丁 歡，吳紹華，夏志輝，黃 惜，史敏晶,*

橡膠樹不同粒徑橡膠粒子結合凝集相關蛋白的分析

丁 歡1，吳紹華2，夏志輝1，黃 惜1，史敏晶1,2*

1. 海南大學熱帶作物學院，海南?？?570228；2. 中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所/農業(yè)農村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，海南?？?571101

橡膠樹是重要的產膠植物，其樹皮組織中的次生乳管是合成和貯存天然橡膠的主要組織。天然橡膠是從乳管中的膠乳中提煉而成，由特殊的細胞器-橡膠粒子合成。橡膠粒子為半個單位膜的球狀結構，內部貯存合成的天然橡膠，外周膜上結合有多種蛋白質，這些蛋白與其執(zhí)行的功能密切相關。目前對天然橡膠合成相關蛋白的研究較多，對與橡膠粒子凝集相關的蛋白研究甚少。以‘RY7-33-97’膠乳為材料，利用不同的離心速度，分級分離獲取不同粒徑的橡膠粒子，并進行不同程度的清洗，以Tricine-SDS-PAGE以及Western-blotting技術對橡膠粒子上結合的蛋白進行比較分析。研究結果表明，不同粒徑的橡膠粒子上結合的蛋白含量存在差異。小橡膠粒子膜蛋白（SRPP）隨著粒徑的減小含量明顯增加；而橡膠延伸因子蛋白（REF）的含量基本維持穩(wěn)定，與粒徑大小關系不大。存在于C-乳清中的Hev b7膠乳過敏原蛋白和3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）與橡膠粒子有明顯的結合；存在于黃色體B-乳清中的β-1,3-葡聚糖酶（Glu）、橡膠素（Hev）和幾丁質酶（Chit）均能與橡膠粒子結合，但幾丁質酶與之的結合能力最弱。橡膠粒子經清洗后，作為橡膠粒子的主要膜蛋白，SRPP含量隨著清洗次數增加明顯降低，而REF蛋白含量變化不明顯，可見SRPP與橡膠粒子膜的結合緊密程度不如REF；來自C-乳清和B-乳清的凝集相關蛋白隨清洗次數增加也明顯降低含量。體外孵育小橡膠粒子與不同的蛋白樣品，結果表明，橡膠粒子可體外結合多種不同的蛋白，其中多種蛋白都與橡膠粒子的凝集有關。本研究對不同粒徑橡膠粒子上結合的凝集相關蛋白進行了初步解析，旨在為闡明橡膠樹排膠機制奠定基礎。

橡膠樹；橡膠粒子；凝集相關蛋白；蛋白免疫印跡

橡膠樹是當前世界上最重要的人工栽培產膠植物，其膠乳主要是由橡膠樹樹干中的次生乳管合成和貯藏[1]。次生乳管是由維管形成層中的紡錘狀原始細胞分裂形成，與形成層呈同心圓狀排列，其數量的多少與膠乳的產量密切相關[2-3]。在次生乳管發(fā)育過程中，同列（或同層）的乳管細胞之間形成互相融合的接合管，最終使得同一層的乳管細胞形成彼此連通的網狀結構[1]。生產中通過割膠，即機械割破樹皮的乳管使膠乳流出，從而收集膠乳制備天然橡膠。

橡膠樹中的天然橡膠是一種順式－聚異戊二烯次生代謝物，由乳管中的特殊細胞器——橡膠粒子合成[4-5]。橡膠粒子是一種半個單位膜構成的球狀結構，其大小分布范圍為0.04～6.00 μm，膜組分主要是脂類和蛋白質以及其他非橡膠成分組成的親水性層，而合成的天然橡膠烴則貯存在粒子內部[1, 6-7]。天然橡膠的合成是一個復雜的過程，多年來，學者們一直致力于研究橡膠粒子的天然橡膠合成機制[8-11]，對橡膠粒子的結構以及其上的膜蛋白進行了大量的研究，發(fā)現了小橡膠粒子膜蛋白（SRPP）[12]和橡膠延伸因子蛋白（REF）[13-15]2個高豐度蛋白，以及橡膠轉移酶[16-17]等其他多種蛋白[18-19]。隨著研究的深入，天然橡膠的合成途徑被逐漸剖析，大量與橡膠合成相關的蛋白質也被發(fā)現[19]。

