徐俊南 周培森 胡公義 徐慧

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指由各種肺內(nèi)和肺外致病因素導致的急性彌漫性肺損傷和進而發(fā)展的急性呼吸衰竭，臨床表現(xiàn)以進行性呼吸窘迫、頑固性低氧血癥和非心源性肺水腫為特征［1］。研究表明，早期、快速明確ARDS診斷，對改善預后、降低病死率具有重大意義，但目前尚無特異性高的早期診斷及預后評估生物標志物。代謝組學是對生物體內(nèi)所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與病理生理變化的相對關(guān)系研究方式，其在安全性評價、毒性標志物的篩選、疾病診斷等生命科學領(lǐng)域均有廣泛應用［2］。本研究應用代謝組學技術(shù)篩選和檢測ARDS患者潛在的內(nèi)源性標志物，觀察其病理生理變化時引起的機體關(guān)鍵代謝過程中內(nèi)源性物質(zhì)的比例和濃度變化，描繪出這些代謝物的變化信息在ARDS患者發(fā)病過程中特征性的化學痕跡。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年1月至2021年12月本院住院治療的ARDS患者47例，男27例，女20例；年齡（55.3±10.5）歲。納入標準：①有明確誘因1周內(nèi)出現(xiàn)的急性或進展性呼吸困難；②胸部X線平片或胸部CT顯示雙肺浸潤影，不能完全用胸腔積液、肺葉/全肺不張或結(jié)節(jié)影解釋；③呼吸衰竭不能完全用心力衰竭或體液超負荷解釋；④低氧血癥：氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）≤300 mmHg且呼吸機機械通氣參數(shù)PEEP/CPAP不低于5 cmH2O。排除標準：①年齡＜18或＞80歲；②發(fā)病時間＞1周；③明確心功能不全4級以上或已證實為心源性肺水腫；④入院后24 h內(nèi)治療中斷或出院、死亡的患者；⑤妊娠等。患者分別于入院后12 h內(nèi)及好轉(zhuǎn)出院時采肘靜脈血，離心后提取血漿，-70℃冰箱儲存?zhèn)溆?。將符合上述標準的患者根?jù)氧合指數(shù)進行分組：輕度組：200 mmHg＜氧合指數(shù)≤300 mmHg；中度組：100 mmHg＜氧合指數(shù)≤200 mmHg；重度組：氧合指數(shù)≤100 mmHg。另選取同期本院體檢的健康者51例為對照組，其中男28例，女23例；年齡（54.1±11.1）歲。所有患者均由患者家屬或代理人簽署知情同意書，兩組性別、年齡等一般資料差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 方法 （1）常規(guī)實驗室生化指標檢測分析：全自動生化分析儀檢測檢測各組人群血清白細胞計數(shù)（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板（PLT）、國際標準比比值（INR）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、肌酐（Sr），白蛋白（Alb）和血氨等生化指標。（2）超液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析（UPLC-MS/MS）①儀器與條件：采用儀器為ACQUITY UPLC和XEVO TQS-micro三重四級桿超液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（產(chǎn)地：Waters公司，美國）。色譜柱UPLC HSS C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分離，柱溫調(diào)整為40 ℃，不斷優(yōu)化色譜條件，使色譜峰充分分離，標記信噪比＞10的色譜峰，并進行峰面積積分測算。②樣本采集與處理：分別采集健康體檢人群及ARDS患者入院后12 h內(nèi)及出院時肘靜脈全血5 mL，3,000 r/min離心10 min取上清液（血漿），-80℃冰箱保存，供UPLC-MS/MS分析檢測。取100 μL血漿樣品置入1.5 mL EP管中，加入乙腈300 μL，渦旋混合1.0 min，13,000 r/min高速低溫（4℃）離心10 min，取上清液100 μL于進樣瓶中備用，每次取2 μL樣本量用于UPLC-MS/MS檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布計量資料以（±s）表示，用t檢驗；偏態(tài)分布兩組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血氣分析與生化分析結(jié)果比較 與對照組比較，ARDS組患者PaO2水平明顯降低，總膽紅素水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 兩組患者血氣分析及生化指標比較（±s）

表1 兩組患者血氣分析及生化指標比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 pH PaO2 PaCO2 ALT 總膽紅素 Alb Sr對照組（n=51）7.39±0.04 95.4±2.8 40.6±2.2 37.8±10.114.4±3.9 40±5.0 68.6±8.2 ARDS組（n=47）7.37±0.1 70.23±9.9*41.4±6.27 39.4±9.8 34.3±8.9*38.2±4.7 80±6.9

2.2 ARDS患者與正常人群血清代謝產(chǎn)物分析比較 與對照組比較，ARDS組患者血清中丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、?；撬帷⒗野彼岷凸劝彼崦黠@升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者血清代謝產(chǎn)物改變情況比較（±s）

表2 兩組患者血清代謝產(chǎn)物改變情況比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

代謝產(chǎn)物 對照組（n=51） ARDS組（n=47）丙氨酸 0.428±0.076 0.471±0.059**苯丙氨酸 0.523±0.072 0.532±0.082賴氨酸 0.511±0.076 0.577±0.092**絲氨酸 0.486±0.080 0.495±0.063精氨酸 0.251±0.070 0.290±0.092*脯氨酸 0.772±0.075 0.863±0.096**蘇氨酸 0.694±0.076 0.772±0.099*乙酰丙酸 0.789±0.079 0.814±0.086牛磺酸 0.304±0.085 0.364±0.109**酪氨酸 0.688±0.067 0.720±0.067*谷氨酸 0.702±0.080 0.960±0.112**

