譚德冠 彭晶 付莉莉 孫雪飄 韓冰瑩 張家明

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?571101）

橡膠樹（Hevea brasiliensisMuell.Arg.）屬大戟科橡膠屬，是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)林木。其樹皮被定期開割，樹皮中被割斷的乳管排出牛奶狀膠乳（細(xì)胞質(zhì)），經(jīng)收集和加工后成為重要的工業(yè)原料——天然橡膠[1]。全球商品天然橡膠的99%來源于橡膠樹[2]。

圖1 組織化學(xué)染色法鑒定未授粉胚珠來源的愈傷組織中乳管細(xì)胞

植物乳管是指含有膠乳的高度特化細(xì)胞，是橡膠樹合成和貯存膠乳的場(chǎng)所[3]；橡膠樹莖干樹皮乳管數(shù)量與其產(chǎn)量呈正相關(guān)關(guān)系[4-5]。因此橡膠樹乳管分化機(jī)制的研究成為科技人員的重要課題之一。目前大部分科技人員以橡膠樹樹皮作為模型開展乳管分化機(jī)制的研究并取得一定進(jìn)展。發(fā)現(xiàn)外源茉莉酸（JA）能顯著促進(jìn)樹皮乳管細(xì)胞分化[6]；從橡膠樹中克隆了HbSKP1、HbJA1、HbCOI1、HbLAP1、HblMYC1、HblMYC2、HbEREBP1等[7-10]與JA信號(hào)途徑相關(guān)的基因。一些學(xué)者以橡膠樹的花藥愈傷組織為模型開展乳管分化研究，發(fā)現(xiàn)JA、茉莉酸甲酯（MeJA）也能促進(jìn)愈傷乳管細(xì)胞分化[11-12]。

橡膠樹的未授粉胚珠是其組織培養(yǎng)外植體來源之一[13-14]。與花藥等其他外植體相比，未授粉胚珠具有容易消毒、能完全避免污染的優(yōu)勢(shì)，此外未授粉胚珠與花藥的愈傷組織誘導(dǎo)率相近[15]。因此，以未授粉胚珠來代替花藥等其他外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并以該來源的愈傷組織為模型研究乳管分化機(jī)制，可能具有工作量少、效率高等優(yōu)勢(shì)。目前尚不清楚橡膠樹未授粉胚珠來源的愈傷組織是否存在乳管細(xì)胞及其分化情況。本研究通過組織化學(xué)法、免疫組織化學(xué)法、分子生物學(xué)法證實(shí)未授粉胚珠愈傷組織中存在乳管細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)JA能促進(jìn)未授粉胚珠愈傷乳管細(xì)胞分化，其分化依賴于橡膠樹基因型，為研究乳管分化機(jī)制的模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)三隊(duì)采集橡膠樹品種熱研7-33-97、熱研88-13、熱研8-79的花枝，立即置于4℃冰箱中貯存24 h。

1.2 方法

1.2.1 試材制備用鑷子收集未開放的雌花，75%（V/V）酒精消毒1 min，無菌水清洗1遍，0.1%升汞消毒10 min，無菌水清洗5次。在無菌條件下用解剖針剖開雌花挑出胚珠，接種于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為25℃暗培養(yǎng)。誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的組分是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加2 mg/L 2,4-D，0.5 mg/L 6-BA，1 mg/L NAA，7%（m/V）蔗糖，植物凝膠2.2 g/L，調(diào)整pH至5.8。