作為膠乳中最主要的、含量最高的細胞器，除了橡膠生物合成的功能外，橡膠粒子在膠乳的停排中也起到了重要的作用。人們最早認為橡膠粒子彼此之間進行膜融合形成橡膠凝塊，從而堵塞了乳管傷口，導致膠乳排膠終止，由此提出了“膠蓋-膠塞模型”[20-21]。膠乳中的黃色體被認為是橡膠粒子的促凝固系統，其內含物中的多種蛋白被發(fā)現具有促進膠乳凝固的作用[21]，據此，提出了多個有關橡膠粒子凝固的假說[22-26]，其中的“凝集素”假說得到較為廣泛的認同[25-26]?！澳亍奔僬f認為來自黃色體中的凝集素類蛋白質與橡膠粒子上的一種約22 kDa蛋白結合，導致了橡膠粒子的凝集，而這種22 kDa蛋白被證明為SRPP[27]。我國郝秉中等[28-29]研究發(fā)現，膠乳停排時，橡膠粒子仍然保持膜結構的完整性，并未出現凝固現象。SHI等[30]對橡膠粒子的凝集進行研究，發(fā)現C-乳清中的3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）和Hev b7這2種蛋白也參與了橡膠粒子的凝集，并提出了以黃色體主要蛋白構成的“蛋白質網”為核心結合橡膠粒子的乳管傷口堵塞機制[28, 31]。由此可見，橡膠粒子不僅是天然橡膠合成的細胞器，也是排膠堵塞的主要參與者，它與黃色體構成了乳管傷口堵塞物的核心組分。橡膠粒子上除了SRPP外，是否還有其他蛋白參與橡膠粒子的凝集，不同粒徑的橡膠粒子在蛋白凝集互作上是否存在差異，目前對這些問題的研究都很少。本研究以‘RY7-33-97’為研究材料，采集膠乳后進行不同粒徑的橡膠粒子的分級分離，利用電泳以及蛋白質免疫印跡對不同處理的橡膠粒子上的蛋白進行分析，旨在為最終闡述橡膠粒子的凝集原理和橡膠樹乳管排膠機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 選取種植于中國熱帶農業(yè)科學院儋州試驗場九隊（海南儋州寶島新村）開割7年的‘RY7-33-97’成齡健康橡膠樹，冰上收集正常排膠第5～30 min的膠乳，迅速帶回實驗室，低溫高速分級離心，收集不同粒徑大小的橡膠粒子組分，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與儀器 Tricine、Glycine、SDS、Tris購自AMRESCO（美國）；丙烯酰胺（Acrylamide）購自NOVON（美國）；N-N甲叉雙丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）、過硫酸銨（AP）、TEMED購自Sigma（西格瑪科技有限公司，美國）；β-巰基乙醇、甘露醇購自BBI公司（中國）；甲醇、乙醇、冰乙酸、鹽酸等均為國產分析純。分子量標準蛋白（10、17、26、34、43、55、72、95、130、180 kDa，共10條帶）為Fermentas產品。帶堿性磷酸酶標記的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗為PIERCE（皮爾斯，美國）產品，堿性磷酸酶標記的兔抗雞二抗購自Sigma。帶辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、抗雞和抗鼠二抗購自Thermo Fisher Scientific （美國）。BCIP/NBT底物顯色試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PVDF膜（0.2 μm）購自Bio-Rad（伯樂）。橡膠素一抗體由廈門博欣生物技術有限公司（Bambio）制備，幾丁質酶一抗由寶賽生物生物技術有限公司合成，β-1,3-葡聚糖酶（Glu）一抗為北京華大基因研究中心制備；小橡膠粒子膜蛋白（SRPP）、橡膠延伸因子（REF）、HEV b7、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體均為兔抗，由廈門博欣生物技術有限公司（Bambio）制備。

