曹博雅，陳家黎，石曉溪，李東岳，盧令慧，高 闊，王 偉，曹俊嶺, 5，張 建

復(fù)方丹參滴丸調(diào)控LOX-NF-κB炎癥途徑治療心肌缺血的機制研究

曹博雅1，陳家黎2，石曉溪3，李東岳2，盧令慧2，高 闊2，王 偉4，曹俊嶺1, 5*，張 建6*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029 4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510700 5. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100029 6. 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029

基于動物心肌缺血模型及體外心肌細胞損傷模型探究復(fù)方丹參滴丸調(diào)控脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）-核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途徑抑制炎癥反應(yīng)治療心肌缺血的作用機制。采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)制備大鼠心肌缺血模型，心電圖檢測心肌缺血情況；Western blotting檢測心肌組織LOX途徑關(guān)鍵酶LOX5、LOX12、LOX15及下游分子p-NF-κB p65和白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的蛋白表達。體外培養(yǎng)H9c2心肌細胞，采用缺氧缺糖6 h誘導(dǎo)心肌細胞損傷模型，熒光倒置顯微鏡下觀察心肌細胞形態(tài)；MTT法檢測細胞活力；Western blotting檢測LOX-NF-κB途徑相關(guān)蛋白表達。復(fù)方丹參滴丸顯著抑制心肌缺血大鼠心肌組織中LOX5、LOX12、LOX15和IL-1β的蛋白表達及NF-κB p65的磷酸化水平（＜0.01、0.001）。體外細胞實驗結(jié)果顯示復(fù)方丹參滴丸明顯改善H9c2心肌細胞缺氧缺糖損傷，顯著提高心肌細胞存活率（＜0.01、0.001），降低LOX5、LOX12、LOX15和IL-1β的蛋白表達及NF-κB p65的磷酸化水平（＜0.05、0.01、0.001）。復(fù)方丹參滴丸可通過抑制LOX-NF-κB炎癥途徑減輕心肌缺血損傷。

復(fù)方丹參滴丸；心肌缺血；炎癥；脂氧合酶；核因子-κB

心肌缺血性損傷是全球心血管疾病死亡的十大主要原因之一，是危害人類健康的最常見、最嚴(yán)重的疾病之一[1]。心肌缺血是指心臟血液灌注減少，心臟供氧量降低，心肌能量代謝異常，從而不能維持心臟正常功能的病理狀態(tài)[1-2]。心肌缺血會引發(fā)心臟病理性炎癥，持續(xù)失調(diào)的炎癥反應(yīng)會加重心肌組織損傷，導(dǎo)致心肌缺血最終發(fā)展為心衰[3-4]。研究表明，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）途徑介導(dǎo)的花生四烯酸代謝及其代謝產(chǎn)物引發(fā)的炎癥反應(yīng)與心肌缺血密切相關(guān)[5-8]。LOX是參與花生四烯酸代謝的關(guān)鍵酶之一，在刺激炎癥反應(yīng)中起重要作用[9]。經(jīng)LOX代謝途徑產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物白三烯（leukotrienes，LTs）是炎癥反應(yīng)中的炎性介質(zhì)之一，具有增加血管通透性、引起血漿滲出和白細胞趨化等功能[10]，這些產(chǎn)物還會觸發(fā)炎癥信號級聯(lián)反應(yīng)如核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活[11-12]，NF-κB在機體的免疫反應(yīng)、炎癥過程中參與調(diào)節(jié)細胞凋亡、增殖及應(yīng)激反應(yīng)，是細胞內(nèi)的關(guān)鍵信號通路之一[13-16]，且NF-κB信號通路對于誘導(dǎo)各種炎癥相關(guān)細胞因子和介質(zhì)至關(guān)重要，包括白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等[17-18]。研究表明，抑制炎癥反應(yīng)及減少炎癥因子釋放可治療心肌缺血[19-22]。因此，抑制炎癥反應(yīng)可以是減輕心肌缺血損傷的有效策略之一。

復(fù)方丹參滴丸由丹參、三七和冰片3味中藥組成，具有活血化瘀、理氣止痛的功效，主治氣滯血瘀所致的胸痛，是中醫(yī)治療冠心病、心絞痛等心臟疾病的常用藥。大量研究表明，復(fù)方丹參滴丸具有抗炎[23]、促進冠脈微循環(huán)[24]、抑制血小板活化和聚集[25-26]、改善心肌能量代謝[27-28]等多種藥理活性，但其通過抗炎而抑制心肌缺血損傷的機制尚不完全清楚?；贚OX-NF-κB炎癥途徑在介導(dǎo)心肌缺血損傷中的重要作用，本研究探究了復(fù)方丹參滴丸通過抗炎而治療心肌缺血的作用機制。

