段?；?，王光明

大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院基因檢測中心，云南 大理 671000

胃癌(gastric cancer，GC)作為消化系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，是全球第五大最常見的腫瘤和第四大最常見的癌癥死亡原因。截至2020年全球有超過100萬新發(fā)GC病例和近80萬GC患者死亡[1]。中國癌癥報(bào)告顯示，GC的發(fā)病率位居全國第二且呈現(xiàn)年輕化的特點(diǎn)，新發(fā)病例約為40.3萬例[2]。由于缺乏早期診斷標(biāo)志物，大部分胃癌患者被確診時(shí)已處在晚期階段，其預(yù)后較差[3]。因此研究GC預(yù)后的機(jī)制，挖掘關(guān)鍵基因，尋求對GC更敏感的生物標(biāo)志物，對改善GC患者的總體生存期至關(guān)重要。

腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden，TMB)是指一份腫瘤樣本中，所評估基因的外顯子編碼區(qū)每兆堿基中發(fā)生置換和插入/缺失突變的總數(shù)[4]。有研究表明，具有較高突變負(fù)荷的腫瘤能夠在腫瘤細(xì)胞表面募集到更多的新抗原，增加腫瘤的免疫原性，提高免疫治療的療效[5]。腫瘤基因突變具有高度特異性，不同患者之間存在不同的基因突變圖譜，而TMB可能是多種實(shí)體腫瘤免疫治療結(jié)局的潛在生物標(biāo)志物。近年來，越來越多的研究數(shù)據(jù)表明TMB是免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)的新型生物標(biāo)志物，能夠預(yù)測免疫治療的療效[6]。2020年6月17日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)TMB-H(TMB≥10 Muts/Mb)作為篩選癌癥患者的分子生物標(biāo)志物。因此，本研究旨在評估TMB在GC患者中的預(yù)后價(jià)值及其與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 資料獲取 利用TCGA官網(wǎng)推薦的下載軟件GDC-client從基因組數(shù)據(jù)共享(Genomic Data Commons，GDC)平臺下載GC患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中胃癌樣本375例，正常樣本32例、運(yùn)用Strawberry Perl 5.32.1軟件將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整理成基因表達(dá)矩陣文件。收集相應(yīng)的臨床信息包括年齡、性別、AJCC-TNM分期、病理分期、腫瘤分級和生存狀況等將其整理成R軟件可以識別的數(shù)據(jù)格式(XML格式)。突變數(shù)據(jù)經(jīng)過VarScan軟件處理，并使用“maftools”包進(jìn)行可視化突變基因和突變分型。

1.2 TMB的計(jì)算 通過JAVA8平臺的Perl腳本計(jì)算每個樣本的TMB值，表達(dá)為體細(xì)胞突變總數(shù)/測序區(qū)域大小，單位為mutations/Mb。

1.3 TMB突變情況及高TMB組和低TMB組生存分析 所有腫瘤樣本的高TMB組和低TMB組由中位TMB分?jǐn)?shù)定義，利用R軟件“survival”包分析兩組之間生存率的差異。并使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)來評估TMB水平與臨床特征之間的相關(guān)性。

1.4 篩選差異表達(dá)基因 根據(jù)前文所述，GC患者分為了高TMB組和低TMB組。差異表達(dá)基因(DEGs)由“l(fā)imma”包識別，采用熱圖展示分析結(jié)果。DEGs的熱圖是通過“pheatmap”包得出，“org.Hs.eg.db”包用于注釋DEGs。

1.5 基因通路富集分析 利用R語言對獲得的差異基因進(jìn)行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)和GO(gene oncology)富集分析。當(dāng)P＜0.05，錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)＜0.05，則認(rèn)為富集的基因集有臨床意義，結(jié)果以柱狀圖的形式輸出。

1.6 篩選差異免疫基因及構(gòu)建預(yù)后模型 從ImmPort數(shù)據(jù)庫(https://www.immport.org/)下載免疫相關(guān)基因的列表，再利用“Limma”包找出分組后差異表達(dá)基因，取兩者交集后將得到的差異免疫基因通過“VennDiagram”包進(jìn)行可視化。采用“Survival”包對差異免疫基因進(jìn)行單變量Cox回歸分析找出與預(yù)后相關(guān)的基因。多變量Cox回歸分析構(gòu)建基因預(yù)后模型，并將得到Cox模型進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，生成ROC(receiver operating characteristic)曲線以評估TMB預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評分的預(yù)測值。