1.2.2 組織化學(xué)法鑒定愈傷組織乳管細(xì)胞參照田維敏等[16]報(bào)道的組織化學(xué)法鑒定未授粉胚珠愈傷組織中的乳管細(xì)胞。取培養(yǎng)至70 d的熱研7-33-97未授粉胚珠愈傷組織于80%酒精中室溫固定2 d，酒精系列脫水，60℃下溴-碘溶液染色48 h，冰醋酸清洗2次，再進(jìn)行滲蠟、包埋，滑走切片機(jī)（Leica，德國(guó)）切片，貼片，二甲苯脫蠟，固綠染色，中性樹膠封片。將制備好的切片于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法鑒定愈傷組織乳管細(xì)胞參照Tan等[17]報(bào)道的免疫組織化學(xué)方法鑒定未授粉胚珠愈傷組織中的乳管細(xì)胞。取上述固定好的熱研7-33-97未授粉胚珠愈傷組織，酒精系列脫水后進(jìn)行滲蠟、包埋、切片、貼片，二甲苯脫蠟。將樣品置于95℃的0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液中處理15 min，PBS緩沖液清洗3次，2%牛血清蛋白（BSA）封閉30 min。將樣品置于保濕盒中，加入一抗[小橡膠粒子蛋白（Small Rubber Particle Protein，SRPP）兔抗]，按1:100稀釋于含1% BSA的PBS緩沖液）后4℃處理過夜，PBS緩沖液清洗3次后，加入二抗（羊抗兔，按1:50稀釋于含1% BSA的PBS緩沖液），37℃下處理1 h，PBS緩沖液清洗3次；樣品用DBT/BCIP堿性磷酸酶顯色液浸泡5 min，酒精系列脫水，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 橡膠合成相關(guān)基因片段的擴(kuò)增取培養(yǎng)70 d的熱研7-33-97未授粉胚珠愈傷組織，采用北京TIANGEN公司的RNAprep Pure Plant Kit試劑盒提取其總RNA，再用Thermo Scientific公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。根據(jù)從NCBI網(wǎng)站上查找到與橡膠合成相關(guān)的基因SRPP基因序列（AJ223388）、橡膠延伸因子（Rubber Elongation Factor,REF）基因序列（X56535.1），采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，其中SRPP基因引物對(duì)為SRPP-F（5'-GAAGAGGTGGAGGAAGAG-3'）、SRPP-R（5'-CAAAGGCAAATAA GAGGA-3'），REF基因引物對(duì)為REF-F（5'-GGCTGAAGACGAAGACAA-3'）、REF-R（5'-GCAAAGAAG AAGCCAGAG-3）。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃補(bǔ)平10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及測(cè)序。

1.2.5 JA對(duì)未授粉胚珠愈傷乳管細(xì)胞分化的影響在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上分別加入0、1、2、3、4 mg/L的JA，將熱研7-33-97的未授粉胚珠接種于含不同濃度JA的培養(yǎng)基中，25℃下暗培養(yǎng)。80%酒精固定培養(yǎng)至70 d的各處理愈傷組織，經(jīng)酒精系列脫水，按1.2.2方法進(jìn)行組織化學(xué)染色和制片。光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，統(tǒng)計(jì)不同濃度JA處理的愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率。乳管細(xì)胞發(fā)生頻率=（乳管細(xì)胞數(shù)量/總的細(xì)胞數(shù)量）×100%。

1.2.6 不同橡膠樹基因型對(duì)未授粉胚珠愈傷組織乳管細(xì)胞分化的影響分別取在相同培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下培養(yǎng)70 d的熱研7-33-97、熱研88-13、熱研8-79未授粉胚珠愈傷組織固定于80%酒精中，酒精系列脫水，按1.2.2方法進(jìn)行組織化學(xué)染色和制片。光學(xué)顯微鏡下觀察不同基因型的未授粉胚珠愈傷組織乳管細(xì)胞分化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織化學(xué)法鑒定愈傷組織乳管細(xì)胞

組織化學(xué)法是一種被廣泛應(yīng)用、經(jīng)典的鑒定植物組織中乳管細(xì)胞的方法[18]。當(dāng)培養(yǎng)至70 d時(shí)，未授粉胚珠分化出的愈傷組織呈淺黃色，表面結(jié)構(gòu)緊密（圖1-A）。經(jīng)溴-碘染色液處理后發(fā)現(xiàn)，愈傷組織存在棕色的細(xì)胞(圖1-B、1-C)，這些細(xì)胞為乳管細(xì)胞，其內(nèi)含物橡膠被溴-碘染色液處理后變成不溶于二甲苯的、棕色的變性橡膠。愈傷組織中還存在黑褐色的細(xì)胞，這些細(xì)胞為單寧細(xì)胞（圖1-C），其單寧物質(zhì)被染色液染成黑褐色。此外，愈傷組織中還存在淀粉細(xì)胞（圖1-D），該類細(xì)胞中充滿顆粒狀淀粉。

2.2 免疫組織化學(xué)法鑒定愈傷組織乳管細(xì)胞

為進(jìn)一步驗(yàn)證未授粉胚珠來源的愈傷組織是否存在乳管細(xì)胞，對(duì)該愈傷組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)研究。對(duì)愈傷組織的切片進(jìn)行一抗為SRPP兔抗的處理，該抗體SRPP蛋白能與切片中乳管細(xì)胞的SRPP底物特異結(jié)合，經(jīng)羊抗兔的二抗處理，再經(jīng)DBT/BCIP堿性磷酸酶顯色液顯色發(fā)現(xiàn)，愈傷組織切片中存在藍(lán)黑色的細(xì)胞（圖2），這些細(xì)胞為乳管細(xì)胞。免疫組織化學(xué)法證實(shí)了未授粉胚珠來源的愈傷組織存在乳管細(xì)胞。