1 材料

1.1 動物與細胞

48只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～240 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK（京）-2016-0006。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物房，溫度（23±2）℃，濕度（40±5）%，12 h光照和黑暗循環(huán)，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號BUCM-4-2021100904-4166）。

H9c2大鼠心肌細胞購自北京協(xié)和細胞庫。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方丹參滴丸（批號Z10950111）購自天津天士力醫(yī)藥集團股份有限公司；卡維地洛（批號0K0254D26）購自齊魯制藥有限公司；戊巴比妥鈉購自德國Merck公司；Zileuton（批號15663）購自美國MCE公司；PD146176（批號4079269）、黃芩素（批號MKCL8512）購自美國Sigma公司；胎牛血清（批號2059461RP）、DMEM培養(yǎng)基（批號8121011）、青霉素/鏈霉素雙抗（批號2240831）、0.25%胰酶（批號2188970）購自美國Invitrogen公司；Earle’s平衡鹽溶液（批號H23N11B131963）購自上海源葉生物科技有限公司；MTT（批號20200606）購自北京百瑞極生物科技有限公司；2.5 L厭氧產(chǎn)氣袋（批號0176LJ-4）和2.5 L密封厭氧罐（批號C-31）購自日本三菱公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號2021J1DP1511）、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（批號02511800）、ECL超敏發(fā)光液（批號2021F0CP1050）購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；LOX5抗體（批號ab169755）、LOX15抗體（批號ab244205）、磷酸化NF-κB p65（S536）抗體（批號ab76302）、IL-1β抗體（批號ab254360）購自英國Abcam公司；NF-κB p65抗體（批號80979-1-RR）購自美國Proteintech公司；LOX12抗體（批號PA578760）購自美國Invitrogen公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號AB0037）購自上海泊灣生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG多克隆抗體（批號C1309）購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；Epoch酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；ECLIPSE TE2000-S型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；Mini-PROTEAN Tetra電泳及電轉(zhuǎn)設(shè)備、ChemiDocTMMP凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 體內(nèi)實驗

2.1.1 分組、造模與給藥 48只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為假手術(shù)組、模型組、復(fù)方丹參滴丸（170 mg/kg，臨床等效劑量）組和卡維地洛（25 mg/kg，臨床等效劑量）組，每組12只。大鼠ip 1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定，手術(shù)區(qū)備皮，用碘伏消毒，進行氣管插管，連接呼吸機，呼吸機參數(shù)：潮氣量6 mL，呼吸頻率80次/min，呼吸比1∶2。于3、4肋間逐層開胸暴露心臟，破心包膜，取5/0手術(shù)縫合線于左心耳下2 mm處結(jié)扎冠狀動脈左前降支，在心臟表面滴1滴利多卡因，清除胸腔血污，用2/0縫合線逐層關(guān)胸，脫離呼吸機。大鼠ip利多卡因0.2 mL、呋塞米0.2 mL、青霉素鈉（4×105U/kg）。待手術(shù)后的大鼠恢復(fù)自主呼吸后置于電熱毯上至蘇醒。假手術(shù)組對冠狀動脈左前降支只穿線不結(jié)扎，其他步驟相同。

術(shù)后對大鼠行心電圖檢測，將麻醉后的大鼠仰臥位固定，參照人十二導(dǎo)聯(lián)心電圖連接電極，設(shè)定走紙速度25 min/s，出現(xiàn)6～8個導(dǎo)聯(lián)病理性Q波為造模成功，剔除未成模的動物。術(shù)后24 h各給藥組開始ig藥物，假手術(shù)和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d，保持每天給藥時間一致。

2.1.2 大鼠心電監(jiān)測、心臟取材及心臟損傷觀察 在給藥的第5天對大鼠行心電圖檢測，觀察藥物是否在缺血的急性期就已發(fā)揮心肌保護作用。在缺血恢復(fù)期給藥后的第14天進行心臟組織取材，手術(shù)剪開胸，取出全心，置于預(yù)冷生理鹽水中泵凈心臟中殘留的血液，冰上剔凈心耳和其他殘余組織，各組典型心臟形態(tài)拍照記錄。切取梗死邊緣區(qū)組織，液氮速凍保存，留作Western blotting檢測。假手術(shù)組心臟在與模型組相同位置做相同處理。