2.3 不同嚴重程度ARDS患者血清代謝產(chǎn)物分析比較 與輕度組比較，中度組、重度組ARDS患者血清中賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、?；撬?、谷氨酸明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同嚴重程度ARDS患者血清代謝產(chǎn)物比較（±s）

表3 不同嚴重程度ARDS患者血清代謝產(chǎn)物比較（±s）

注：*P＜0.05，**P＜0.01

代謝產(chǎn)物 輕度組（n=24） 中度組（n=15） 重度組（n=8）丙氨酸 0.450±0.046 0.486±0.060 0.503±0.072苯丙氨酸 0.512±0.084 0.530±0.073 0.594±0.067賴氨酸 0.526±0.065 0.587±0.054* 0.715±0.069**絲氨酸 0.487±0.069 0.491±0.052 0.525±0.062精氨酸 0.240±0.070 0.307±0.070* 0.407±0.072*脯氨酸 0.794±0.069 0.920±0.068** 0.960±0.037*蘇氨酸 0.712±0.092 0.811±0.053** 0.882±0.036*乙酰丙酸 0.791±0.078 0.831±0.103 0.848±0.065牛磺酸 0.296±0.086 0.393±0.068** 0.516±0.031**酪氨酸 0.698±0.075 0.735±0.054 0.758±0.037谷氨酸 0.881±0.075 1.016±0.071** 1.090±0.079*

2.4 重度ARDS患者入院時與出院時血清代謝產(chǎn)物分析比較 與入院時比較，出院時重度ARDS患者血清中賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、?；撬?、谷氨酸表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 重度ARDS患者入院和出院時血清代謝產(chǎn)物比較（±s）

表4 重度ARDS患者入院和出院時血清代謝產(chǎn)物比較（±s）

代謝產(chǎn)物 入院時 出院時 P值賴氨酸 0.715±0.069 0.513±0.099 0.001精氨酸 0.407±0.072 0.210±0.060 ＜0.001脯氨酸 0.960±0.037 0.736±0.101 ＜0.001蘇氨酸 0.882±0.036 0.625±0.117 0.001?；撬?0.516±0.031 0.301±0.046 ＜0.001谷氨酸 1.090±0.079 0.779±0.093 ＜0.001

3 討論

近年來，對ARDS防治進行了大量的研究，包括俯臥位通氣、肺保護性通氣以及綜合性對癥支持治療等對ARDS患者預后具有重要意義［3］。但仍有部分研究報道ARDS患者病死率達40%以上［4］。早期準確診斷并給予強有力干預是當前防治的重要途徑。而目前缺少ARDS的特異性診斷方法，現(xiàn)有的診斷標準較為復雜，臨床實際應用具有一定的困難。本研究結(jié)果顯示，常規(guī)血液檢查中僅氧分壓和膽紅素水平在ARDS患者中比對照組明顯升高。UPLC-MS / MS檢測能夠高效、靈敏、準確探索分析未知化合物，對疾病的早期診斷、預測具有重要意義［5-6］。本研究采用UPLC-MS / MS技術(shù)檢測ARDS患者和正常人群血清成分，共檢測出11種代謝物，其中丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、牛磺酸、酪氨酸和谷氨酸水平明顯升高。進一步對ARDS患者進行分層發(fā)現(xiàn)，中、重度組ARDS患者較輕度組患者血清中賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、牛磺酸和谷氨酸明顯升高。

谷氨酸屬于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在急性肺損傷中具有重要作用。谷氨酸激動劑N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）通過肺泡毛細血管區(qū)域NMDA受體介導興奮毒性從而引起肺水腫。谷氨酸信號可以引起一氧化氮（NO）的產(chǎn)生和細胞凋亡。進一步研究谷氨酸信號在肺毒性中的生理作用可以揭示ARDS的更多機制。ARDS本質(zhì)是多種炎癥細胞（巨噬細胞、中性粒細胞、血小板內(nèi)皮細胞、血小板）及其釋放的炎癥介質(zhì)和細胞因子間接介導的肺臟炎癥反應，引起肺毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞損傷，肺泡膜通透性增加，引起肺間質(zhì)和肺泡水腫［7］。研究表明，高濃度?；撬峥赡軙档虯RDS發(fā)病過程中的自由基產(chǎn)生［8］。?；撬崾鞘戎行粤＜毎械囊环N內(nèi)源性含硫氨基酸，具有抗炎特性的抗氧化劑的保護作用。?；撬峥赡芡ㄟ^減弱中性粒細胞與內(nèi)皮的相互作用來減輕白介素-2誘導的肺損傷。因此，牛磺酸在ARDS中的升高是抑制炎癥反應的一個指標。精氨酸是NO的唯一生物合成前體。精氨酸上調(diào)可能與人體防御機制有關(guān)，增加NO從而緩解與缺氧相關(guān)的疾病。賴氨酸水平在ARDS中升高，可能在ARDS中具有防御作用。研究表明，其具有減少NO作用，能夠增加血管抵抗力［9］。蘇氨酸是一種糖異生氨基酸，與膿毒癥有關(guān)。其通過產(chǎn)生抗體來調(diào)節(jié)免疫反應，觸發(fā)淋巴細胞增殖，在抑制細胞凋亡中起著重要作用。脯氨酸是一種蛋白質(zhì)生成的仲氨基酸，在炎癥微環(huán)境中作為應激底物發(fā)揮著相關(guān)作用。據(jù)報道，慢性肺疾病的氣道重塑會產(chǎn)生脯氨酸［10］。

上述代謝產(chǎn)物有助于確定不同嚴重程度的ARDS患者狀態(tài)。對ARDS的診斷及病情評估具有重要意義，但仍需要進一步大量樣本前瞻性的驗證。