圖2 免疫組織化學(xué)法鑒定未授粉胚珠來源的愈傷組織中乳管細(xì)胞

2.3 橡膠合成相關(guān)基因片段的擴(kuò)增

SRPP、REF是附于小橡膠粒子膜的蛋白質(zhì)，它們是參與橡膠生物合成的重要酶和調(diào)控因子，編碼SRPP、REF基因在橡膠樹膠乳細(xì)胞中特異表達(dá)[19-20]。在本研究中，RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，從橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織的cDNA中均能擴(kuò)增出清晰的SRPP、REF基因片段目的條帶（圖3）。經(jīng)測(cè)序分析，SRPP、REF基因片段的目的條帶分別為571、355 bp，經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它們的序列與已知的橡膠樹膠乳表達(dá)的基因序列相一致。這從分子水平上進(jìn)一步證實(shí)未授粉胚珠愈傷組織存在乳管細(xì)胞，它們的功能與樹皮乳管細(xì)胞相類似。

圖3 RT-PCR擴(kuò)增膠乳合成相關(guān)基因片段電泳圖

2.4 JA對(duì)橡膠樹未授粉胚珠愈傷乳管細(xì)胞分化的影響

施加外源JA已被證實(shí)具有促進(jìn)橡膠樹樹皮乳管分化的功能[6]，但目前尚不清楚是否對(duì)未授粉胚珠愈傷組織乳管細(xì)胞具有效果。在本研究中，筆者將不同濃度的JA添加于誘導(dǎo)愈傷的組織培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JA會(huì)顯著影響未授粉胚珠愈傷組織乳管細(xì)胞分化：當(dāng)培養(yǎng)基中JA濃度為1 mg/L時(shí)，愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率增加至8.8%，顯著高于其他處理（圖4）。當(dāng)培養(yǎng)基中JA濃度為2、3 mg/L時(shí)，愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率分別下降至5.8%、5.4%，略低于對(duì)照（6.2%），但三者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著。當(dāng)培養(yǎng)基中JA濃度為4 mg/L時(shí)，愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率下降至2.3%，顯著低于其他處理（圖4）。在JA濃度1～4 mg/L時(shí)，隨著JA濃度升高，愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率呈逐步下降趨勢(shì)（圖4）。這些結(jié)果表明，低濃度的JA能促進(jìn)未授粉胚珠愈傷組織乳管細(xì)胞分化，而高濃度的JA會(huì)抑制未授粉胚珠愈傷組織乳管細(xì)胞分化，其中以JA濃度為1 mg/L效果最佳。

圖4 JA對(duì)未授粉胚珠來源的愈傷組織乳管細(xì)胞分化的影響

2.5 不同橡膠樹基因型對(duì)未授粉胚珠愈傷組織乳管細(xì)胞分化的影響

在培養(yǎng)條件一致的條件下對(duì)3個(gè)橡膠樹品種的未授粉胚珠的愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，不同橡膠樹基因型其未授粉胚珠愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率存在差異。熱研7-33-97與熱研8-79的未授粉胚珠愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率較接近，分別為6.2%與5.9%，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異，但均顯著高于熱研88-13（3.2%）（圖5）。熱研88-13的未授粉胚珠愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率最低，比熱研7-33-97、熱研8-79分別低94%、84%（圖5）。上述結(jié)果表明，未授粉胚珠愈傷組織乳管細(xì)胞分化依賴于橡膠樹基因型。

圖5 不同橡膠樹基因型的未授粉胚珠來源的愈傷組織乳管細(xì)胞分化頻率的比較

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本研究通過組織化學(xué)法、免疫組織化學(xué)法和分子生物學(xué)法證實(shí)未授粉胚珠愈傷組織中存在乳管細(xì)胞；RT-PCR結(jié)果顯示，SRPP、REF基因均能從未授粉胚珠愈傷組織cDNA中擴(kuò)增出來，經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它們的序列與已知的橡膠樹膠乳表達(dá)的基因序列相一致，表明未授粉胚珠愈傷乳管細(xì)胞，能表達(dá)與樹皮乳管細(xì)胞相一致的、與膠乳合成相關(guān)的特異基因；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，未授粉胚珠愈傷乳管細(xì)胞與樹皮乳管細(xì)胞一樣[6,21]，它們的分化受外源JA調(diào)控。這些結(jié)果為橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織可作為研究乳管分化機(jī)制的模型提供充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