2.1.3 Western blotting檢測大鼠心肌組織相關(guān)蛋白表達 使用RIPA裂解液（100 g/L）和手持勻漿器將心肌組織破碎成組織勻漿液，于4 ℃、12 000×離心10 min，取上清。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，完成定量后100 ℃煮沸變性10 min，冷卻后儲存于?20 ℃冰箱。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，封閉后，分別孵育相應(yīng)的一抗和二抗后曝光并顯影，采用Image J軟件進行灰度值分析。

2.2 體外實驗

2.2.1 細胞培養(yǎng) H9c2細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細胞融合度為90%時傳代。

2.2.2 氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型的建立 H9c2細胞培養(yǎng)到實驗所需的密度，棄去原有培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入Earle’s無糖平衡鹽溶液，放入缺氧小室內(nèi)，并放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋，蓋緊缺氧小室的盒蓋，放入培養(yǎng)箱進行缺氧缺糖造模，時間分別為0、4、6、8 h，然后從缺氧小室中取出，選取當(dāng)細胞活力為50%左右的造模時間進行后續(xù)實驗。

2.2.3 細胞分組與給藥

（1）復(fù)方丹參滴丸的無細胞毒性濃度和保護作用濃度測定：復(fù)方丹參滴丸無細胞毒性濃度測定實驗設(shè)置對照組和不同質(zhì)量濃度（2000、1000、500、250、125 μg/mL）的復(fù)方丹參滴丸組。復(fù)方丹參滴丸保護作用濃度篩選實驗設(shè)置對照組、模型組（按“2.2.2”項下方法處理）和不同質(zhì)量濃度（500、250、125 μg/mL）的復(fù)方丹參滴丸組（在缺氧缺糖時分別加入含不同濃度復(fù)方丹參滴丸的Earle’s平衡鹽溶液）。

（2）復(fù)方丹參滴丸調(diào)控LOX-NF-κB炎癥途徑的機制研究：設(shè)置對照組、模型組、復(fù)方丹參滴丸（500 μg/mL）組、LOX5抑制劑Zileuton（50 μmol/L）組、LOX12抑制劑黃芩素（1 μmol/L）組和LOX15抑制劑PD146176（1 μmol/L）組。各給藥組均在造模的同時給藥。

2.2.4 MTT測定細胞活力 取生長狀態(tài)良好的H9c2細胞，經(jīng)計數(shù)后稀釋為1×105個/mL，每孔100 μL接種到96孔板上，培養(yǎng)24 h，細胞生長至約80%時按“2.2.3（1）”項下進行分組給藥，處理24 h，倒扣法倒出原有培養(yǎng)基，每孔加100 μL PBS洗滌2遍后，每孔加入100 μL以PBS配制的0.5 g/mL的MTT，放于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去MTT溶液，每孔加150 μL DMSO溶解結(jié)晶，置于微量振蕩器待結(jié)晶完全溶解后，于酶標(biāo)儀570 nm處檢測吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝實驗/對照

2.2.5 熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài) 取生長狀態(tài)良好的H9c2細胞，經(jīng)計數(shù)后稀釋至2.5×105個/mL，接種于6孔板中，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h后按“2.2.3（2）”項下進行分組給藥，分別于給藥前、缺氧缺糖6 h時，于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并拍照記錄。

2.2.6 Western blotting檢測H9c2細胞相關(guān)蛋白表達 取生長狀態(tài)良好的H9c2細胞，經(jīng)計數(shù)后稀釋至2.5×105個/mL，接種于6孔板中，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h后按“2.2.3（2）”項下進行分組給藥，缺氧缺糖6 h后，棄上清，用預(yù)冷的PBS清洗2遍后，每孔加入100 μL預(yù)冷的RIPA裂解液裂解30 min，期間反復(fù)吹打細胞使其充分裂解，全程冰上操作。收集裂解液，4 ℃、20 000×離心20 min后收集上清。按“2.1.3”項下方法進行蛋白定量、樣品制備、Western blotting檢測以及灰度分析。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心電圖及心臟形態(tài)比較