高速離心機購自Thermo fisher Scientific（美國）；DYY-Ⅲ-7B轉移電泳儀、DYY-12C型，電泳儀及小型電泳槽購自北京六一儀器廠；凝膠成像儀ImageQuant LAS 4000購自GE（美國）有限公司；LA-960激光粒度儀購自HORIBA（日本）公司。

1.2 方法

1.2.1 不同大小粒徑橡膠粒子的制備 冰上保存的膠乳于高速離心機中以10 000 r/min，4℃條件下離心30 min，收集上層橡膠膏保存?zhèn)溆茫嘞碌哪z乳溶液依次以13 000、15 000、18 000 r/min 4℃條件下離心30 min，每次分離均收集上層橡膠膏備用，最后將余下的主要為小橡膠粒子的懸液于18 000 r/m, 4℃，離心60 min，收集上層半透明狀的橡膠膏備用。

1.2.2 不同清洗強度橡膠粒子的制備 將分級離心后收集的不同粒徑大小的橡膠粒子按照1 g分散懸浮到3.5 mL等滲緩沖液（0.05 mol/L Tris- HCl+0.4 mol/L甘露醇，pH 7.2）中清洗，然后同1.2.1中對應的離心速度離心收集橡膠粒子，每種樣品均清洗3次，然后收集清洗完畢的橡膠粒子制備電泳樣品。

1.2.3 橡膠粒子粒徑測定 取不同離心速度收集的橡膠粒子，分散到等滲緩沖液中，LA-960激光粒度儀測定，具體方法按照LA-960濕法操作手冊進行。

1.2.4 C-乳清和B-乳清等不同蛋白樣品與小橡膠粒子的結合實驗 膠乳于18 000 r/min，4℃條件下離心120 min，收集底部黃色體以及中間清液C-乳清；黃色體經反復凍融后離心收集清液即B-乳清；硫酸銨分級沉淀，分別收集B-乳清和C-乳清的85%硫酸銨沉淀收集的樣品；柱層析純化β-1,3-葡聚糖酶。取平均粒徑為0.16 μm的小橡膠粒子按照1 g分散懸浮到3.5 mL等滲緩沖液（0.05 mol/L Tris-HCl+0.4 mol/L甘露醇，pH 7.2）中，然后取100 μL與前各種蛋白樣品100 μL于25℃孵育30 min，加入10 μL的3%醋酸終止反應，7000 r/min，25℃條件下離心10 min，收集上層橡膠膏，制備電泳樣品。

1.2.5 Tricine-SDS-Page Tricine-SDS-PAGE參照SCHAGGER等[32]和史敏晶等[33]的方法，簡化成兩層膠。不同的橡膠粒子膏狀物均按照0.01 g分散到70 μL超純水中，然后加入等體積的SDS上樣緩沖液，煮沸5 min，離心后取上清電泳。每泳道上樣量為10 μL（等體積上樣）。電泳于濃縮膠中電壓為30 V，樣品完全到達分離膠界面后,升至100 V恒壓電泳至結束。

1.2.6 Western Blotting 參照TOWBIN等[34]的方法將Tricine-SDS-PAGE電泳后凝膠中的蛋白質轉移到0.2 μm PVDF膜上，50 mA低溫轉移12 h。轉移電極緩沖液含20 mmol/L Tris堿，150 mmol/L甘氨酸，20%甲醇（/）。轉移后漂洗，TBS溶液中過渡5 min，加入0.2%（/）戊二醛的TBS溶液中固定鉸鏈45 min，漂洗，于10%脫脂奶粉的TBS封閉液中4℃封閉過夜。橡膠素、幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶、SRPP、REF、HEV b7、GAPDH一抗稀釋倍數均為1∶3000；二抗則為1∶5000稀釋倍數；抗體在37℃孵育90 min，BCIP/NBT顯色5～10 min；化學發(fā)光1 h內顯色，LAS4000成像。