目前已報(bào)道的用于研究橡膠樹乳管分化的愈傷組織模型來源于橡膠樹花藥[17]、莖段[5]、葉柄[22]等外植體。橡膠樹長(zhǎng)期生長(zhǎng)在高溫潮濕的環(huán)境下，該環(huán)境富含微生物[23]，其莖段和葉柄均長(zhǎng)期暴露于外界環(huán)境中，環(huán)境中的微生物極易滋生在它們的皮層表面，并可能進(jìn)一步侵染進(jìn)它們的皮層細(xì)胞間/內(nèi)；橡膠樹的花藥在發(fā)育早期被花被緊密包裹，但在發(fā)育至單核期時(shí)，花被包裹花藥并不緊密，外界環(huán)境的微生物會(huì)通過雨水等媒介侵染至花藥中，使花藥組織不再處于無菌環(huán)境。因此以橡膠樹花藥、莖段、葉柄等作為外植體來誘導(dǎo)愈傷組織，存在污染率高的缺點(diǎn)。未授粉胚珠被橡膠樹的子房緊密包裹住，屬無菌環(huán)境，因此以其為外植體來誘導(dǎo)愈傷組織，能完全避免污染現(xiàn)象發(fā)生。同時(shí)未授粉胚珠接種效率遠(yuǎn)高于花藥[15]。因此，以未授粉胚珠來源的愈傷組織為模型，研究橡膠樹乳管細(xì)胞分化機(jī)制，可能具有工作量少、效率高等優(yōu)勢(shì)。

外源JA已被證實(shí)具有促進(jìn)橡膠樹樹皮乳管細(xì)胞分化，從而增加乳管細(xì)胞數(shù)量的功能，但報(bào)道中只具有正調(diào)控橡膠樹乳管分化的效果[6,21]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度JA具有正調(diào)控橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織乳管分化效果，而高濃度JA具有負(fù)調(diào)控橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織乳管分化效果，因此，如果以未授粉胚珠愈傷組織為模型研究乳管分化可能會(huì)獲取更多的生物學(xué)信息。

本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)70 d的橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織中存在乳管細(xì)胞，但該乳管細(xì)胞來源尚不清楚。該乳管細(xì)胞可能由胚珠組織中的乳管細(xì)胞分化產(chǎn)生，也可能由愈傷組織中薄壁細(xì)胞分化產(chǎn)生，因此需要對(duì)未授粉胚珠愈傷組織乳管細(xì)胞的整個(gè)分化過程進(jìn)行系統(tǒng)研究。

自然界中存在12 500種含膠乳植物，它們分屬22個(gè)科900個(gè)屬[24]，但目前尚未有其他植物未授粉胚珠愈傷組織中存在乳管細(xì)胞的報(bào)道。含膠植物乳管細(xì)胞的主要功能是起防御作用，除合成和貯存橡膠外，還會(huì)分泌一些有毒代謝物來保護(hù)植物體免受外來侵害[25]。目前尚不清楚橡膠樹未受粉胚珠愈傷組織的乳管細(xì)胞是否也存在防御功能，需要對(duì)它們的代謝產(chǎn)物成分作深入研究。

3.2 結(jié)論

本研究采用組織化學(xué)法、免疫組織化學(xué)法、分子生物學(xué)法證實(shí)未授粉胚珠愈傷組織中存在乳管細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果顯示，小橡膠粒子蛋白（SRPP）、橡膠延伸因子（REF）基因均能從未授粉胚珠愈傷組織cDNA中擴(kuò)增出，Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它們的序列與已知的橡膠樹樹皮膠乳表達(dá)的基因序列相一致，表明其功能與樹皮乳管細(xì)胞相似。培養(yǎng)基中添加低濃度的茉莉酸(JA)能促進(jìn)未授粉胚珠愈傷組織乳管細(xì)胞分化，而高濃度的JA會(huì)抑制其分化，JA濃度以為1 mg/L效果最佳。橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織乳管細(xì)胞分化依賴于基因型。本研究的結(jié)果為橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織可作為研究乳管分化機(jī)制的模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)促進(jìn)乳管分化機(jī)制研究具有一定意義。