術(shù)后5 d心電圖（圖1）結(jié)果顯示，假手術(shù)組P波規(guī)律出現(xiàn)，P-R間期及R-R間期大致相同，QRS波波形規(guī)律，無寬大畸形，S-T段未見明顯壓低及抬高。模型組ST段明顯抬高，呈“弓背向上”型，為心肌梗死特異性指標(biāo)，且QRS波抬高、增寬。復(fù)方丹參滴丸組提示竇性心率，P波規(guī)律出現(xiàn)，P-R間期及R-R間期大致相同，QRS波波形規(guī)律，無寬大畸形，與模型組比較，S-T段抬高緩解。卡維地洛組心電圖提示竇性心率，P波規(guī)律出現(xiàn)，P-R間期及R-R間期大致相同，QRS波波形規(guī)律，無寬大畸形，與模型組比較，S-T段抬高緩解。提示復(fù)方丹參滴丸在缺血的急性期已開始具有很好的心肌保護作用。術(shù)后14 d恢復(fù)期各組大鼠心臟取材后通過對損傷情況進行比較，發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸組和卡維地洛組大鼠心肌缺血損傷區(qū)域小于模型組，提示給藥組可在一定程度上減輕心肌缺血損傷。

圖1 各組大鼠心電圖及心臟形態(tài)

3.2 復(fù)方丹參滴丸對心肌缺血大鼠心肌組織相關(guān)蛋白表達的影響

如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中LOX途徑關(guān)鍵酶LOX5、LOX12和LOX15的蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01、0.001），提示LOX途徑激活，炎癥反應(yīng)增強；與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸顯著降低LOX5、LOX12、LOX15和IL-1β的蛋白表達及NF-κB p65的磷酸化水平（＜0.01、0.001），表明復(fù)方丹參滴丸通過抑制LOX途徑關(guān)鍵酶的蛋白表達繼而降低NF-κB p65的磷酸化水平和IL-1β的表達，從而抑制心肌組織炎癥反應(yīng)，進而發(fā)揮抗心肌缺血作用。

3.3 H9c2細胞OGD模型的建立

為建立適宜的模型進行機制驗證實驗，對細胞的缺氧缺糖時間進行考察。將H9c2細胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，分別缺氧缺糖培養(yǎng)4、6、8 h，觀察造模效果，如圖3所示，當(dāng)缺氧缺糖6 h時，細胞活力在50%左右，此時觀察藥物的保護作用較為合適，故將其作為模型的缺氧缺糖時間。

3.4 復(fù)方丹參滴丸對正常H9c2細胞活力的影響

當(dāng)藥物濃度過高時，會具有細胞毒性。為了探討復(fù)方丹參滴丸的藥理作用，首先篩選了復(fù)方丹參滴丸的無細胞毒性濃度。如圖4所示，與對照組比較，復(fù)方丹參滴丸質(zhì)量濃度為2000 μg/mL時對H9c2細胞活力表現(xiàn)出明顯抑制作用（＜0.05），因此選擇125、250、500、1000 μg/mL 4個質(zhì)量濃度考察復(fù)方丹參滴丸對H9c2細胞OGD模型的保護作用。

與假手術(shù)組比較：##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

與缺氧缺糖0 h比較：***P＜0.001

與對照組比較：*P＜0.05

3.5 復(fù)方丹參滴丸對OGD誘導(dǎo)的H9c2細胞活力的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組細胞活力顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸在500、1000 μg/mL時均對心肌細胞活力表現(xiàn)顯著保護作用（＜0.01、0.001），其中復(fù)方丹參滴丸在500 μg/mL時對細胞活力的影響最大，因此選擇500 μg/mL的復(fù)方丹參滴丸作為后續(xù)探究其機制的質(zhì)量濃度。

與對照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，圖7同

3.6 復(fù)方丹參滴丸保護OGD模型各時段H9c2細胞形態(tài)

在熒光倒置顯微鏡下觀察OGD模型各時段H9c2細胞形態(tài)，如圖6所示，給藥前，各組細胞貼壁狀態(tài)良好，大部分呈長梭形，細胞邊緣結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)透亮。對照組細胞在各時段細胞形態(tài)規(guī)則，增長速度正常。模型組細胞在缺氧缺糖6 h后貼壁不牢，細胞皺縮，形態(tài)變得不規(guī)則，漂浮細胞增多，細胞數(shù)量顯著減少。復(fù)方丹參滴丸組細胞貼壁數(shù)量增加，細胞皺縮變形的現(xiàn)象得到改善。

圖6 復(fù)方丹參滴丸對H9c2心肌細胞形態(tài)的保護作用 (×100)