2 結果與分析

2.1 不同粒徑橡膠粒子膜結合蛋白分析

對不同離心速度分離獲取的橡膠粒子組分進行粒徑大小測定，結果表明，隨著離心速度的增加，分離出來的橡膠粒子平均粒徑越小，并且峰形也由雙峰變?yōu)閱畏澹▓D1）。首次離心分離速度為10 000 r/min，平均粒徑為0.45 μm，出現典型的雙峰，其中粒徑小于0.45 μm的橡膠粒子（即小橡膠粒子）占比為58.06%，余下的直徑為0.45～ 1.73 μm的大橡膠粒子占比為41.94%，可見，即使是較低的離心速度，仍然能收集到小橡膠粒子（圖1A）；13 000 r/min離心后，平均粒徑為0.37 μm，仍然表現為雙峰，但是大粒徑組分的峰值明顯降低，粒徑小于0.45 μm的小橡膠粒子具體占比升高至68.61%，大橡膠粒子占比則降至31.39%（圖1B）；15 000 r/min離心后，雙峰基本消失，平均粒徑為0.22 μm，小橡膠粒子占比高達91.34%，而大橡膠粒子占比僅8.66%，且其中最大粒徑僅為0.88 μm，可見，此時離心收集到的橡膠粒子基本上是小橡膠粒子（圖1C）；18 000 r/min離心后，峰形為單峰，平均粒徑為0.16 μm，小橡膠粒子占比達100.00%，大于0.45 μm的橡膠粒子完全消失（圖1D）；對保留在C-乳清中仍然殘存的小橡膠粒子進行延時離心，收集后測定粒徑，結果表明，這些橡膠粒子的平均粒徑更小，約為0.14 μm，最小的粒徑為0.07 μm，最大的也僅為0.39 μm（圖1E），可見，隨著離心強度增大，橡膠粒子組分的粒徑逐漸減小。

對收集的不同組分橡膠粒子的膜上蛋白組分進行分析，電泳結果表明（圖2A），不同樣品的蛋白含量存在差異，尤其在20 kDa左右的中低分子量蛋白條帶，差異明顯。通過免疫印跡（WB）對這些蛋白進行鑒定分析，結果表明，免疫印跡化學發(fā)光顯示，存在于C-乳清中的蛋白3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（圖2B）和過敏原蛋白Hev b7（圖2C）都被清晰地檢測到；黃色體中的高豐度蛋白β-1,3-葡聚糖酶（Glu）（圖2D）和橡膠素（Hev）尤其是其前體（圖2E）也能被檢測到，但幾丁質酶（Chit）只能檢測到極弱的條帶（圖2F），其中，β-1,3-葡聚糖酶（Glu）與粒徑較大的橡膠粒子的結合能力明顯強于粒徑小的橡膠粒子；作為橡膠粒子上公認的主要蛋白SRPP和REF在橡膠粒子上含量極其豐富，通過靈敏度弱于化學發(fā)光的BCIP/NBT就可以顯示，并且隨著粒徑減小，SRPP表現出明顯的增加趨勢（圖2G），但REF的含量保持穩(wěn)定，并未隨粒徑大小有明顯變化（圖2H）。由此可見，橡膠粒子上不僅結合大量的高豐度蛋白SRPP和REF，還可以結合胞質中與橡膠粒子凝集相關的3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）和過敏原蛋白Hev b7，同時還能結合黃色體破裂后釋放的內含物中的主要蛋白β-1,3-葡聚糖酶（Glu）和橡膠素（Hev），這些非橡膠粒子自身擁有的蛋白與之結合應該與橡膠粒子執(zhí)行其生物功能有關。

