，微藻由于細(xì)胞內(nèi)酶的活性下降，主要依靠光合作用從外界環(huán)境獲取能量以維持生存所需，導(dǎo)致降解能力下降.溫度通過兩方面影響微藻ZM-4的生長(zhǎng)與降解能力，一是溫度變化對(duì)廢水中的碳、氮、磷含量有一定影響；二是溫度影響微藻細(xì)胞內(nèi)酶的活性[22].本文的研究結(jié)果表明，微藻ZM-4的降解能力在30℃時(shí)最優(yōu)，此時(shí)對(duì)COD的降解率為40.63%，對(duì)TN的降解率為33.65%，對(duì)TP的降解率為30.32%.

圖8 不同溫度條件下Desmodesmus abundans ZM-4的COD降解效率(a)，TN降解效率(b)，TP降解效率(c)

2.5.6 不同碳氮比

由圖9可見，微藻ZM-4對(duì)COD和TN的降解率隨著碳氮比的增大表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì).相關(guān)研究[23]表明，氮濃度不足會(huì)限制微藻中葉綠素的含量，進(jìn)而抑制微藻的光合作用、降低微藻的生物量，這可能就是碳氮比為15∶1時(shí)微藻降解率下降的原因.微藻對(duì)TP的降解則隨著碳氮比的增大而升高，在碳氮比為15∶1時(shí)，微藻對(duì)TP的降解率相對(duì)最高.綜合以上結(jié)果，微藻ZM-4對(duì)COD和TN的降解能力在碳氮比為8∶1時(shí)最高，降解率分別為40.91%和41.26%；對(duì)TP的降解能力在碳氮比為15∶1時(shí)最高，降解率為62.58%.

3 結(jié)論

本文通過對(duì)微藻進(jìn)行單細(xì)胞分選，并測(cè)定微藻ZM-4的生長(zhǎng)特性、理化性質(zhì)和不同條件下對(duì)養(yǎng)豬廢水中污染物的降解能力，得到以下結(jié)論：

(1)利用單細(xì)胞分選技術(shù)對(duì)目標(biāo)藻株進(jìn)行分離篩選，成功分選的微藻單細(xì)胞經(jīng)過擴(kuò)大富集培養(yǎng)后，鑒定為DesmodesmusabundansZM-4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了單細(xì)胞分選的免標(biāo)記、非破壞、快速、無需復(fù)雜預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)，證明了單細(xì)胞分選技術(shù)在微藻篩選和鑒定方面的可行性.

(2)微藻ZM-4能夠產(chǎn)生108.3 mg/g的油脂、190.7 mg/g的蛋白質(zhì)和126.3 mg/g的多糖，該藻株更偏向于產(chǎn)蛋白微藻.

(3)通過改變養(yǎng)豬廢水濃度、pH、光照時(shí)間、光照強(qiáng)度、溫度、碳氮比6個(gè)環(huán)境因子進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出：微藻ZM-4在養(yǎng)豬廢水COD濃度為 800 mg/L，pH=7，光照時(shí)長(zhǎng)為24 h，光照強(qiáng)度為6 000 lx，環(huán)境溫度為30℃，碳氮比為8∶1的條件下，對(duì)廢水中COD和TN，TP的降解能力最優(yōu).