3.7 復(fù)方丹參滴丸對OGD誘導(dǎo)的H9c2細胞相關(guān)蛋白表達的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組LOX途徑關(guān)鍵酶LOX5、LOX12和LOX15的蛋白表達水平均顯著升高（＜0.001），提示LOX途徑激活，炎癥反應(yīng)增強；與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸組LOX5、LOX12、LOX15和IL-1β蛋白表達及NF-κB p65的磷酸化水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），與LOX5抑制劑Zileuton、LOX12抑制劑黃芩素、LOX15抑制劑PD146176作用相似（＜0.01、0.001）。表明復(fù)方丹參滴丸通過抑制LOX途徑的激活繼而降低NF-κB p65磷酸化水平和IL-1β表達，從而抑制心肌細胞炎癥反應(yīng)，減少細胞丟失，發(fā)揮對OGD心肌細胞損傷模型的保護作用

圖7 復(fù)方丹參滴丸對OGD誘導(dǎo)的H9c2細胞LOX-NF-κB途徑相關(guān)蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

心肌缺血損傷會引起心肌細胞強烈的炎癥風(fēng)暴、凋亡、氧化應(yīng)激等病理過程，最終導(dǎo)致心力衰竭。LOX途徑關(guān)鍵酶對心肌缺血時炎癥反應(yīng)的調(diào)控具有重要作用[29-30]。研究表明，LOX15在冠心病患者心肌組織中的表達顯著增加[31]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌缺血再灌注模型中LOX5蛋白表達量顯著上調(diào)，該信號通路被顯著激活[32]，且LOX5抑制劑可通過減少NF-κB表達、抑制心肌細胞炎癥和凋亡從而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[33]。心肌缺血導(dǎo)致細胞中的LOX途徑被激活，該途徑產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如羥基二十碳四烯酸、白三烯等表現(xiàn)出多種生物活性，如增加血管通透性、促進血漿滲出以及使白細胞遷移到炎癥區(qū)域等[33-34]，這些代謝產(chǎn)物促進了炎癥的發(fā)生發(fā)展[35]，如白三烯可促進NF-κB的激活，而NF-κB是誘導(dǎo)炎性細胞因子表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，激活的NF-κB會誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)增強并促進炎癥因子釋放，因此，抑制LOX-NF-κB炎癥途徑的激活，對于減輕心肌細胞的炎癥反應(yīng)、改善心肌缺血損傷具有重要意義。

本研究首先采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)構(gòu)建了大鼠心肌缺血模型，在給藥的第5天對大鼠行心電圖檢測，發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸在缺血的急性期已開始具有很好的心肌保護作用。在缺血恢復(fù)期給藥后的第14天進行心臟取材，通過心臟組織損傷情況比較，發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸可在一定程度上減輕心肌缺血損傷。繼而，對心肌組織LOX5、LOX12、LOX15和IL-1β的蛋白表達及NF-κB p65的磷酸化水平進行定量檢測，結(jié)果顯示模型組大鼠心肌組織中上述蛋白表達水平均顯著升高，表明LOX-NF-κB介導(dǎo)的炎癥途徑在大鼠心肌缺血模型中被高度激活。復(fù)方丹參滴丸干預(yù)后可顯著降低上述蛋白的表達水平，減小大鼠心肌組織梗死面積，減輕心臟炎癥反應(yīng)，改善心肌缺血現(xiàn)象。隨后構(gòu)建H9c2心肌細胞氧糖剝奪模型，體外模擬心肌缺血的病理狀態(tài)，從LOX-NF-κB炎癥途徑探究復(fù)方丹參滴丸抗心肌缺血損傷的具體分子機制，結(jié)果同樣顯示，復(fù)方丹參滴丸給藥后LOX途徑關(guān)鍵酶LOX5、LOX12、LOX15表達水平顯著降低，其下游蛋白NF-κB p65的磷酸化水平和IL-1β的表達水平也顯著降低。由此表明復(fù)方丹參滴丸可通過抑制LOX途徑3個關(guān)鍵酶的表達水平，繼而降低了NF-κB p65的磷酸化水平，抑制炎癥因子IL-1β的釋放（圖8），從而減輕炎癥反應(yīng)和心肌細胞損傷，明顯改善OGD損傷后心肌細胞的形態(tài)，顯著緩解心肌細胞OGD損傷。