1～5：平均粒徑分別為0.45、0.37、0.22、0.16、0.14 μm的橡膠粒子樣品；M：蛋白質標樣；箭頭為目標蛋白帶。

2.2 不同粒徑橡膠粒子清洗后結合蛋白分析

選取平均粒徑0.45（a）、0.22（b）、0.14（c） μm的橡膠粒子新鮮樣品分散到等滲緩沖液中清洗3次，電泳檢測結果表明（圖3A），大部分蛋白條帶在第一次清洗后明顯減弱，且隨著清洗次數增加進一步減弱，其中分子量大約20 kDa的主要蛋白帶減弱尤其明顯。通過免疫印跡對這些蛋白進行鑒定分析，化學發(fā)光顯示結果表明，C-乳清中的GAPDH（圖3B）和Hev b7（圖3C）在未清洗前，在不同粒徑的橡膠粒子上均能被清晰地檢測到，但清洗1次后，GAPDH蛋白基本消失，僅在平均粒徑0.45 μm的橡膠粒子組分中還有微弱的條帶，而第二次清洗后，該蛋白未能在樣品中檢測到，表明進一步被洗脫；Hev b7條帶明顯強于GAPDH，第一次清洗后，在3種不同粒徑的樣品中都能檢測到，但第二次之后同樣未檢測到。該結果表明這2個蛋白與橡膠粒子的結合不是很穩(wěn)定，容易被洗脫，相對小橡膠粒子而言，這2個蛋白可能與大橡膠粒子的結合更緊密一些。黃色體中的高豐度蛋白β-1,3-葡聚糖酶（Glu）與橡膠粒子尤其是與大粒徑橡膠粒子的結合能力明顯更強（圖3D），在0.45、0.22 μm的橡膠粒子組分中經3次洗脫后仍能檢測到該蛋白。橡膠素（Hev）則主要是其前體被檢測到，并且該蛋白極容易被洗脫（圖3E），幾丁質酶未能檢測到明顯的條帶，表明結合能力較弱（圖3F）。橡膠粒子的主蛋白SRPP和REF通過BCIP/NBT顯示，結果表明，隨著清洗次數的增加，不同粒徑樣品上的SRPP均明顯減少（圖3G），可見，該蛋白與橡膠粒子的結合并不是特別穩(wěn)定。REF的含量雖然清洗后也有減少的趨勢，但總體保持穩(wěn)定，且粒徑越小結合越穩(wěn)定（圖3H）。

2.3 小橡膠粒子體外孵育不同蛋白組分的結合分析

收集平均粒徑0.16 μm的小橡膠粒子分散到等滲緩沖液中后與含不同蛋白組分的樣品孵育，然后分析小橡膠粒子上的結合蛋白，結果表明，小橡膠粒子與不同蛋白組分孵育后，蛋白條帶發(fā)生了明顯的變化（圖4A，圖4B），根據條帶的粗細可知，這些蛋白的含量較高，因此，可以統一通過BCIP/NBT來顯示免疫印跡鑒定的結果（圖4C～圖4I）。GAPDH和Hev b7僅存在于C-乳清以及85%硫酸銨沉淀的C-乳清樣品中，尤其是GAPDH在85%硫酸銨沉淀樣本中得到了高度的濃縮，即豐度明顯增加，在這2個蛋白樣品與小橡膠粒子孵育后，相比對照的微弱結合，這2個樣品中GAPDH結合到小橡膠粒子上的蛋白量明顯增強（圖4C）；Hev b7蛋白同樣大量結合到小橡膠粒子上（圖4D），并且根據85%硫酸銨沉淀樣品中Hev b7的豐度遠低于GAPDH（圖4A），可以推測，Hev b7與小橡膠粒子的結合能力高于GAPDH。黃色體中的高豐度蛋白β-1,3-葡聚糖酶（Glu）與橡膠粒子的結合明顯（圖4E）；橡膠素（Hev）及其前體均被檢測到，表明二者都與小橡膠粒子有結合，鑒于橡膠素在樣品中的豐度極高，但結合量并不太大，可以認為橡膠素與小橡膠粒子的結合能力并不是很強（圖4F）。幾丁質酶也大量存在于B-乳清中，在這樣的混合蛋白樣品中，該蛋白與小橡膠粒子有較好的結合（圖4G）。橡膠粒子的主蛋白SRPP和REF都有明顯的高豐度條帶（圖4H，圖4I），但在與B-乳清孵育的樣品中，SRPP明顯減弱（圖4I），是否存在該蛋白被其他蛋白競爭而脫離橡膠粒子膜這一現象，值得進一步研究。