1.7 免疫細(xì)胞浸潤及免疫相關(guān)生存分析 基于TIMER數(shù) 據(jù) 庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)的“SCNA”模塊，用箱形圖比較不同免疫細(xì)胞浸潤和參與模型構(gòu)建的4個基因拷貝數(shù)的變化。最后，使用“survival”模塊，分別繪制6種免疫細(xì)胞在高、低浸潤組中的Kaplan-Meier圖。并對每個圖中的兩組生存曲線通過Log Rank檢驗(yàn)獲得P值，以探究免疫細(xì)胞浸潤水平與其生存的關(guān)系。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)可視化和差異分析由“l(fā)imma”R包執(zhí)行。Cox回歸分析和Kaplan-Meier分析由“Survival”R包進(jìn)行。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)是一種非參數(shù)檢驗(yàn)，用于檢測兩組之間的差異。單、多因素COX回歸分析差異表達(dá)的基因進(jìn)行預(yù)后分析。通過Log Rank檢驗(yàn)獲得P值，分析免疫細(xì)胞浸潤水平與其生存的關(guān)系。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均在R軟件(版本3.6.3)上進(jìn)行。以P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者基因突變情況 本研究總共收集433例GC患者體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)，其中387例樣本存在變異，如圖1A所示的錯義突變是最常見的突變類別，單核苷酸多態(tài)性變異所占的比例最多。將單核苷酸變異分為6類，結(jié)果顯示C＞T突變在GC中的發(fā)生率最高(91 939)。每個樣本的變異數(shù)從0到5 612不等，中位數(shù)為89。瀑布圖顯示了前30個突變基因及其在突變類別方面的狀態(tài)(圖1B)。前20個突變基因如下：TTN、TP53、MUC16、ARID1A、LRP1B、SYNE1、FLG、FAT4、CSMD3、PCLO、DNAH5、KMT2D、FAT3、OBSCN、HMCN1、RYR2、ZEFX4、SPTA1、CSKMD1和PIK3CA。筆者使用交互圖來顯示前20個突變基因之間的共性和互斥性(圖1C)。綠色代表突變基因之間的共突變關(guān)系，而棕色代表基因之間的互斥關(guān)系?；蛟茍D(圖1D)可以突出顯示突變較多的基因。

圖1 胃癌基因突變?nèi)皥D

2.2 TMB在GC中的預(yù)后價(jià)值 通過Perl腳本計(jì)算每個GC樣本的TMB分?jǐn)?shù)，根據(jù)中位TMB值將胃癌樣本分為TMB高組(n=183)和TMB低組(n=184)，進(jìn)行Kaplan-Meier分析，結(jié)果表明TMB高組與更好的生存結(jié)果相關(guān)(P=0.017，圖2A)。另外，筆者進(jìn)一步比較了不同臨床特征之間TMB的差異。在具有以下特征的GC患者中觀察到高水平的TMB(圖2)：65歲以上(P＜0.001，圖2B)，女性(P=0.033，圖2C)，StageⅠ～Ⅱ(P=0.044，圖2E)，T1～2分期(P=0.039，圖2F)，N0(P=0.018，圖2G)。但是，TMB值與M分期(P=0.104，圖2H)或G1～G2分級(P=0.051，圖2D)的相關(guān)性未觀察到顯著差異。

圖2 TMB與臨床特征相關(guān)性

2.3 高TMB組和低TMB組間的DEGs比較和基因富集分析 本研究總共收獲了816個DEGs，將兩組之間的DEGs通過熱圖進(jìn)行可視化(圖3A)。還進(jìn)行了GO和KEGG富集分析，用柱狀圖(圖3B、3C)表示。柱狀圖的橫坐標(biāo)表示富集在GO/KEGG上的基因數(shù)目，縱坐標(biāo)表示GO/KEGG的名稱，其中GO富集可分為BP、CC和MF。圖3B結(jié)果顯示GO富集中以肌肉系統(tǒng)的形成與含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)的通路富集較顯著，圖3C結(jié)果顯示在KEGG富集中以神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路富集最為顯著。