圖8 復(fù)方丹參滴丸對心肌缺血時LOX-NF-κB炎癥途徑及其下游分子的抑制作用

復(fù)方丹參滴丸是利用現(xiàn)代制劑工藝研制的一種中藥滴丸復(fù)方制劑，具有多效應(yīng)成分溶解快、易吸收、純度高且便于服用等優(yōu)點，在心肌缺血等心血管疾病的治療中也發(fā)揮了重要作用[36-38]。丹參酮IIA作為丹參的有效成分，可減少脂多糖刺激的RAW264.7巨噬細胞中促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，其機制可能為通過抑制RAW264.7細胞中的NF-κB活化以發(fā)揮抗炎活性[39]；另有研究表明，三七的主要化學(xué)成分人參皂苷Rg1能下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥細胞因子的表達，減少Toll樣受體4和NF-κB的表達，減輕脂多糖誘導(dǎo)的心肌細胞炎癥反應(yīng)和凋亡[40]。更多復(fù)方丹參滴丸抑制炎癥反應(yīng)減輕心肌缺血的效應(yīng)成分需要被進一步揭示，在動物整體水平以及細胞分子水平上進行確切驗證。

本研究基于體內(nèi)外實驗證實了復(fù)方丹參滴丸具有類似LOX抑制劑的作用，通過抑制LOX途徑關(guān)鍵酶的激活，從而調(diào)節(jié)LOX-NF-κB炎癥途徑緩解心肌缺血損傷。為復(fù)方丹參滴丸靶向調(diào)控心肌缺血的分子機制闡明提供了科學(xué)依據(jù)，提示抑制炎癥因子釋放可能是預(yù)防和治療心血管疾病的潛在策略，同時為心肌缺血引發(fā)的心血管疾病的防治提供干預(yù)機制和治療思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Compound Danshen Dripping Pills against myocardial ischemia based on LOX-NF-κB pathway

CAO Bo-ya1, CHEN Jia-li2, SHI Xiao-xi3, LI Dong-yue2, LU Ling-hui2, GAO Kuo2, WANG Wei4, CAO Jun-ling1, 5, ZHANG Jian6

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3. Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 4. School of Basic Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510700, China 5. Dongfang Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 6. School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

To explore the mechanism of Compound Danshen Dripping Pills (復(fù)方丹參滴丸) on treatment of myocardial ischemia by regulating lipoxygenase (LOX)-nuclear factor-κB (NF-κB) pathway to inhibit inflammatory response based on animal models of myocardial ischemia andmyocardial cell injury model.The rat model of myocardial ischemia was established by ligation of left anterior descending coronary artery, with myocardial ischemia detected by ECG; Protein expressions of LOX5, LOX12, LOX15, p-NF-κB p65 and interleukin-1β (IL-1β) were detected by Western blotting. H9c2 cardiomyocytes were cultured, and the model of myocardial cell injury was induced by deprivation of oxygen-glucose (OGD) for 6 h, morphology of myocardial cells was observed under fluorescence inverted microscope; Cell viability was detected by MTT; Western blotting was used to detect LOX-NF-κB pathway related protein expressions.Compound Danshen Dripping Pills significantly inhibited the protein expression levels of LOX5, LOX12, LOX15, p-NF-κB p65 and IL-1β in myocardial tissues of rats with ischemia (< 0.01, 0.001). Thecell experiments indicated that Compound Danshen Dripping Pills could dramatically improve the OGD injury of H9c2 myocardial cells, significantly increase the survival rate of myocardial cells (< 0.01, 0.001), and reduce LOX5, LOX12, LOX15 and IL-1β protein expressions and NF-κB p65 phosphorylation level (< 0.05, 0.01, 0.001).Compound Danshen Dripping Pills can alleviate myocardial ischemia injury by inhibiting LOX-NF-κB inflammatory pathway.

Compound Danshen Dripping Pills; myocardial ischemia; inflammation; lipoxygenase; nuclear factor-κB

R285.5

A

0253 - 2670(2023)01- 0151 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.018

2022-09-20

國家自然科學(xué)基金資助項目（82004095）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81903950）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81904169）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項（2021-JYB-XJSJJ031，2019-JYB-JS-095，2022-JYB-XJSJJ008）

曹博雅，碩士研究生，研究方向為心血管藥理學(xué)。E-mail: bucmcby@163.com

通信作者：張 建，講師，研究方向為中醫(yī)藥防治心血管疾病的基礎(chǔ)研究。E-mail: zhangjian3428@126.com

曹俊嶺，主任藥師，博士生導(dǎo)師，研究方向為藥理學(xué)、醫(yī)院藥學(xué)。E-mail: caojunling72@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]