圖3 清洗對不同粒徑橡膠粒子結合蛋白的影響

3 討論

橡膠粒子作為橡膠樹膠乳中占比最大的細胞器，是天然橡膠合成和貯存的場所，同時也是乳管傷口堵塞物形成的主要參與者。無論是國外學者認為乳管傷口的堵塞是橡膠粒子本身的凝固造成的[21]，還是我國學者比較認同的傷口堵塞的根本原因是傷口末端形成“蛋白質網”堵塞物[29, 31]，其中都離不開橡膠粒子的參與。橡膠粒子具有不同的粒徑，主要分布在0.08～2.00 μm范圍內[19]，極少數高達5～6 μm。通常以0.45 μm為界限，分為大、小橡膠粒子兩大部分[1, 35]，目前，普遍認為數量巨大的小橡膠粒子主要執(zhí)行合成天然橡膠的功能，同時在乳管傷口堵塞中起重要作用[1, 26-27]。

橡膠粒子執(zhí)行生物功能離不開其表面的結合蛋白，目前研究橡膠粒子上的蛋白主要集中在天然橡膠的生物合成上[8-9, 13, 36-38]，對參與膠乳凝集、乳管堵塞方面蛋白的研究較少。本研究分級分離了不同粒徑的橡膠粒子，并對不同粒徑的橡膠粒子上結合的凝集相關蛋白進行了分析，結果表明無論粒徑大小，橡膠粒子都能結合C-乳清中的Hev b7與GAPDH蛋白，根據結合量的高低，可以認為橡膠粒子結合Hev b7的能力強于GAPDH。B-乳清中的3個高豐度蛋白中，β-1,3-葡聚糖酶（Glu）與橡膠粒子的結合能力最強，橡膠素和幾丁質酶結合能力則明顯弱于β-1,3-葡聚糖酶，可見，在與橡膠粒子的結合中β-1,3-葡聚糖酶（Glu）起到更核心的作用，這一結果與SHI等[31]利用表面等離子共振技術（SPR）分析的這幾個蛋白之間的互作能力的結果一致。Hev b7、GAPDH、β-1,3-葡聚糖酶（Glu）、橡膠素和幾丁質酶作為分別存在于胞質和黃色體內部的蛋白質，不是橡膠粒子本身的蛋白，只能是通過蛋白互作等方式結合到橡膠粒子上，通過清洗的方式，本研究發(fā)現這些蛋白可以在溫和的條件下被洗脫，表明這些蛋白與橡膠粒子的結合相對松散。根據清洗的次數和殘留的蛋白量，可以推測出Hev b7和β-1,3-葡聚糖酶（Glu）與橡膠粒子具有更好的結合能力，而橡膠素和幾丁質酶與之結合能力較弱，已有研究表明橡膠素和幾丁質酶這2個蛋白和β-1,3-葡聚糖酶之間存在互作[31]，那么，它們是否是通過β-1,3-葡聚糖酶間接結合到橡膠粒子上而非直接結合到橡膠粒子上值得進一步分析研究。

1～6：依次為黃色體B-乳清、胞質C-乳清、B-乳清85%硫酸銨沉淀蛋白組分、純化的β-1,3-葡聚糖酶（Glu）、C-乳清85%硫酸銨沉淀蛋白組分以及小橡膠粒子樣品；6，對照，小橡膠粒子與緩沖液孵育。M：蛋白質標樣；A圖中泳道3的短箭頭表示高豐度的橡膠素蛋白，泳道5中的長箭表示被濃縮的37 kDa的蛋白，其余箭頭表示免疫印跡的目標蛋白帶。

SRPP和REF作為橡膠粒子自身的標志性蛋白[39-41]，在大、小橡膠粒子上的含量存在差別，以前的觀點認為SRPP在小橡膠粒子上占優(yōu)勢，而REF在大橡膠粒子上占優(yōu)勢[27]，本研究表明，REF在大、小橡膠粒子上的含量差異不明顯，發(fā)生明顯變化的是SRPP，該蛋白主要分布在小橡膠粒子上，膠乳中隨著小橡膠粒子比例的加大，SRPP的含量是增加的。SRPP和REF與橡膠粒子膜結合的牢固程度明顯不同，REF不容易洗脫，而SRPP極易被洗脫，因此，可以認為SRPP在小橡膠粒子上的結合相對松散，容易脫落。小橡膠粒子成長為大橡膠粒子后，膜表面的SRPP基本消失，執(zhí)行功能可能由合成天然橡膠轉化為貯存天然橡膠，SRPP脫落后是否會重新結合到小橡膠粒子表面從而循環(huán)使用也是一個值得研究的問題。