圖3 高TMB組和低TMB組間的DEGs比較和TMB相關(guān)的富集基因集

2.4 高TMB組和低TMB組GC患者的免疫細(xì)胞浸潤比較 根據(jù)TMB水平將GC患者分為兩組，通過“CIBERSORT”R包比較高TMB和低TMB組中的22個免疫細(xì)胞。每個GC患者中22個免疫細(xì)胞的比例如圖4A所示，不同的顏色代表不同的免疫細(xì)胞類型。此外，小提琴圖(圖4B)用于可視化免疫細(xì)胞比例。Wilcoxon's rank-sum檢驗(yàn)顯示，活化CD4+記憶T細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、靜息NK細(xì)胞、M0和M1巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞的高TMB組浸潤高于低TMB組。數(shù)據(jù)庫中免疫相關(guān)基因與差異基因相結(jié)合并利用“VennDiagram”包篩選出97個差異免疫基因(圖4C)。進(jìn)行單因素Cox回歸分析并進(jìn)一步鑒定了12個與預(yù)后相關(guān)的基因(表1)。進(jìn)行多因素Cox回歸分析后篩選出APOD、FGF7、AMHR2、NPR3 4個基因來構(gòu)建預(yù)后模型。將得到的預(yù)后模型行Kaplan-Meier生存分析，其結(jié)果顯示：APOD、FGF7、AMHR2和NPR3基因的生存曲線中高、低表達(dá)組患者的預(yù)后存在顯著差異，其中APOD、FGF7、AMHR2基因高表達(dá)組的生存時(shí)間更長(圖5A～5C)，NPR3基因低表達(dá)組的生存時(shí)間更長(圖5D)。最后，根據(jù)Cox回歸分析構(gòu)建預(yù)后算法，結(jié)果顯示低風(fēng)險(xiǎn)組患者與更好的生存預(yù)后相關(guān)(圖5E)。繪制ROC曲線，以曲線下面積(AUC)=0.642來驗(yàn)證預(yù)后模型的準(zhǔn)確性(圖5F)。

圖4 高、低TMB組與浸潤免疫細(xì)胞的相關(guān)性

圖5 胃癌預(yù)后相關(guān)基因的生存分析

表1 免疫相關(guān)的DGEs單因素Cox回歸分析

2.5 預(yù)后相關(guān)基因CNV與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系 基于TIMER數(shù)據(jù)庫的“SCNA”模塊，用箱形圖(圖6A～6D)描述了GC患者中AMHR2、APOD、FGF7、NPR3這4個預(yù)后相關(guān)基因的拷貝數(shù)變異與免疫細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性。該模塊將樣本以基因拷貝數(shù)變化來分組，把6種免疫細(xì)胞浸潤情況展現(xiàn)出來，圖例中的拷貝數(shù)由5種顏色來區(qū)分。圖6A表明AMHR2基因的拷貝數(shù)缺失與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞的浸潤水平相關(guān)。圖6B表明APOD基因獲得拷貝數(shù)與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞的浸潤水平相關(guān)。圖6C表明FGF7基因的拷貝數(shù)缺失與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞浸潤水平相關(guān)。圖6D表明NPR3基因獲得拷貝數(shù)與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞的浸潤水平相關(guān)。

圖6 AMHR2、APOD、FGF7、NPR3基因拷貝數(shù)變異與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

2.6 不同免疫細(xì)胞浸潤情況下生存分析 通過Cox回歸分析影響GC患者生存結(jié)果的免疫細(xì)胞類型。圖7展示的是6種免疫細(xì)胞在高、低浸潤組的生存分析，結(jié)果顯示GC患者較差的生存結(jié)果與高巨噬細(xì)胞浸潤相關(guān)。

圖7 6種免疫細(xì)胞高、低浸潤組與生存的關(guān)系

3 討論

近年來免疫治療成為治療腫瘤疾病的一種創(chuàng)新方法，為腫瘤患者帶來了希望。其中ICIs發(fā)揮著舉足輕重的作用，但只有15%～20%的患者對免疫療法有反應(yīng)[7]。若有更好的新型生物標(biāo)志物來篩選適合免疫治療的腫瘤患者，并對這部分患者進(jìn)行針對性的免疫治療，其治療效果可能會更佳。目前，在胃癌ICIs治療中用于療效預(yù)測的指標(biāo)有PD-L1、EBV陽性、高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定、腫瘤突變、腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞及基因表達(dá)譜等。其中針對程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD-1)及其配體(PD-L1)的ICIs已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，如派姆單抗、納武單抗能夠使胃癌患者獲得有效且持久的臨床反應(yīng)。但臨床研究發(fā)現(xiàn)，仍有部分胃癌患者存在ICIs治療不敏感或治療抵抗現(xiàn)象[8-9]。所以，尋找更好地預(yù)測ICIs療效的生物標(biāo)志物，對提高GC患者免疫治療效果至關(guān)重要。