鑒于大、小橡膠粒子都能結合胞質C-乳清和黃色體B-乳清中的凝集相關的蛋白，本研究推測排膠過程中不同大小的橡膠粒子可能都參與了乳管的堵塞，目前研究認為SRPP是橡膠粒子凝集過程中與其他蛋白結合的主要位點[27]，但大橡膠粒子上該蛋白含量極少，是否還有其他蛋白作為錨定位點參與橡膠粒子的凝集值得深入研究。

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Aggregation-related Proteins Binding to Rubber Particles with Different Diameter in Rubber Tree

DING Huan1, WU Shaohua2, XIA Zhihui1, HUANG Xi1, SHI Minjing1,2*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation and Physiology of Tropical Crops, Haikou, Hainan 571101, China

Rubber tree (Muell.Arg.) is an important rubber-producing plant, and thesecondary laticifer in the trunk bark is the major tissue for the synthesis and storage of natural rubber. Natural rubber is ex-tracted from the latex in laticifer by tapping (mechanical wounding) and synthesized by a special organelle, named the rubber particle. Rubber particle is a spherical structure surrounded by a lipid monolayer and membrane-bound proteins, in which the natural rubber is stored. The peripheral membrane is bound to a variety of proteins that are closely related to the functions of rubber particles. At present, there are many studies on proteins related to natural rubber synthesis, but the proteins related to rubber particle aggregation still remains unclear. Using the latex collected from the clone ‘RY7-33-97’ as the material, rubber particles with different particle sizes were obtained by fractionation at different centrifugal speeds. Subsequently, the rubber particle samples were cleaned by buffer for three times and collected for electrophoresis, respectively. The binding proteins on rubber particles were compared and analyzed by Tricine- SDS-PAGE and Western-blotting techniques. There were obvious differences in the content of bound proteins on rubber particles with different particle size. Accompanied by the decrease of rubber particle size, the content of small rubber particle membrane protein (SRPP) increased significantly, while the content of rubber elongation factor protein (REF) remained stable and had little relationship with the rubber particle size. Hevb7 latex allergen protein (Hevb7) and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in C-serum could bind to the rubber particles, and β-1,3-gluca-nase (Glu), hevein (Hev) and chitinase (Chit) in B-serum could also bind to rubber particles, but in which the binding ability of chitinase to rubber particles was the weakest. After cleaning, as the main membrane protein of rubber particles, the content of SRPP decreased significantly with the times of cleaning, but the content of REF protein did not change obviously, indicating that the binding ability of SRPP to rubber particle membrane is not as strong as that of REF. The content of aggluti-nation-related proteins from C-serum and B-serum decreased significantly with the times of cleaning, usually, the pro-teins could not be detected after the second cleaning. Small rubber particles with about 0.16 μm mean diameter were incubated with different protein samples, the results showed that rubber particles could bind a variety of dif-ferent proteins, in which some proteins were related to the aggregation of rubber particles. In this study, the aggregation-related proteins bound to rubber particles with different particle sizes were preliminarily analyzed, the results would lay a foundation for elucidating the mechanism of latex flow of rubber trees.

Muell.Arg.; rubber particle; aggregation-related protein; western blotting

S794.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.003

2022-03-09；

2022-04-22

國家自然科學基金項目（No. 31870590）；海南省基金創(chuàng)新團隊項目（No. 320CXTD442）；國家重點研發(fā)計劃項目（No. 2018YFD1000502）。

丁 歡（1995—），女，碩士研究生，研究方向：農藝與種業(yè)。*通信作者（Corresponding author）：史敏晶（SHI Minjiing），E-mail：pzbsmjzifeng@163.com。