TMB是一種很有前景的ICIs治療標(biāo)志物，已被發(fā)現(xiàn)在預(yù)測免疫療法的反應(yīng)方面有著重要作用。YARCHOAN等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在接受PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的腫瘤患者，TMB與ICIs治療客觀反應(yīng)率呈正相關(guān)，高TMB患者客觀反應(yīng)率明顯升高。RIZVI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TMB＞50%的患者比TMB≤50%的患者臨床受益率更好。一項(xiàng)前瞻性臨床試驗(yàn)對54例接受特瑞普利單抗治療的化療抵抗性胃癌患者進(jìn)行TMB分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高TMB患者的客觀反應(yīng)率和總體生存期均高于低TMB患者[12]。上述研究表明，TMB可作為ICIs療效的預(yù)測指標(biāo)，在預(yù)測胃癌ICIs療效上扮演著重要的角色。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫總結(jié)了GC患者的突變基因組景觀，其中前3個突變基因是TTN、TP53和MUC16。TP53是研究最廣泛的抑癌基因之一，其突變不僅消除了p53的腫瘤抑制功能，還產(chǎn)生某些促癌蛋白[13]。TTN是已知最長的基因，會影響心臟和骨骼肌的發(fā)育與調(diào)節(jié)，已被證實(shí)與TMB水平和實(shí)體瘤中對ICIs的反應(yīng)高度相關(guān)[14]。MUC16是各種癌癥中最常見的突變基因之一，與癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移增強(qiáng)有關(guān)[15]。近期，有學(xué)者提出MUC16與高TMB和GC的良好預(yù)后相關(guān)[16]。本研究還分析了GC患者TMB值與生存率之間的關(guān)系，結(jié)果表明高TMB組的GC患者具有更好的生存結(jié)果，這一發(fā)現(xiàn)與其他癌癥研究一致。并觀察到高TMB 組與 GC 病例中的年齡、女性、Stage Ⅰ～Ⅱ、T1～2分期以及N0相關(guān)。本研究通過“l(fā)imma”包確定了816 個 DEGs，將得到的 DEGs 進(jìn)行 GO 和 KEGG 富集分析，結(jié)果顯示這些DEGs主要參與神經(jīng)活性配體-受體相互作用、肌肉系統(tǒng)形成和含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)通路。通過進(jìn)一步的單變量和多變量Cox 分析篩選出與GC 患者預(yù)后相關(guān)的基因AMHR2、APOD、FGF7 和NPR3 來構(gòu)建預(yù)后模型。研究結(jié)果顯示，這4個基因的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)這部分基因的突變與免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)。

免疫細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中很大一部分的浸潤細(xì)胞，通過釋放炎癥細(xì)胞因子和趨化因子與腫瘤細(xì)胞相互作用，從而驅(qū)動癌癥的生物學(xué)行為并影響其對免疫療法的治療作用。在本研究中，筆者探討了TMB值與GC患者免疫浸潤之間的潛在關(guān)系。通過比較發(fā)現(xiàn)高TMB 和低TMB 組之間的22 個免疫細(xì)胞中CD4+記憶T 細(xì)胞、濾泡輔助 T 細(xì)胞、靜息 NK 細(xì)胞、M0 和 M1 巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在兩組中的浸潤情況存在差異。高TMB 組中3 種免疫細(xì)胞(CD8+T 細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和Tfh 細(xì)胞)的豐度明顯高于低TMB 組。為了進(jìn)一步研究兩組的差異是否會影響GC患者的生存結(jié)果，還進(jìn)行了Cox 回歸分析研究，結(jié)果表明，高巨噬細(xì)胞浸潤與GC患者較差的生存結(jié)果相關(guān)。YU等[17]也得出了類似的結(jié)論，高密度的巨噬細(xì)胞浸潤與GC患者生存結(jié)果不佳顯著相關(guān)。多項(xiàng)研究探討了巨噬細(xì)胞和GC細(xì)胞的相互作用，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可能在促進(jìn)GC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫侵襲中發(fā)揮作用[18-21]。

本研究還存在一些局限性：首先，研究中所有樣本和臨床數(shù)據(jù)都是基于TCGA數(shù)據(jù)庫收集的，沒有采用外部數(shù)據(jù)庫如GEO 數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus database) 或其他大樣本的隊(duì)列進(jìn)行驗(yàn)證研究結(jié)果；其次，分析了TMB與浸潤性免疫細(xì)胞的關(guān)系，但缺乏免疫組織化學(xué)等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來確定四個預(yù)后相關(guān)基因與免疫細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性；最后，研究中繪制的 ROC 曲線，其曲線下面積AUC=0.642，AUC＜0.7。因此，需要更多的臨床數(shù)據(jù)來提高預(yù)測效果。

總之，本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)高巨噬細(xì)胞浸潤預(yù)示胃癌患者預(yù)后較差，高TMB與胃癌患者更好的生存預(yù)后相關(guān)。因此，高TMB患者接受免疫治療效果更好，能延長患者的生存期。